知母抗老年癡呆有效部位篩選及作用機(jī)制研究＊

羅 潔，黃永亮，鄭 繪，魏京霞，涂 勤＊＊

（1. 成都市第六人民醫(yī)院藥劑科 成都 610051；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部 成都 610072）

老年癡呆即阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD），是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，在認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶、執(zhí)行功能等方面都存在著很大障礙[1]。目前，老年癡呆是影響全球的公共健康問題，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給患者、患者家庭和社會(huì)帶來巨大負(fù)擔(dān)。但至今沒有發(fā)現(xiàn)一種可以徹底根治AD 的藥物。目前用于治療AD 的藥物主要有膽堿酯酶抑制劑、抗氧化藥物、神經(jīng)營養(yǎng)藥物及免疫治療藥物等[2]。研究表明AD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床常用治療AD 的藥物均屬于單靶向藥物，只能改善或緩解患者的癥狀，并不能延緩或阻止疾病的進(jìn)程，因此迫切需要開發(fā)既能改善又能緩解疾病進(jìn)程的藥物。中藥因其化學(xué)成分復(fù)雜多樣，臨床治療作用是多靶點(diǎn)、多成分結(jié)合的效果，因此，人們把研究方向轉(zhuǎn)移到中藥上，包括當(dāng)歸、人參、遠(yuǎn)志、黃芪、文冠果、知母等[3-4]。

知母為百合科植物知母（Anemarrhenae asphodeloidesBge.）的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效，用于外感熱病，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內(nèi)熱消渴，腸燥便秘[5]。知母的化學(xué)成分主要有甾體皂苷、雙苯吡酮類、黃酮類、木脂素類、多糖類、有機(jī)酸類及微量元素等，而皂苷類是其主要成分之一，約占知母根莖的6%[6]。有研究表明，知母乙醇提取物能預(yù)防和改善阿爾茨海默病模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶減退[7]，知母皂苷 BⅡ(Timosaponin B-Ⅱ，TB-Ⅱ)對自然衰老大鼠具有改善學(xué)習(xí)記憶能力和保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元的作用[8]，菝葜皂苷元能顯著改善多種動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶功能，是一種新型的能顯著改善學(xué)習(xí)記憶功能的藥物[9]。作者前期研究了知母的指紋圖譜和相關(guān)成分的含量測定，發(fā)現(xiàn)知母化學(xué)成分復(fù)雜多樣[10-11]，其臨床治療作用也應(yīng)是多成分、多靶點(diǎn)的結(jié)合的效果，所以，本實(shí)驗(yàn)從知母提取液的不同極性部位出發(fā)，尋找知母抗老年癡呆的有效部位。進(jìn)一步研究知母乙醇提取物及其不同極性部位對東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力獲得性障礙的改善作用，并結(jié)合自由基學(xué)說和膽堿能學(xué)說，探討知母抗老年癡呆的作用機(jī)制，初步確定了知母抗老年癡呆的有效部位。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康雄性昆明種小鼠，體重18-22 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK2010-0001。

1.2 藥材、藥品與試劑

知母（四川省新荷花中藥飲片有限公司）經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張廷模教授鑒定為正品；吡拉西坦片（東北制藥集團(tuán)有限公司，批號180623）；氫溴酸東莨菪堿注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號180403）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶（AchE）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；95%乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇均為國產(chǎn)分析純試劑，乙腈（色譜純）；水（娃哈哈純凈水）。知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅡ均為實(shí)驗(yàn)室自制（經(jīng)核磁和質(zhì)譜鑒定，采用峰面積歸一化法計(jì)算含量，純度≥98%）。

1.3 儀器

RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化器械廠）；Morris 水迷宮（北京碩林苑科技有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）；BP210S 電子天平（德國Sartorius公司），AB135-S十萬分之一天平（METTLER TOLEDO儀器有限公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Alltech ELSD 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器（美國Alltech 公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備

2.1.1 灌胃藥液的制備

知母飲片1 kg，用75%乙醇加熱回流提取3 次，濃縮至無醇味，取一部分作為總提取物灌胃，再分別萃取得到石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層浸膏[12]。各組分別加蒸餾水配制成1 g·mL-1（按生藥計(jì)算）供試液準(zhǔn)備灌胃。

2.1.2 供試液的制備

取知母正丁醇層組份1.0 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取4 種知母皂苷對照品適量，乙腈溶解，作為對照品儲(chǔ)備液。精密量取各儲(chǔ)備液適量，置于同一10 ml 量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 分組、給藥與造模

將96 只小鼠隨機(jī)分為8 組：石油醚層組，乙酸乙酯層組，正丁醇層組，水層組，總提物組，吡拉西坦組（500 mg·kg-1），模型組，空白組。各組均按20 mL·kg-1灌胃給藥，空白組與模型組灌胃等量蒸餾水，其余各組灌胃相應(yīng)的供試液，每天1 次，連續(xù)21 天。第16 天開始在完成上述給藥30 min 后，除空白組外各組小鼠腹腔注射氫溴酸東莨菪堿注射液（1 mg·kg-1）以制備學(xué)習(xí)記憶障礙模型，空白組小鼠注射等體積的0.9 %氯化鈉注射液。注射后30 min進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris 水迷宮為一內(nèi)壁被漆成黑色的圓形水池，直徑70 cm，高40 cm，水深20 cm，水溫（22±1）℃，池壁等分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ個(gè)象限。在第Ⅰ象限（目標(biāo)象限）中放入一個(gè)直徑為7 cm 的黑色圓形平臺(tái)，平臺(tái)頂?shù)陀谒? cm，水中加入墨汁，迷宮四周存在豐富的參照線索，以供動(dòng)物定位平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)期間迷宮外的參照物保持不變[13]。實(shí)驗(yàn)前5 天進(jìn)行定位航行試驗(yàn)，將小鼠面對池壁，分別從Ⅱ、Ⅲ象限的入水測試，每只小鼠每天連續(xù)訓(xùn)練2 次，時(shí)限設(shè)置為每次120 s，平臺(tái)停留時(shí)間20 s，記錄各組小鼠的潛伏期（從入水到搜索到安全平臺(tái)的時(shí)間），未搜索到平臺(tái)的小鼠將其放置于平臺(tái)20 s，潛伏期記為120 s。實(shí)驗(yàn)d 6 為空間探索試驗(yàn)，撤去平臺(tái)，將小鼠從第Ⅰ象限的對側(cè)入水測試一次，持續(xù)60 s，記錄小鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比和穿臺(tái)次數(shù)。

2.4 樣品處理及檢測

Morris 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，立即眼眶取血，冰上取腦并分離海馬和皮質(zhì)，預(yù)冷生理鹽水沖洗表面血液，濾紙擦干。用玻璃勻漿器加預(yù)冷生理鹽水研磨制成10% 的組織勻漿，3 500 r·min-1低溫離心 10 min，取上清。血液經(jīng)3 500 r·min-1離心，取血清[14]。按試劑盒操作說明分別對血清中的SOD，MDA；皮質(zhì)和海馬中的AChE含量進(jìn)行測定。

2.5 色譜條件

Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（21：79V/V），流速為1.0 ml·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，ELSD檢測器漂移管溫度：95℃；氮?dú)饬魉伲?.5 L·min-1。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)測試

3.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

在定位航行實(shí)驗(yàn)過程中，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長，各組小鼠的逃避潛伏期都有下降的趨勢，并且從第1天開始，與空白組比較，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型建立成功。與模型組比較，正丁醇組從實(shí)驗(yàn)d 2 天開始逃避潛伏期顯著縮短，總提物組從實(shí)驗(yàn)d 4 天開始逃避潛伏期顯著縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），結(jié)果見表1。

3.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，模型組小鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間的百分比顯著減少，穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P<0.01，P<0.05）。與模型組比較，正丁醇組在目標(biāo)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間的百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），總提物組也能增加小鼠在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)的次數(shù)。結(jié)果見表2。

表1 各組小鼠在定位航行各時(shí)段的平均潛伏期（，n=12）

表1 各組小鼠在定位航行各時(shí)段的平均潛伏期（，n=12）

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，※P<0.05，※※P<0.01。

d5 46.79±28.57△△42.85±22.58△25.60±19.21※※47.72±41.49△△31.67±24.46※38.84±36.10△56.2±28.22△△16.01±15.89※※組別石油醚組乙酸乙酯組正丁醇組水層組總提物組吡拉西坦組模型組空白組d1 104.91±37.65△△76.58±36.40△80.98±29.15△74.18±42.60 91.04±38.58△98.33±33.40△△86.80±40.50△△51.08±27.86※※d2 76.18±39.45△△42.74±30.96※※41.2±28.32※※45.79±26.93※※67.07±43.91△57.98±37.52※89.62±37.97△△34.37±27.13※※d3 49.86±34.32 38.11±25.16※37.09±20.07※※54.15±37.98△47.21±26.86 58.72±34.01△△70.62±42.42△△25.41±31.36※※d4 41.57±38.05 39.85±24.91 29.14±23.35※※58.71±38.00△35.94±22.73※59.59±45.10△64.14±41.35△△30.01±18.05※※

表2 各組小鼠的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（，n=12）

表2 各組小鼠的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（，n=12）

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，※P<0.05，※※P<0.01。

穿越平臺(tái)次數(shù)1.69±1.80△2.46±1.30 3±2.26※2.23±1.51 2.76±2※2.46±1.61 1.46±1.62△3.07±1.50※組別石油醚組乙酸乙酯組正丁醇組水層組總提物組吡拉西坦組模型組空白組目標(biāo)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間的百分比/%18.89±9.70△△24.98±6.21△△※34.23±9.97※※24.11±9.01△△29.90±7.01※※31.42±13.10△△17.37±10.53△△35.43±7.02※※

3.2 對小鼠血清SOD活性、MDA含量的影響

檢測結(jié)果顯示（見表3），與空白組比較，模型組小鼠SOD 活性降低和MDA 含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，正丁醇組SOD 活性升高和MDA 含量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），總提物組也有改善，但正丁醇組效果要優(yōu)于總提物組。

3.3 對小鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)AChE活力的影響

檢測結(jié)果顯示（見表4），與空白組比較，模型組小鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的AChE 活性顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.01）。與模型組比較，正丁醇組小鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的AChE 活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。總提物組小鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的AChE 活性也有所降低但效果不及正丁醇組。

表3 知母提取物對癡呆小鼠血清SOD、MDA的影響（，n=10）

表3 知母提取物對癡呆小鼠血清SOD、MDA的影響（，n=10）

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，※P<0.05，※※P<0.01。

MDA(nmol/ml)4.682±0.985※※6.318±1.218※※△10.05±1.009△△3.318±0.985※※組別正丁醇組總提物組模型組空白組SOD(U/ml)312.222±65.81△※266.212±55.998△△232.721±51.177△△368.563±124.870 ※※

表4 知母提取物對癡呆小鼠皮質(zhì)和海馬乙酰膽堿酯酶活力的影響（，n=10）

表4 知母提取物對癡呆小鼠皮質(zhì)和海馬乙酰膽堿酯酶活力的影響（，n=10）

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，※P<0.05，※※P<0.01。

海馬7.653±0.859※※8.687±1.364※※△△12.94±0.831△△5.007±1.02※※組別正丁醇組總提物組模型組空白組AChE 活性（U/mgprot）皮質(zhì)3.793±0.621※4.675±1.424△△5.483±1.223△△2.620±0.324※※

3.4 正丁醇層的主要化合物

分別吸取混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.5”項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明，在上述色譜條件下，知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅡ，4 種成分分離良好，可見知母正丁醇層主要包含皂苷類成分，見圖1。

4 討論

東莨菪堿致癡呆模型小鼠是基于“膽堿能功能缺損”病因假說所建立起來的[15]。作為一種非選擇性M 受體阻斷劑，東莨菪堿可以拮抗乙酰膽堿與M受體的結(jié)合，阻斷大腦信息的傳遞，干擾短期記憶能力，從而導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[16]。東莨菪堿制備的癡呆模型被廣泛應(yīng)用于初步篩選促智藥物和防治阿爾茨海默病的藥物，是一種常用、快速、簡單的藥物篩選模型。本實(shí)驗(yàn)給予小鼠腹腔注射氫溴酸東莨菪堿注射液（1 mg·kg-1），可造成獲得性學(xué)習(xí)記憶障礙，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]。

圖1 對照品混合溶液（A）和知母正丁醇層（B）的HPLC-ELSD色譜圖

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種經(jīng)典的，應(yīng)用于多種AD動(dòng)物模型認(rèn)知功能檢測的有效實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)原理易懂，操作簡便，數(shù)據(jù)誤差較小，可提供較多的評價(jià)參數(shù)，比如逃避潛伏期，逃避潛伏路程，各象限停留時(shí)間等，更加全面系統(tǒng)地反映動(dòng)物模型空間學(xué)習(xí)記憶能力。本實(shí)驗(yàn)通過Morris 水迷宮測定小鼠的定位航行和空間探索能力，觀察小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶的獲取能力和儲(chǔ)存能力。結(jié)合特定的迷宮系統(tǒng)及攝像系統(tǒng)和專用的統(tǒng)計(jì)軟件，使學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)研究的觀測指標(biāo)較多而全面，同時(shí)測定精度好，在此基礎(chǔ)上研究知母提取物對小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響有一定的意義。

SOD 為自由基清除過程的重要酶，主要作用是參與催化產(chǎn)生超氧自由基，清除并阻斷自由基的產(chǎn)生。MDA 是氧自由基破壞細(xì)胞后的產(chǎn)物，它的存在可以使生物膜壞死，同時(shí)抑制SOD 的活性，造成自由基的大量產(chǎn)生。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，老年癡呆病人腦內(nèi)氧化程度較高，氧自由基的存在可以引起腦細(xì)胞損傷，可能是引起AD 發(fā)病的原因之一。SOD 是一種金屬酶，它是體內(nèi)非常重要的自由基清除劑。因此SOD 可以直接反應(yīng)機(jī)體的抗氧化能力[18]。體內(nèi)自由基與細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化物，MDA 是脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物，比較穩(wěn)定，其含量高低可反應(yīng)脂質(zhì)過氧化水平，在一定水平上反應(yīng)細(xì)胞損傷的程度[19]。因此檢測模型小鼠體內(nèi)SOD、MDA 的含量對探討知母有效部位抗老年癡呆的作用機(jī)制具有重要意義。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，腦皮質(zhì)和海馬的結(jié)構(gòu)和功能改變與衰老和記憶密切有關(guān)[20]。中樞膽堿能遞質(zhì)在學(xué)習(xí)與記憶行為中有重要的調(diào)節(jié)作用，與AD 關(guān)系最密切的神經(jīng)遞質(zhì)是乙酰膽堿（Acetylcholine,ACh），AChE能水解ACh 生成膽堿和乙酸。人體缺少ACh 則會(huì)加速腦細(xì)胞的衰老，使記憶力顯著下降，甚至導(dǎo)致老年癡呆。AChE 是ACh 的特異膽堿酯酶，其活力變化可以間接反映ACh 的代謝狀況。所以檢測腦皮質(zhì)和海馬區(qū)AChE活性具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)對小鼠進(jìn)行預(yù)防性給藥16天后，給予腹腔注射氫溴酸東莨菪堿進(jìn)行造模，連續(xù)6 d，造成學(xué)習(xí)記憶功能受損。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明知母正丁醇部位能夠明顯改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并能提高血清中SOD 活性，降低MDA 含量，降低前額皮質(zhì)和海馬區(qū)AChE 活性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，知母正丁醇部位抗老年癡呆的作用可能與其抗氧化作用和抑制膽堿酯酶活性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究知母皂苷單體成分治療AD提供了依據(jù)。