基于色差原理分析黃芩化學(xué)成分含量與色度相關(guān)性＊

武艷雪，翁麗麗，姜雨昕，宿 瑩，侯曉琳

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 長春 130117）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。其苦寒，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效［1］。含有黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素、漢黃芩苷、千層紙素A 等黃酮類活性成分。外觀顏色的差異常常反映著藥材質(zhì)量的不同，而且與藥材內(nèi)在的物質(zhì)成分含量高低也密不可分［2-4］。色差計(jì)是通過模擬人眼視覺系統(tǒng)，結(jié)合儀器內(nèi)部的模擬積分光學(xué)系統(tǒng)，把光譜度數(shù)據(jù)的三刺激值積分，得到顏色的數(shù)學(xué)表達(dá)式，從而計(jì)算出L*(代表顏色深淺)，a*(代表顏色紅綠方向)和b*(代表顏色黃藍(lán)方向)，并可將飲片內(nèi)外顏色的變化通過L*，a*，b*色空間精確量化［5］。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，色差儀、電子鼻、電子舌等設(shè)備被越來越多地應(yīng)用到對(duì)中藥材顏色和氣味的研究中，如黃學(xué)思等運(yùn)用色彩色差計(jì)和電子鼻，將經(jīng)驗(yàn)指標(biāo)數(shù)據(jù)化，實(shí)現(xiàn)檳榔炒制“火候”判別的客觀數(shù)量化，劉紅秀等運(yùn)用電子鼻提取了川芎、丁香等7種中藥材的氣味信息，建立了氣味指紋圖譜，很好地鑒別了不同品種的中藥材［6-7］。將顏色、氣味等感官評(píng)價(jià)指標(biāo)以數(shù)值化的形式表示出來，進(jìn)而定量化，將有助于中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)化的實(shí)現(xiàn)[8]。本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)龍膽、黃柏等藥材進(jìn)行了外觀色度與內(nèi)在含量的相關(guān)性進(jìn)行研究[9-10]，結(jié)果表明，藥材的顏色是藥材內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)即化學(xué)成分尤其是藥效成分的外在體現(xiàn)[11]。近年來，黃芩藥材色度研究內(nèi)容較為缺乏，而且黃芩古時(shí)有“黃文”之黃芩原名及“深色為好”之說[12]，判別結(jié)果容易受到個(gè)體差異和環(huán)境因素的影響，客觀性和準(zhǔn)確性難以保證[13]，故本實(shí)驗(yàn)采用L*、a*、b*色度空間對(duì)不同黃芩的顏色進(jìn)行了客觀的數(shù)字化評(píng)價(jià)，并探究黃芩含量與顏色L*、a*、b*之間的相關(guān)性，建立以量化顏色快速評(píng)價(jià)黃芩質(zhì)量的方法，為該藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立提供參考依據(jù)。

1 材料

Prominence-ILC-2030高效液相色譜儀（日本島津儀 器 公 司）；色 譜 柱 Agilent XDB-C18（250mm 4.6mm，5μm）；NH300 電腦色差儀（深圳三恩馳科技有限公司）；FA1004B(d=0.00001 g)電子天平（上海佑科儀器有限公司）、JA2603B(d=0.0001 g)電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；KQ3200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WaterPurifier 實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）。

黃芩苷對(duì)照品（規(guī)格：40mg，純度：93.5%，批號(hào)：110715-201720，中國食品藥品檢定研究院）。

收集20批不同來源的的黃芩藥材，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室主任翁麗麗教授鑒定，均來源于唇形科植物黃芩的干燥根。其樣品信息見表1。

表1 20批黃芩藥材的樣品收集信息

2 方法

2.1 黃芩樣品顏色測(cè)定

2.1.1 測(cè)定條件

可選光源：D65；視場選擇；8 度視角；測(cè)定孔徑：4 mm；光源：LED 藍(lán)光激發(fā)；儀器誤差：△E*ab≤0.4。對(duì)儀器進(jìn)行黑白板校正以后，進(jìn)行樣品測(cè)定。

2.1.2 精密度考察

取黃芩（過4號(hào)篩）S1樣品，裝入自制測(cè)色皿中，均勻平鋪于底部，按照“2.1.1”項(xiàng)下色度測(cè)定條件進(jìn)行樣品顏色測(cè)定，連續(xù)測(cè)定 6 次，記錄L*、a*、b*值，結(jié)果RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性考察

取黃芩（過4 號(hào)篩）S1 樣品6 份，裝入自制測(cè)色皿中，均勻平鋪于底部，按照“2.1.1”項(xiàng)下色度測(cè)定條件進(jìn)行 6 份樣品顏色測(cè)定，記錄L*、a*、b*值，結(jié)果 RSD＜2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性考察

取黃芩（過4 號(hào)篩）S1 樣品，分別于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，按照“2.1.1”項(xiàng)下色度測(cè)定條件進(jìn)行樣品顏色測(cè)定，記錄L*、a*、b*值，結(jié)果RSD＜3%，表明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 樣品顏色測(cè)定

取黃芩（過4 號(hào)篩）樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下色度測(cè)定條件進(jìn)行樣品顏色測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，記錄樣品顏色測(cè)定指標(biāo)L*、a*、b*的平均值。樣品顏色測(cè)定數(shù)據(jù)見表1。

2.2 黃芩苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為280 mn。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取在60℃減壓干燥4 h 黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品中粉約0.3 g，精密稱定，加70%乙醇40 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置100 mL 量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌溶液和殘?jiān)?，洗液濾過同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取1 mL，加甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.2.4 測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃芩指標(biāo)性成分含量測(cè)定

由表2 中測(cè)得的結(jié)果可知，20 批黃芩樣品中黃芩苷的含量均符合2015 年版《中華人民共和國藥典》黃芩藥材含黃芩苷不得少于9%的規(guī)定。

3.2 相關(guān)性分析

將黃芩中有效成分黃芩苷與顏色指標(biāo)值L*、a*、b*值相關(guān)聯(lián)，用SPSS 21.0 軟件做相關(guān)分析，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，黃芩苷含量與顏色指標(biāo)值L*、a*、b*的相關(guān)系數(shù)分別為0.899、0.817、0.940，L*，b*雙尾檢驗(yàn)的概率為P＜0.001，a*雙尾檢驗(yàn)的概率為P=0.001，P＜0.01，說明黃芩苷含量與顏色指標(biāo)值L*、a*、b*在 0.01 水平上有極顯著的相關(guān)關(guān)系。從相關(guān)系數(shù)可以看出黃芩中黃芩苷的含量與a*、b*呈正相關(guān)。說明在81.7%，94.0%的程度上a*、b*越大，黃芩苷含量越高：而黃芩苷含量與L*負(fù)相關(guān)，說明在89.9%的程度上L*越大，黃芩苷含量越低。

3.3 回歸性分析

（1）以黃芩中黃芩苷的含量為因變量，顏色指標(biāo)值L*、a*、b*為自變量，利用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表4、表5、表6。

表2 黃芩苷含量、顏色測(cè)定值

從表4可以得出，顏色值作為自變量時(shí)r為0.953，說明含量有95.3%是受顏色值影響的。從表5 可以得出，驗(yàn)證回歸顯著性的F 值是52.424，sig=0.000<0.01，表明黃芩苷構(gòu)成的回歸式統(tǒng)計(jì)上是極顯著的。從表6可得出回歸式為：Y黃芩苷=2.573-0.059XL*-0.102Xa*+0.296Xb*。以黃芩中黃芩苷的含量為自變量，顏色指標(biāo)值L*、a*、b*為因變量時(shí)，此回歸分析雖沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，實(shí)驗(yàn)中一般不會(huì)應(yīng)用含量測(cè)定結(jié)果去預(yù)測(cè)顏色指標(biāo)值，但由于顏色指標(biāo)值與含量值之間是交互關(guān)系，此回歸分析只是更好的說明兩者之間顯著的因果關(guān)系。

（2）以顏色指標(biāo)值L*、a*、b*為因變量，黃芩中黃芩苷的含量為自變量，利用SPSS21.0 軟件進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表7、表8、表9。

表3 黃芩苷與 L*、a*、b*值相關(guān)性

表4 黃芩苷含量與顏色值模型匯總

表5 方差分析

表6 回歸系數(shù)

表7 黃芩有效成分含量的模型匯總

從表7 可以得出，黃芩苷的含量作為自變量時(shí)與L*、a*、b*的 r2分別為 0.809、0.667、0.885，說明顏色指標(biāo)值L*、a*、b*分別有80.9%、66.7%、88.5%是受有效成分黃芩苷影響的。從表8 可以得出，驗(yàn)證回歸顯著性的F值分別是76.214，36.086，137.869，P＜0.01，L*、a*、b*與黃芩苷構(gòu)成的回歸式統(tǒng)計(jì)上呈極顯著的。從表9可以得出，回歸方程為：YL*=35.759-5.080X黃芩苷、Ya*=-6.511+0.850 X黃芩苷、Yb*=0.773+2.340X黃芩苷。通過本次建立的回歸方程，可以找到一種通過測(cè)定顏色指標(biāo)值，快速預(yù)測(cè)黃芩中黃芩苷含量的方法。

3.5 聚類分析

將顏色指標(biāo)值L*、a*、b*與黃芩中黃芩苷含量進(jìn)行k-均值聚類分析，利用SPSS 21.0 軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果見表10。

通過表10可知，樣品分為三類，其中，第一類含有8批樣品，編號(hào)為S08、S09、S10、S11、S12、S13、S17、S19號(hào)樣品，黃芩苷含量范圍為12.88-14.06，L*的變化范圍為-30.14--35.22，a*變化范圍為3.88-5.52，b*變化范圍為30.26-33.97，第一類黃芩樣品，其黃芩苷含量偏低，顏色偏淺棕黃色；第二類含有7 批樣品，編號(hào)為S01、S02、S06、S07、S14、S16、S18 號(hào)樣品，黃芩苷含量范圍為14.27-14.95，L*的變化范圍為-35.39--37.50，a*變化范圍為 5.54～6.48，b*變化范圍為 34.23～36.78，第二類黃芩樣品，其黃芩苷含量適中，顏色偏棕黃色。第三類含有 5 批樣品，編號(hào)為 S03、S04、S05、S15、S20號(hào)樣品，黃芩苷含量范圍為15.32-16.41，L*的變化范圍為-47.00--48.26，a*變化范圍為6.55-7.85，b*變化范圍為37.45-39.14，第三類黃芩樣品，其黃芩苷含量偏高，顏色偏深棕黃色。

表8 色差值的方差分析

表9 色差值的回歸分析

表10 L*、a*、b*、E*ab與黃芩中有效成分黃芩苷含量的聚類分析

4 討論

黃芩藥材主要化學(xué)成分為黃酮類、揮發(fā)油類以及多糖類成分，其中黃芩苷為黃芩的主要有效成分，2015 版《中華人民共和國藥典》將黃芩苷作為該藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)，說明黃芩苷為發(fā)揮藥效的主要成分，而且其化學(xué)性質(zhì)也相對(duì)穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)針對(duì)主要有效成分黃芩苷，引入色度分析原理對(duì)黃芩藥材顏色進(jìn)行了客觀量化，研究黃芩中黃芩苷含量與外觀顏色指標(biāo)值的相關(guān)及回歸性并進(jìn)行聚類分析，找到一種可以快速預(yù)測(cè)黃芩中有效成分黃芩苷含量的方法。分析結(jié)果表明，黃芩中黃芩苷含量與a*、b*存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，表明在一定程度上a*、b*值越大，黃芩苷含量越高；而黃芩苷含量與L*存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明在一定程度上，L*值越小，黃芩苷含量越高。結(jié)合外觀顏色結(jié)果表明，黃芩藥材深棕黃色的，其有效成分黃芩苷含量相對(duì)較高，質(zhì)量相對(duì)較好。

由于黃芩藥材采收期，產(chǎn)地以及加工方法的不同，導(dǎo)致黃芩原藥材的質(zhì)量有較大差異[14-16]，其中顏色差異為外觀性狀的主要差異之一。中藥的性狀判定是傳統(tǒng)質(zhì)量評(píng)價(jià)中的主要形式，但傳統(tǒng)性狀評(píng)價(jià)具有很大的主觀性［17］，近年來，色差儀在中藥材顏色的量化檢測(cè)中受到廣泛應(yīng)用［18-21］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，黃芩藥材顏色深棕黃色，其有效成分黃芩苷含量越高，這與古文說法相一致，由此進(jìn)一步驗(yàn)證了黃芩藥材的顏色差異可直接反映出質(zhì)量優(yōu)劣。將色差分析法應(yīng)用于中藥研究領(lǐng)域，不但實(shí)現(xiàn)了對(duì)中藥及其加工品的模糊顏色進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)，也使得基于顏色性狀的中藥鑒定及品質(zhì)評(píng)價(jià)更加客觀，中藥的加工過程和產(chǎn)品更加標(biāo)準(zhǔn)化[22]。

本研究在繼承中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論思想的指導(dǎo)下，引入色度分析方法量化藥材顏色結(jié)合內(nèi)在成分含量的對(duì)比研究，期望探索一套全新的、規(guī)范的且具有中醫(yī)藥理論特色的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立提供參考依據(jù)，避免了傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別無法客觀量化藥材質(zhì)量的問題[23]，為保障中藥的優(yōu)質(zhì)有效和中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。