柔肝化纖顆粒促進BMSC向肝臟歸巢及其機制研究＊

吳姍姍，黎 妍，王振常，呂艷杭

（1. 廣西中醫(yī)藥大學研究生學院 南寧 530222；2. 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病科 南寧 530201）

肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是由各種損肝因素所致的肝臟內(nèi)結締組織異常增生的病理過程，細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）彌漫性沉積過多而降解減少及肝竇毛細血管化是其主要的病理特征，是各種慢性肝病向肝硬化甚至肝癌轉化的必經(jīng)途徑[1]。在我國，乙型肝炎病毒（HBV）的持續(xù)感染是造成肝纖維化以及終末肝硬化的主要原因[2]。我國八桂大地屬乙型肝炎高流行區(qū)：乙肝感染陽性率高達10%，近16年來流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)乙肝的發(fā)病率呈明顯的逐年增高趨勢[3]。

目前，治療肝纖維化的藥物十分匱乏，針對肝纖維化的治療缺乏特異性靶向藥物?，F(xiàn)有如皮質類固醇激素、秋水仙堿、水飛薊素、干擾素等藥物效果單一，且療效與預后均不理想。近年來，間充質干細胞（Marrow stem cells，MSCs）移植無疑是肝硬化患者的希冀。MSCs 屬于基質干細胞異質亞群，可從骨髓、脂肪組織、胎盤、臍帶血等不同組織中獲取，來源充沛。間充質干細胞在骨髓中含量最為豐富，同時也最容易獲得，而臨床上，骨髓穿刺是一種簡單、常規(guī)、安全的技術。國內(nèi)外眾多研究表明，即使經(jīng)過經(jīng)多次傳代，間充質干細胞仍具有穩(wěn)定的生物學特性，并且具有低免疫原性，如來源于患者自身，免疫相容，無排異反應[4]。所以BMSCs 是干細胞移植治療的理想的候選細胞，更是組織工程技術中自體組織細胞的首選。然而，BMSCs 作為種子細胞發(fā)揮其強大的修復功能的關鍵是歸巢到組織的損傷部分[5]。

國際上對干細胞的研究多著眼于移植和克隆，而通過藥物激活內(nèi)源性的干細胞從而改善再生反應與從外部植入干細胞是全然不同的新思路，在移植干細胞數(shù)量不夠替代肝功能且內(nèi)源性干細胞自身遭到破壞、修復能力有限的情況下，采用內(nèi)源性干細胞動員方案可以促進MSCs 等體內(nèi)干細胞歸巢肝臟分化為肝細胞及殘留肝細胞群擴展至足夠的數(shù)量和質量，充分發(fā)揮中醫(yī)藥在維持或促進機體的正常再生修復的作用，且更關注如何利用中醫(yī)藥調(diào)控再生修復機制，減少對細胞數(shù)量的需求及無需培養(yǎng)擴增的繁瑣操作，為干細胞動員提供新的思路。

肝干細胞在不同狀態(tài)下分化能力的良莠不齊使研究者面臨另一個重要的問題，未來的研究需要證實干細胞衍生的人肝細胞樣細胞（HLCs）在患者體內(nèi)是否與內(nèi)源性肝細胞具有同等功能。目前，中藥成分誘導干細胞分化為肝細胞的報道很少，特別是對于細胞再生過程中干細胞的時空分布、分化過程及分化結果的影響尚未見報道。本研究采用先進的實驗研究技術系統(tǒng)從促BMSCs 富集、歸巢、分化、功能表達等方面調(diào)控肝臟再生，深入探討中藥聯(lián)合BMSCs 移植治療肝纖維化/肝硬化的協(xié)同增效的作用，用現(xiàn)代語言客觀闡述名老中醫(yī)學術理論，是本課題研究的必要性、目的、意義以及創(chuàng)新性。

中藥可以通過提高移植干細胞的存活和增殖能力、誘導其向肝細胞定向分化、改善移植后的病理環(huán)境等參與干細胞移植治療肝硬化，展現(xiàn)了其獨特的價值，且與其他誘導方法相比，具有安全、易于在臨床推廣使用等特點。柔肝化纖顆粒是廣西名中醫(yī)王振常結合自身26 年肝病臨床經(jīng)驗與全國名老中醫(yī)林沛湘的“壯肝逐瘀煎”內(nèi)涵及關幼波教授治療肝炎肝硬化有效驗方基礎上組方而成的。本課題的前期研究顯示，柔肝化纖顆粒含藥血清條件培養(yǎng)液可誘導BMSCs 向肝樣分化，但其具體作用機制尚不明確[6]。本研究擬通過動物模型實驗及體外細胞培養(yǎng)實驗，研究柔肝化纖顆粒促進大鼠BMSC 歸巢的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞分離及培養(yǎng)

取5周齡雄性SD 大鼠，頸椎脫臼處死。取股骨脛骨，保留骨骺，無菌處理后轉移至超凈工作臺內(nèi)，無菌血管鉗夾碎兩端骨骺，用吸滿PBS 的注射器把骨髓腔內(nèi)的骨髓沖洗出來，收集到離心管內(nèi)。將采集到的骨髓用密度為1.073 g·mL-1的Percoll分離液按照3∶2的比例緩慢滴加進行分離，依照3000 r·min-1，離心30 min，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸，接種于細胞培養(yǎng)器皿中，在條件為37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h 后更換培養(yǎng)液，此后每3 天換液一次，待細胞匯合度至70%時傳代。使用Lipofectamine?2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668019），轉染p-EGFP-N1 質粒，轉染后48 h 開始進行藥物篩選，篩選兩周后獲得穩(wěn)定轉染細胞株，常規(guī)培養(yǎng)。

含藥血清制備：選取40只SD 大鼠，使用中藥柔肝化纖顆粒（組方：生黃芪45 g，生牡蠣30 g，黃精20 g 枸杞20 g，薏苡仁45 g，橘紅10 g，澤蘭30 g，雞內(nèi)金15 g，鱉甲30 g，虎杖20 g，丹皮12 g，大棗15 g）藥物配成中藥免煎顆粒，由廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院藥房配制（浙江江陰天藥業(yè)有限公司，規(guī)格：每1 g 配方顆粒相當于飲片6 g），按1.1 g/kg的量灌胃，1次/d，干預15天后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒后暴露頸部動脈，頸動脈插管取血，分管盛裝，分組放置。血清過濾除菌后在4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。細胞實驗分為：對照組，柔肝化纖含藥血清（低、中、高濃度）組，經(jīng)含藥血清干預48 h后，收集用于后續(xù)實驗。

1.2 纖維化模型構建及干預

取健康SPF 級雄性Wistar 大鼠24 只，體質量100-120 g，采用CCL4復合因素肝硬化造模方法進行造模，大鼠隨機分為纖維化模型+干細胞注射組和纖維化模型+干細胞注射+柔肝化纖灌胃組，每組12只。由于肝臟具有強大的自然修復能力，為避免肝臟自然修復對實驗結果產(chǎn)生的誤差，于用藥開始后仍每周注射40%CCL4 油劑3 ml·kg-（1體質量）一次。造模8 周后各組分別予以干細胞尾靜脈注射或干細胞尾靜脈注射+柔肝化纖顆粒灌胃，

1.3 qPCR檢測

RNA 提取及逆轉錄PCR：將30 mg 肝臟組織置于1000 μL Trizol 裂解液（Solarbio，R1100）中，充分裂解混勻后，加入500 μL 的氯仿，4℃，12000 g 離心15 min后取 400 μL 上層水相，加入 400 μL 異丙醇后，4℃，12 000 g 離心10 min 獲得RNA 沉淀，經(jīng)70%酒精洗滌后，晾干，使用無RNA酶水進行溶解，使用超微量核酸檢測儀（Suizhen，F(xiàn)C-1100）進行 RNA 濃度及純度檢測，后按照逆轉錄試劑盒（Monad，RN05004M）說明書進行逆轉錄操作，所得cDNA 置于-20℃保存待用。（見表1）

qPCR 反應體系為：SYBR Green Premix Taq（Monad，RN04006M）:5 μL，cDNA：1 μL，Primer Forward（10 μM）：0.3 μL，Primer Reverse（10 μM）：0.3 μL，H2O：3.4 μL，反應程序：預處理 95℃：30 s；PCR 循環(huán)（40 循環(huán)）：95℃：5 s，60℃：30 s，72℃：15 s；溶解曲線：標準溶解曲線程序。實驗儀器為ABI 7500 定量PCR儀（ABI 7500）。經(jīng)實驗獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件進行整理及分析，采用2-ΔΔCT 法進行分析，公式為：ΔCt= (Ct gene－Ct ACTB)，ΔΔCt= (ΔCt treat－ ΔCt control)。所得數(shù)據(jù)使用GraphPad（GraphPad Software 5.0）進行整理制圖。

1.4 WesternBlot檢測

組織蛋白提?。喝?0 mg組織塊置于離心管中，加入400 μL RIPA-PMSF 裂解液（Solarbio，R0010），組織勻漿機勻漿后于4℃，12 000 r·min-1離心5 min，取上清采用BCA 法測定蛋白含量。細胞蛋白提?。合蚣毎囵B(yǎng)板中加入加入150-200 μL RIPA-PMSF 裂解液（Solarbio，R0010），于冰上充分吹打裂解后，于 4℃，12000 rpm 離心5 min，取上清采用BCA 法測定蛋白含量。4 × 蛋白上樣buffer（Solarbio，P1016）100℃變性5-10 min。蛋白電泳：80 V 恒壓電泳約20 min，待樣品進入分離膠層后，換用100 V 恒壓電泳1-1.5 h；轉膜：200 mA 恒流轉膜60-90 min?？贵w孵育：用TBST（Solarbio，T1081）配制體積分數(shù)為8%的脫脂奶粉（Solarbio，D8340）作為封閉液，將膜放入封閉液中封閉3 h。按抗體說明書上的推薦比例使用封閉液將一抗（Anti-SDF1 抗體（Abcam，ab9797），Anti-CD62P 抗體（Abcam，ab59738），Anti-CD62E抗體（Abcam，ab18981），Anti-CD44抗體（Abcam，ab157107），重組Anti-CXCR4抗體[UMB2]（Abcam，ab124824），重組Anti-VCAM1 抗體[EPR5047]（Abcam，ab134047），Anti-Integrin alpha 4/CD49D 抗體（Abcam，ab202969）進行稀釋，將膜放入稀釋后的一抗中4℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用 TBST 洗膜 3 次，每次15 min。將膜放入按1∶3 000比例稀釋的二抗（goat anti-rabbit:Abcam，ab6721）中37℃孵育 1 h，使用 TBST（Solarbio，T1081）洗膜 3 次，每次 15 min 使用 ECL 顯色劑（Solarbio，PE0010）對膜進行顯色，于凝膠成像儀（Tanon，5200）中進行曝光成像。

1.5 肝臟組織冰凍切片及熒光拍照

新鮮肝臟組織固定液固定30 h，用手術刀把從固定液中取出的組織的目標部位修平整。將修切好的組織先經(jīng)15%的蔗糖溶液內(nèi)4℃冰箱脫水沉底后再轉入30%的蔗糖溶液內(nèi)4℃冰箱脫水沉底。將脫水后的組織取出放于包埋臺上，使用OCT 包埋劑進行包埋，冰凍切片機切片，厚度8-10 μm，將組織貼于載玻片上，-20℃保存?zhèn)溆谩１鶅銮衅瑥谋淠贸鰜韽蜏?，晾干水分，冷丙酮固?0 min，待丙酮完全干后于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3 次，每次5 min。滴加DAPI，避光室溫孵育10 min。充分洗脫DAPI后，使用抗淬滅封片劑封片，于尼康倒置熒光顯微鏡下拍照。

表1 引物設計

1.6 組織學檢測

取肝臟組織使用4%多聚甲醛固定，梯度經(jīng)久脫水，石蠟包埋，經(jīng)組織切片后進行H&E 染色及Masson染色，封片后使用顯微鏡拍照，分析肝臟病理及纖維化情況。

1.7 統(tǒng)計學分析

本研究使用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以均值±標準差（）表示，使用單因素方差分析（One-way ANOVA）對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 柔肝化纖顆粒可明顯改善肝纖維化情況

經(jīng)H&E 染色及Masson 染色，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，BMSC移植組及柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSC移植后，大鼠肝纖維化程度顯著降低（見圖1）。

2.2 柔肝化纖顆?？纱龠MBMSC向肝臟富集

組織冰凍切片熒光拍照結果顯示，使用柔肝化纖顆粒聯(lián)合BMSC 移植后，大鼠肝臟內(nèi)攜帶綠色熒光蛋白細胞數(shù)量明顯高于BMSC單獨移植組（見圖2）。

2.3 柔肝化纖顆粒可通過上調(diào)SDF-1/CXCR4 促進肝臟吸引BMSC

經(jīng)qPCR及WesternBlot檢測（見圖3），發(fā)現(xiàn)與單純干細胞干預組相比，柔肝化纖顆粒聯(lián)合干細胞干預組大鼠肝臟干細胞粘附相關基因（SDF-1、CD62P 和CD62E）mRNA 和蛋白表達量顯著上調(diào)（P<0.05），干細胞歸巢相關基因（CD44、CXCR4、VCAM-1 和CD49D）mRNA和蛋白表達量顯著上調(diào)（P<0.05）。

圖1 肝組織石蠟切片H&E染色及Masson染色觀察肝纖維程度

圖2 肝組織冰凍切片觀察外源注射熒光標記BMSC在肝臟內(nèi)分布情況

圖3 qPCR及WesternBlot檢測干細胞粘附相關基因（SDF-1、CD62P和CD62E）及干細胞歸巢相關基因（CD44、CXCR4、VCAM-1和CD49D）mRNA及蛋白表達水平

2.4 柔肝化纖顆粒在體外可增加BMSC的遷移能力

經(jīng)qPCR 及 WesternBlot 檢測（圖 4），與對照組相比，添加低濃度柔肝化纖含藥血清對干細胞歸巢相關基因（CD44、CXCR4、VCAM-1 和 CD49D）mRNA 和蛋白表達有上調(diào)作用，但差異不顯著（P>0.05），隨濃度升高，基因上調(diào)趨勢逐漸顯著（P<0.05）。

3 討論

肝硬化是各種慢性肝病的終末期表現(xiàn)，隨著生活水平的提高，酒桌餐飲文化的興起，人們的飲食結構以高糖、高脂為主，由此產(chǎn)生的酒精性和（或）非酒精性脂肪肝日益增多，這些患者均有肝硬化的潛質或已經(jīng)發(fā)展為肝硬化，因此肝硬化群體是十分巨大的。有研究表明，間充質干細胞對肝纖維化或肝硬化等有潛在的治療作用，能夠定植于損傷部位，通過下調(diào)IL-17來改善肝臟炎癥[7]或抑制肝星狀細胞的增殖或誘導其凋亡，阻斷肝纖維化進程[8-9]。我國部分學者及本課題的小樣本臨床研究表明[6,10]，輸注BMSCs的耐受性和安全性良好并能使肝硬化患者獲益：改善肝功能、降低Child-Pugh 和 MELD 評 分 ，減 少 腹 水 及 死 亡 率[11]。BMSCs 需要歸巢到損傷部分才能發(fā)揮其修復作用，但BMSCs 在骨髓中含量極少（需要經(jīng)體外擴增才能滿足應用要求，而體外培養(yǎng)、擴增條件的要求比較嚴格）及其向損傷部位歸巢的能力相對有限，影響了其臨床預期效果。

中醫(yī)學認為，腎藏精，主生殖、生長、發(fā)育，與現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)的干細胞具有的“自我更新”與“高度分化”特性不謀而和。兩者都在旨在揭示機體生長發(fā)育與生殖的基本生命規(guī)律。本研究的前期研究結果證實[6]柔肝化纖顆粒含藥血清條件培養(yǎng)液（以肝組織勻漿+10%胎牛血清為條件培養(yǎng)基）可誘導BMSCs 肝樣分化：可見細胞貼壁生長，透光度良好，21 天后細胞變大變圓，呈集落生長，表現(xiàn)為肝樣細胞形態(tài)，但其在體內(nèi)的具體作用途徑及干細胞歸巢機制尚不明確。

圖4 qPCR及WesternBlot檢測干細胞歸巢相關基因（CD44、CXCR4、VCAM-1和CD49D）mRNA及蛋白表達水平

BMSCs 的歸巢和植入的過程與白細胞遷移至炎癥部位再歸巢至淋巴結相似。此過程中，BMSCs 需跨越血管內(nèi)皮細胞與細胞外基質進入骨髓龕位，與基質細胞在黏附分子、SDF-1 及生長刺激因子作用下進行自我更新和增殖分化，從而實現(xiàn)了歸巢和植入[12]。黏附分子E-選擇素和P-選擇素介導干細胞在內(nèi)皮細胞層的滾動，隨后內(nèi)皮細胞分泌的SDF-1 激活CXCR4 陽性的干細胞并觸發(fā)了LFA-1/ICAM 和VLA-1/VCAM-1 之間相互作用而使干細胞黏附于內(nèi)皮細胞上[13]。而VLA-1 和VLA-5 與細胞外基質纖維結合素的作用使干細胞穿過細胞外基質并順著SDF-1 濃度梯度遷移至骨髓龕位[14]?？梢姡珺MSCs的歸巢和植入過程中SDF-1/CXCR4 相互作用從始至終都發(fā)揮著決定性作用[15]。在動物實驗中，本研究發(fā)現(xiàn)與單純干細胞干預組相比，柔肝化纖顆粒聯(lián)合干細胞干預組大鼠肝臟干細胞粘附相關基（SDF-1，CD62P 和 CD62E）mRNA 和蛋白表達量顯著上調(diào)（P<0.05），說明經(jīng)柔肝化纖顆粒干預后，大鼠肝臟粘附分子表達量顯著上調(diào)，可募集更多的干細胞遷移至肝臟區(qū)域，從而進行后續(xù)的轉分化及修復。通過對BMSC 干預后大鼠肝臟中干細胞歸巢相關基因CD44、CXCR4、VCAM-1 和 CD49D 的 mRNA 和蛋白表達量進行檢測后，發(fā)現(xiàn)柔肝化纖顆粒干預下可顯著提高肝臟內(nèi)干細胞歸巢相關指標的上調(diào)（P<0.05），此發(fā)現(xiàn)證實經(jīng)柔肝化纖顆粒干預后，肝臟可有效募集BMSC 歸巢至受損肝臟區(qū)域。在體外BMSC 細胞實驗中，經(jīng)較高濃度柔肝化纖含藥血清干預后，本研究發(fā)現(xiàn)BMSC 干細胞歸巢相關基因的mRNA 和蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.05），此結果與動物實驗結果相吻合，證明柔肝化纖顆粒是激活BMSC 活躍歸巢的關鍵因素。

BMSC 移植是公認的最具應用前景的肝纖維化及肝硬化干細胞治療手段，隨著對BMSC 歸巢及肝臟募集作用機制的不斷深入研究，并對其后續(xù)定向分化為肝細胞的微環(huán)境作用進行深入探討，利用我國寶貴的中醫(yī)藥資源，促進BMSC 向干細胞歸巢并分化，修復受損肝臟組織，將為肝纖維化與肝硬化的治療帶來全新的變革。中藥柔肝化纖顆粒可通過SDF-1/CXCR4 軸促進BMSC 歸巢相關基因及蛋白表達，促進干細胞向肝纖維化肝組織歸巢，并提高受損肝臟募集干細胞的水平，修復受損肝臟。