山楂葉提取物分離純化工藝的優(yōu)化＊

姜紅紅 ，王紅霞 ，連運河 ，，喬延江 ，，高 偉 ，＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院 北京 102488；2. 晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司 研發(fā)中心 營養(yǎng)提取實驗室邯鄲 057250）

山楂葉為薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge. var. majorN. E. Br.）或山楂（Crataegus pinnatifidaBge.）的干燥樹葉[1]。山楂葉提取物系山楂葉經(jīng)加工制成的提取物，具有活血化瘀、理氣通絡(luò)的功效[2]。山楂葉化學(xué)成分明確，主要含有黃酮類、花青素類、三萜類、有機(jī)酸類等[3]，其中黃酮類成分主要為牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、蘆丁等[4]。山楂葉總黃酮中的牡荊素鼠李糖苷是其藥理作用的主要單體成分，也是評價山楂葉提取物質(zhì)量的重要指標(biāo)[5]。山楂葉總黃酮中金絲桃苷和牡荊素含量較高，牡荊素鼠李糖苷次之。其中牡荊素鼠李糖苷具有擴(kuò)張冠狀血管、保護(hù)實驗性心肌缺血、改善心肌供血量降低血脂等作用，有重要的藥用價值[6]。

近年來，山楂葉提取物工藝取得很大進(jìn)展。提取方式包括乙醇回流法[8-9]、微波輔助提取技術(shù)[10]；分離純化方法包括大孔樹脂吸附法[11-12]、膜過濾技術(shù)等[13]。山楂葉總黃酮從山楂葉原料中初步提取出來后，含有較多的雜質(zhì)，如山楂多糖、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、花青素及色素等，影響最終產(chǎn)品的純度。為提高提取物純度，采用分離純化方法，依據(jù)黃酮類化合物和雜質(zhì)的性質(zhì)差異精制黃酮類化合物[14]。中國藥典記載的山楂葉提取物制備工藝，即采用乙醇浸漬法提取、D101 大孔樹脂純化，制備工藝簡單易行、經(jīng)典可靠。隨著中藥提取物技術(shù)發(fā)展，新型的、高安全性樹脂被研制出來，如LX158、HZ841、HPD300 等[15-16]，對黃酮類有較強(qiáng)的吸附性能，提高了制備山楂葉提取物的成功率，在滿足市場需求基礎(chǔ)上，為山楂葉提取物作為藥物原料提供理論基礎(chǔ)。。

本文通過比對產(chǎn)品收率和質(zhì)量等指標(biāo)，對藥典工藝中樹脂型號、純化工藝、洗脫體系進(jìn)行優(yōu)化，提高生產(chǎn)效能、降低成本，為工業(yè)生產(chǎn)提供更優(yōu)工藝選擇。

1 實驗方法

1.1 儀器

分析天平（天津泰斯特儀器有限公司AL104）；電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠JJ600）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠DK-S24）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司SHB-Ⅲ）；紫外分光光度計（上海天美科技儀器有限公司Uv-1102）；高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司Agilent-1260）。

1.2 原料與試劑

山楂葉藥材（山東臨沂藥材收購站，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系劉春生教授鑒定）；蘆丁對照品98.6%、牡荊素鼠李糖苷對照品99%（中國食品藥品檢定研究院）；HPD300、HPD100、LX158、HZ841、D101大孔吸附樹脂（西安藍(lán)曉科技股份有限公司）；甲醇、乙醇、乙腈、四氫呋喃、乙酸（色譜純天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（分析純天津市聞東區(qū)紅巖試劑廠）。

1.3 檢測方法

1.3.1 總黃酮含量測定

1.3.1.1 對照品溶液制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁對照品適量，加入乙醇制成每1 mL 含蘆丁0.20 mg 的溶液作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液于25 mL 容量瓶中，并分別加水稀釋至6 mL，依次加入亞硝酸鈉溶液1 mL、硝酸鋁溶液1 mL、氫氧化鈉溶液10 mL 顯色，加水定容至刻度，并以相應(yīng)試劑做空白，照紫外分光光度法檢測，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，如表1 所示，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[1]，見圖1。

由圖1 測定結(jié)果顯示，蘆丁濃度在10-50 μg.mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性范圍考察表

1.3.1.2 含量測定

精密稱定0.15 g 山楂葉提取物樣品，加入50%乙醇 25 mL 超聲處理 5 min 后，放置 3 h 以上，取 2 mL 加水定容至25 mL 容量瓶中作為供試品溶液。取2 mL供試品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下制備方法，測定吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出蘆丁的濃度，既得[1]。

1.3.2 牡荊素鼠李糖苷含量測定

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：四氫呋喃-甲醇-乙腈-乙酸-水（38:3:3:4:152）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：330 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL[1]。

1.3.2.2 對照品溶液及供試品溶液的制備

精密稱定牡荊素鼠李糖苷對照品5 mg，加入60%乙醇制成每1 mL含100 μg的溶液作為對照品溶液；精密稱定山楂葉提取物樣品50 mg，加60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取上述對照品溶液和供試品溶液，將供試品溶液稀釋至不同濃度。取已知濃度的混合對照品溶液，過濾后依次注入高效液相色譜儀。以牡荊素鼠李糖苷對照品濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積（S）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[1]，見表2、圖2。

由圖2 測定結(jié)果顯示，牡荊素鼠李糖苷濃度在12.5～400 μg.mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性范圍考察表

圖1 線性關(guān)系考察

圖2 牡荊素鼠李糖苷線性關(guān)系考察

1.3.2.4 含量測定

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μ L，注入液相色譜儀（安捷倫1260），測定，記錄色譜圖[1]。供試品特征圖譜中應(yīng)出現(xiàn)四個特征峰，與參照物對相應(yīng)的S峰，見圖3所示：

1.4 工藝方法

1.4.1 山楂葉提取物制備方法

量取適量的山楂葉提取液等份，通過大孔吸附樹脂柱，依次用水和不同的濃度的乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液，回收乙醇，濃縮至一定相對密度，噴霧干燥既得。

1.4.2 山楂葉提取物收率結(jié)果計算[11]

式中：

X－山楂葉提取物的收率，%；

m1—產(chǎn)出產(chǎn)品重量，單位為克（g）；

n1－產(chǎn)出產(chǎn)品總黃酮或牡荊素鼠李糖苷含量，%；

m2－投入原料質(zhì)量，單位為克（g）；

n2－投入原料單位總黃酮或牡荊素鼠李糖苷含量，%。

1.4.3 單因素試驗

分別考察提取溫度、提取時長、料液比和乙醇濃度對山楂葉總黃酮提取得率的影響。每個參數(shù)選擇6個因素，每組實驗重復(fù)三次。

1.4.3.1 提取溫度對山楂葉總黃酮提取得率的影響

精密稱定山楂葉粗粉600 g，平均分成六份，置于2 L 玻璃燒杯中，以70%乙醇為溶劑，按照料液比1∶8分別在30、40、50、60、70、80℃條件下提取1.5 h，考察溫度對總黃酮得率的影響。

圖3 高效液相色譜峰

1.4.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對山楂葉總黃酮提取得率的影響

精密稱定山楂葉粗粉600 g，平均分成六份，置于2 L 玻璃燒杯中，以料液比1∶8 在70℃條件下，分別以30%、40%、50%、60%、70%、80%體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取1.5 h，考察乙醇濃度對總黃酮提取得率的影響。

1.4.3.3 料液比對山楂葉總黃酮提取得率的影響

精密稱定山楂葉粗粉600 g，平均分成六份，置于2 L 玻璃燒杯中，以不同料液比1∶3、1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，在70℃條件下，用70%乙醇提取1.5 h，考察料液比對總黃酮得率的影響。

1.4.3.4 提取時間對山楂葉總黃酮提取得率的影響

精密稱定山楂葉粗粉600 g，平均分成六份，置于2 L 玻璃燒杯中，并編號，以料液比1∶8，70%乙醇為溶劑，在70℃條件下提取，1-4 號設(shè)置不同時間1、1.5、2、2.5、3 h，考察提取時間對總黃酮得率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥典工藝驗證

按照《中華人民共和國藥典》2015年版中山楂葉提取物工藝進(jìn)行提取、吸附、洗脫，將收集的洗脫液進(jìn)行濃縮、干燥，得到棕黃色粉末[1]，具體工藝參數(shù)見表3。

取山楂葉藥材粗粉100 g，按照試驗2.1 確定的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗證試驗，并計算總黃酮提取率。結(jié)果見表4。

由實驗結(jié)果可知，其總黃酮含量均＞80%、牡荊素鼠李糖苷均＞8.8%，且產(chǎn)品收率均＞88%。故該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 優(yōu)化工藝開發(fā)

本試驗采用與藥典工藝相同條件的提取方法，主要以篩選樹脂型號、考察洗脫條件來優(yōu)化分離純化工藝的過程參數(shù)，在獲得滿足指標(biāo)產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，與藥典工藝進(jìn)行對比。

表3 藥典工藝與優(yōu)化工藝參數(shù)及結(jié)果對比

表4 工藝驗證的結(jié)果

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 提取溫度對山楂葉總黃酮提取得率的影響

由圖4 可知，山楂葉總黃酮提取得率隨著提取溫度的升高而升高，在70℃時達(dá)到最高，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，總得率呈現(xiàn)下降趨勢。分析可知，在一定范圍內(nèi)升高溫度可以促使細(xì)胞壁的滲透作用，使黃酮大量溶出，當(dāng)溫度過高會破壞黃酮結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致黃酮得率下降。因此，提取山楂葉總黃酮最佳溫度為68-70℃。

2.2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對山楂葉總黃酮提取得率的影響

如圖5 所示，山楂葉總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而呈先升高保持穩(wěn)定，后升高再降低的趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，總黃酮得率最高。這是由于相似相容原理，70%乙醇極性與山楂葉總黃酮極性類似，可溶出更多的黃酮。當(dāng)乙醇濃度較低時，更多的極性較大的成分如糖類、蛋白質(zhì)等大量溶出；當(dāng)乙醇濃度較高時，更多脂溶性成分溶出，導(dǎo)致黃酮含量相對偏低。所以山楂葉總黃酮最佳提取乙醇濃度為70%。

2.2.1.3 料液比對山楂葉總黃酮提取得率的影響

由圖6 可知，山楂葉總黃酮得率隨著料液比的增大而逐步提高，當(dāng)料液比為1∶8-1∶14 時，總黃酮得率達(dá)到最高，這是因為當(dāng)提取溶劑體積較小時，總黃酮溶解不充分，為節(jié)省原料，可選擇1∶8料液比即可。

2.2.1.4 提取時間對山楂葉總黃酮提取得率的影響

如圖7 所示，山楂葉總黃酮提取得率隨著提取時間的增大而升高，在2-2.5 h 時達(dá)到平衡，隨著時間再次增大，黃酮得率呈現(xiàn)稍微下降的趨勢。分析可知，有效成分的溶出會和提取時間成正相關(guān)關(guān)系，但是時間越長，其他的成分及雜質(zhì)也會相應(yīng)溶出，當(dāng)黃酮基本提完全時，延長時間只會加速其他雜質(zhì)的溶出。因此，提取山楂葉總黃酮最佳提取時間為2 h。

圖4 提取溫度對黃酮含量的影響

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮含量的影響

圖6 料液比對總黃酮提取得率的影響

2.2.2 正交試驗

經(jīng)過初步試驗，確定主要影響提取過程的因素為：溶劑用量、提取溫度、提取時間。對此三個因素分別取三個水平，采用L9（34）正交試驗，因素水平安排見表5。

圖7 提取時間對總黃酮提取得率的影響

根據(jù)確定的因素水平表，稱取9份山楂葉，并干燥粉碎成粗粉，每份20 g，按照L9（34）正交試驗設(shè)計表進(jìn)行平行試驗，提取、過濾、放涼后回收乙醇，濃縮液攪拌均勻移至50 mL容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度。測定濃縮液中總黃酮含量，結(jié)果見下表6、7。

綜合評價上述三個提取條件對山楂葉總黃酮提取效果的影響，提取時長最為顯著（P≤0.05）；而提取溶劑用量和提取溫度對提取率的影響無顯著意義，根據(jù)極差大小，可以看出，影響最終提取得率的因素順序為提取時長＞提取溫度＞料液比。優(yōu)選的最佳工藝組合為A2B3C3，即按照料液比1∶10，在70℃條件下提取2.5 h。

2.2.3 驗證試驗

取山楂葉藥材粗粉100 g，按照正交試驗確定的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行連續(xù)動態(tài)逆流提取，并計算總黃酮提取率。結(jié)果見表8。由實驗結(jié)果可知，總黃酮提取得率均≥8.0%，且3 次提取得率上下浮動不超過0.22%，該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2.4 分離純化試驗

2.2.4.1 大孔吸附樹脂型號篩選

分別精密稱取處理好的HZ841、HPD100、HPD300、LX158、D101 型號樹脂各100g[12]，濕法裝于玻璃樹脂柱中。量取500 mL混合均勻的山楂葉水提物的溶液5份(測定總黃酮含量為m)，相同試驗條件下進(jìn)行動態(tài)吸附。待吸附完畢，用等體積的水、70%乙醇洗脫至完全，收集相應(yīng)的洗脫液，干燥。檢測水洗液中總黃酮含量為n1，下柱水中的總黃酮含量為n2，樹脂飽和吸附量為n。并檢測洗脫液中總黃酮含量。相同試驗重復(fù)三次，計算三次每種樹脂的飽和吸附量、吸附率、洗脫率的平均值。具體結(jié)果計算如下。結(jié)果見表9：

表5 因素水平表

表6 L9（34）正交試驗設(shè)計結(jié)果

表7 方差分析表

表8 試驗驗證結(jié)果

表9 不同型號樹脂測定結(jié)果對比

公式1 中，樹脂的飽和吸附量吸附液中總黃酮量（m）-水洗液中總黃酮含量-下柱水中總黃酮含量（n2）。

由表8 可知，HPD300 樹脂能吸附黃酮總量最高；LX158 樹脂的吸附率和解吸率最高，損失最少，分別比其他四種樹脂均高出10%-30%、5%-60%。樹脂的飽和吸附量一定程度體現(xiàn)其對有效成分的吸附性能，但是對于工業(yè)化生產(chǎn)，樹脂的吸附率和洗脫率越高，其分離效率越高、減少有效成分損失、降低生產(chǎn)成本。綜上，純化山楂葉總黃酮最佳樹脂為LX158。

2.2.4.2 洗脫體系的考察

取100 mL LX158 型號樹脂8 份，精密量取500 mL上樣液，動態(tài)吸附至完全、除雜洗脫后，分別用足量等體積10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、95%乙醇進(jìn)行洗脫，測定相應(yīng)洗脫液，檢測其總黃酮與牡荊素鼠李糖苷含量。結(jié)果見圖8。

（1）在乙醇濃度為≤5%時，洗脫液中總黃酮和牡荊素鼠李糖苷含量幾乎為0，此階段可采用水洗脫除掉水溶性雜質(zhì)，如多糖類。分別采用1、2、3、4、5 倍柱體積純凈水洗脫，將水洗液干燥稱重，試驗重復(fù)操作三次，并檢測其中總黃酮比重。

三次測定結(jié)果均為：水洗體積為4BV 時，總黃酮被逐漸洗脫出來，為減少黃酮損失，且去除雜質(zhì)，選擇3BV作為最佳水洗體積。

（2）乙醇濃度≥10%時，總黃酮和牡荊素鼠李糖苷逐漸被洗脫下來，采用20%～30%乙醇進(jìn)行洗脫時，牡荊素鼠李糖苷含量在8%～14%之間，達(dá)到最高，隨著乙醇濃度的增大，牡荊素鼠李糖苷含量降低，乙醇濃度到達(dá)40%時，幾乎被洗脫完全。同時，乙醇濃度＜30%時，洗脫液中總黃酮含量＜80%，隨著乙醇濃度≥30%時，總黃酮含量≥80%，為獲得同時滿足牡荊素鼠李糖苷≥8.8%、總黃酮≥80%的山楂葉提取物，擬選用30%的乙醇為最佳洗脫溶劑。

（3）采用足量的30%乙醇按照0.5=1 BV/h 流速進(jìn)行洗脫。洗脫液濃縮干燥，試驗重復(fù)操作三次，并檢測其中總黃酮與牡荊素鼠李糖苷含量。結(jié)果均低于要求值。山楂葉中除了大部分糖類雜質(zhì)，還有一些不易溶于水的雜質(zhì)。故需進(jìn)一步用乙醇-水溶液洗脫除雜。分別選擇等體積的5%、10%、15%乙醇，再用30%乙醇-水溶液洗脫，收集相應(yīng)洗脫液，檢測其總黃酮與牡荊素鼠李糖苷含量。實驗重復(fù)三次，取結(jié)果平均值。試驗表明，用10%乙醇作為二次除雜溶劑，30%乙醇解吸液中牡荊素鼠李糖苷含量均較高，故選用10%乙醇作為最佳除雜溶劑。

圖8 洗脫體系曲線

分別采用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV 的10%乙醇沖洗5 根樹脂柱，再用30%乙醇-水溶液洗脫，測定相應(yīng)洗脫液，檢測其總黃酮與牡荊素鼠李糖苷含量。最終確定以3 BV 10%乙醇作為洗脫除雜液。

2.2.4.3 洗脫劑用量的考察

山楂葉提取液經(jīng)過LX158 樹脂，按照上述工藝參數(shù)進(jìn)行除雜洗脫后，加入30%乙醇進(jìn)行洗脫，每10 mL收集一次洗脫液，共收集10 份，檢測其中總黃酮與牡荊素鼠李糖苷含量，當(dāng)洗脫至第4個柱體積時，牡荊素鼠李糖苷單體成分已經(jīng)基本洗脫完全，當(dāng)洗脫至第6個柱體積時，總黃酮類成分已經(jīng)基本洗脫完全；最終確定的洗脫劑用量為60 mL，即6 BV。

綜上，山楂葉提取物最佳洗脫體系為3BV 純凈水洗除雜、3 BV 10%乙醇洗脫除雜、6BV30%乙醇洗脫。

2.3 優(yōu)化工藝與藥典工藝對比

取混合均勻的干燥山楂葉兩份各2 kg，分別采用藥典工藝和優(yōu)化工藝進(jìn)行提取、純化、干燥試驗。將得到的山楂葉提取物混合均勻、稱重，計算其重量得率；按照1.4.3 項下的方法計算兩工藝的產(chǎn)品收率；按照1.3 檢測方法檢測各自的總黃酮和牡荊素鼠李糖苷含量。本試驗重復(fù)三次。具體純化工藝參數(shù)及對比結(jié)果見表3。

由表3可知，在相同實驗條件下，優(yōu)化工藝與藥典工藝分別采用LX158 和D101 型號,樹脂進(jìn)行純化試驗，其他條件相同情況下，為獲得合格產(chǎn)品，藥典工藝需要兩次低濃度乙醇除雜，較比優(yōu)化工藝用時長1倍、所用乙醇體積大；從產(chǎn)品質(zhì)量來看，兩工藝所得產(chǎn)品總黃酮相差不大，優(yōu)化工藝牡荊素鼠李糖苷含量高出4.72%；對比兩者的收率，優(yōu)化后的工藝重量得率較藥典工藝高0.79%、含量收率高出7.07%。

根據(jù)圖9 可以看出，藥典工藝和優(yōu)化工藝所制備提取物相似度≥0.9%。在保留時間5.22 s 與6.5 s 之間的最高峰為牡荊素鼠李糖苷，其他成分峰的保留時間和峰面積也幾乎重合。根據(jù)表10 譜圖的S 值均≥0.9，可以看出，兩種工藝提取無明顯差別。

3 結(jié)論

圖9不同提取工藝產(chǎn)品指紋圖譜

表10 不同提取工藝產(chǎn)品指紋圖譜S值

以往大量的文獻(xiàn)都以山楂葉提取物中總黃酮為考察指標(biāo)，對提取分離工藝進(jìn)行優(yōu)化，但忽視了對牡荊素鼠李糖苷的評價和考察，所得提取物難以符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。而牡荊素鼠李糖苷是山楂葉總黃酮中重要的黃酮單體成分，是山楂葉提取物治療心血管疾病重要的成分，也是評價山楂葉提取物藥理作用、臨床藥效和質(zhì)量的重要指標(biāo)。按照《中華人民共和國藥典》2015 年版中規(guī)定的山楂葉提取物制備方法，得到合格的山楂葉提取物的成功率非常低，本研究通過對提取因素、樹脂種類、洗脫參數(shù)的考察，制備滿足要求的山楂葉提取物，并將試驗結(jié)果與藥典工藝進(jìn)行對比。通過試驗探索，對影響山楂葉總黃酮分離純化的五個因素進(jìn)行研究，并使用正交設(shè)計方法合理設(shè)計實驗方案。依據(jù)不同樹脂的分離純化效果、出膏率和提取物有效成分含量分析。最終確定提取工藝參數(shù)為：選取LX158 型號樹脂，上樣液濃度為 8.3-9 mg·mL-1，吸附流速0.8-1.0 BV/h，先用3 BV 純凈水洗脫除雜，再用3 BV10%乙醇洗脫除雜，6 BV 30%乙醇解析，得到含有大量牡荊素鼠李糖苷的山楂葉提取物。且優(yōu)化后工藝制備山楂葉提取物達(dá)標(biāo)率較藥典工藝提高了20%以上。對兩工藝所得產(chǎn)品指紋圖譜法進(jìn)行一致性評價，證明優(yōu)化工藝與藥典工藝所制備提取物無顯著差別，并通過中試放大驗證，證明該工藝穩(wěn)定可行，為工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗基礎(chǔ)。