基于AHP-CRITIC法結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)選復(fù)方血竭跌打膏中四味中藥提取工藝＊

俞越童，鄒慧琴，姚月保，楊瑞琦，崔述生，閆永紅＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488；2. 北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院 北京 100009）

復(fù)方血竭跌打膏為北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院國家名老中醫(yī)崔述生教授用于治療急性軟組織損傷的經(jīng)驗(yàn)方。復(fù)方由續(xù)斷、延胡索、紅花等中藥組成，具有化瘀止痛、舒筋通絡(luò)的功效，該方（原名為崔氏速效損傷靈藥膏）曾于1993 年獲北京市科技進(jìn)步獎(jiǎng)，已在臨床使用二十余年，療效確切。由于原院內(nèi)制劑為復(fù)方內(nèi)全部中藥飲片粉碎成細(xì)粉后直接加蜂蜜攪拌而成的糊劑，外觀粗糙，使用、儲(chǔ)存不便，限制了其在臨床的推廣應(yīng)用。因此，本課題組擬將復(fù)方血竭跌打膏開發(fā)為乳膏劑。

藥材提取工藝的選擇直接影響復(fù)方中藥療效的發(fā)揮。經(jīng)現(xiàn)代藥學(xué)文獻(xiàn)研究，并結(jié)合處方藥味化學(xué)性質(zhì)和常用入藥方式，本研究擬對復(fù)方血竭跌打膏中續(xù)斷、延胡索、紅花、骨碎補(bǔ)4味藥材合提，將其提取液濃縮后以流浸膏入藥。復(fù)方血竭跌打膏中續(xù)斷辛溫破散，甘溫補(bǔ)益，既能活血化瘀，又能強(qiáng)筋壯骨[1]。其中，三萜皂苷類成分為續(xù)斷的主要活性成分[2]。藥理學(xué)研究表明續(xù)斷具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)免疫、神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)骨折愈合等作用[3-5]。延胡索具有活血散瘀、理氣止痛的功效，主要含有生物堿類化學(xué)成分，其中延胡索乙素作為其質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，止痛效果最強(qiáng)[6-8]。紅花是傳統(tǒng)的活血化瘀、祛瘀止痛的良藥，其中是醌式查耳酮碳苷與黃酮類化合物為主要功效物質(zhì)[9-10]。藥理學(xué)研究表明，羥基紅花黃色素A具有抗炎、抗腫瘤、抗血栓等多種活性，為紅花的質(zhì)量控制指標(biāo)[11-12]；骨碎補(bǔ)補(bǔ)腎強(qiáng)骨，行血脈，續(xù)筋骨，其中主要活性成分為柚皮苷，具有抗炎、促進(jìn)骨折愈合、抗骨質(zhì)疏松等作用[13-14]。

因此，本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以川續(xù)斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷的含量和出膏率為考察指標(biāo)，用AHP-CRITIC 混合加權(quán)法計(jì)算5 項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，并對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行綜合評分，考察提取溶劑、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對提取效果的影響，優(yōu)選出處方中續(xù)斷、延胡索、紅花、骨碎補(bǔ)的最佳合提工藝，為本復(fù)方下一步應(yīng)用劑型的改進(jìn)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器材料

1.1 儀器

本研究所用的主要儀器包括：Waters e2695 Alliance 高效液相色譜儀（2998 PDA 檢測器）；FW-100高速萬能粉碎機(jī)型（北京科偉永興儀器有限公司）；HH-S6A 電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；電風(fēng)鼓吹干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；BSA124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。）

1.2 藥材與試劑

本研究所用的藥材與試劑包括：續(xù)斷（批號(hào)：1801006）、延胡索（批號(hào)：1806003）、骨碎補(bǔ)（批號(hào)：1806001）、紅花（批號(hào)：1805004）飲片均購于安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)閆永紅教授鑒定，均符合2015 版《中華人民共和國藥典》規(guī)定；對照品延胡索乙素（批號(hào)：5066，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ（批號(hào)：5688，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）、羥基紅花黃色素A（批號(hào)：4261，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）、柚皮苷（批號(hào)：5562，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.0%）均購于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 吸液率考察

稱取處方量續(xù)斷、延胡索、紅花、骨碎補(bǔ)藥材飲片共26 g，加入1 000 mL水，測定藥材全部潤透時(shí)的吸液率。結(jié)果測得藥材吸液率為212%。因此，第一次提取時(shí)多加2倍量溶劑。

2.2 供試品溶液制備

按處方比例稱取續(xù)斷、延胡索、骨碎補(bǔ)、紅花共26 g，回流提取2 次，第一次加10 倍量50%乙醇，第二次加8 倍量50%乙醇，每次提取1 h，濾過，合并提取液，用50%乙醇定容至500 mL，搖勻，過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.3 含量測定方法的建立

2.3.1 色譜條件

川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷的檢測條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18column（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫：0～15 min，23%～30%乙腈；15～35 min，30%～40%乙腈；檢測波長：280 nm（柚皮苷），212 nm（川續(xù)斷皂苷Ⅵ）；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃，流速：1.0 mL·min-1。

羥基紅花黃色素A 的檢測條件：流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水；梯度洗脫：0～20 min，12%～20%乙腈；檢測波長：403 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1。

延胡索乙素的檢測條件：流動(dòng)相：乙腈-0.005%三乙胺水溶液；梯度洗脫：0～30 min，20%～70%乙腈；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1。

2.3.2 對照品母液的制備

分別取川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解配置成濃度為730 μg/mL 的川續(xù)斷皂苷Ⅵ、358 μg/mL的柚皮苷混合對照品母液。

取羥基紅花黃色素A 對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解配置成濃度為1 127 μg/mL 的羥基紅花黃色素A對照品母液。

取延胡索乙素對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解配置成濃度為418 μg/mL 的延胡索乙素對照品母液。

2.3.3 陰性樣品溶液制備

按處方比例分別稱取缺續(xù)斷、缺骨碎補(bǔ)、缺紅花、缺延胡索的其余三味藥材，用50%乙醇回流提取2次，第一次加10倍量溶劑，第二次加8倍量溶劑，每次1 h，合并2 次提取液，用50%乙醇定容至500 mL，搖勻，過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.3.4 專屬性考察

按照“2.1”“2.3.2”“2.3.3”項(xiàng)下方法，分別制備供試品溶液、對照品母液、陰性續(xù)斷樣品溶液、陰性骨碎補(bǔ)樣品溶液、陰性紅花樣品溶液和陰性延胡索樣品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，19 min左右，供試品溶液和川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液均出現(xiàn)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的特征吸收峰，而陰性續(xù)斷樣品溶液在此處無色譜峰；6 min 左右，供試品溶液和柚皮苷對照品溶液均出現(xiàn)柚皮苷特征吸收峰，而陰性骨碎補(bǔ)樣品溶液在此處無色譜峰；8 min 左右，供試品溶液和羥基紅花黃色素A 對照品溶液均出現(xiàn)特征吸收峰，而陰性紅花樣品溶液在此處無色譜法，表明此方法專屬性良好；23.6 min 左右，供試品溶液和延胡索乙素對照品溶液均出現(xiàn)延胡索乙素特征吸收峰，而陰性延胡索樣品溶液在此處無吸收峰；表明此方法專屬性良好。HPLC色譜圖見圖1～4。

2.3.5 線性關(guān)系考察

圖1 供試品溶液（A）、混合對照品溶液（B）和陰性續(xù)斷樣品溶液（C）的HPLC圖（212 nm）

圖2 供試品溶液（D）、混合對照品溶液（E）和陰性骨碎補(bǔ)樣品溶液（F）的HPLC色譜圖（280 nm）

分別精密量取一定量對照品母液，制備成系列不同濃度的川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素對照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄對照品峰面積。以對照品溶液濃度（x）和峰面積（y）進(jìn)行線性回歸，得到各成分回歸方程：川續(xù)斷皂苷Ⅵ：y=1992.2x-22183（r=0.9997），柚皮苷：y=15683x-18363（r= 0.9998），羥基紅花黃色素 A：y=26994x-361867（r=0.9995），延胡索乙素：y=9332.8x-11191（r= 0.9998）。研究結(jié)果表明：川續(xù)斷皂苷Ⅵ在73～730 μg/mL 范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系；柚皮苷在35.8～358 μg/mL 范圍內(nèi)濃度與峰面積面積呈良好的線性關(guān)系；羥基紅花黃色素A 在56.35～1 127 μg/mL 范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系；延胡索乙素在4.18～418 μg/mL 范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn)

圖3 供試品溶液（G）、羥基紅花黃色素A對照品溶液（H）和陰性紅花樣品溶液（I）（403 nm）

分別取一定濃度的川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素對照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定各指標(biāo)成分峰面積。結(jié)果，川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素峰面積的RSD 值分別為0.95%、0.56%、0.72%、1.26%，表明實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.1”項(xiàng)下制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣測定各指標(biāo)成分的峰面積。結(jié)果川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素峰面積的RSD值分別為1.55%、1.65%、0.85%、1.86%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖4 供試品溶液（J）、延胡索乙素對照品溶液（K）和延胡索陰性樣品溶液（L）的HPLC圖（280 nm）

取供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測定各指標(biāo)成分的峰面積。結(jié)果川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素峰面積的RSD值分別為0.68%、1.98%、0.86%、1.12%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 出膏率測定

精密吸取供試品溶液20.0 mL，置已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃烘箱中干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率（計(jì)算公式：出膏率＝干膏質(zhì)量(g)/藥材總質(zhì)量(g)×100%）[15]。

2.5 提取溶劑考察

按處方比例稱取延胡索、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、紅花26 g，6 份，分別用水、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇回流提取兩次，第一次加10 倍量溶劑，第二次加8 倍量溶劑，每次提取1 h，濾過，合并提取液，用相應(yīng)體積提取溶劑定容至500 mL，搖勻，過0.22 μm 的微孔濾膜，即得。表1為提取溶劑考察結(jié)果表。

由表1 可知，4 種指標(biāo)成分的含量和出膏率在用50%和70%乙醇提取時(shí)相對較高，因此，選擇50%、60%、70%作為提取溶劑的三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合提取溶劑考察結(jié)果、預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并考慮實(shí)際生產(chǎn)，固定提取次數(shù)為2次，選擇對提取效果影響較大的三個(gè)因素：乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間為考察因素，進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計(jì)。由于吸液率考察結(jié)果為212%，因此，在第一次提取時(shí)多加2 倍量提取溶劑。表2為因素水平表，表3為正交試驗(yàn)結(jié)果表。

表1 提取溶劑考察結(jié)果

表2 因素水平表

2.7 指標(biāo)權(quán)重的確立

2.7.1 AHP法計(jì)算權(quán)重系數(shù)[16-17]

AHP 法是一種解決多目標(biāo)復(fù)雜問題的定性與定量相結(jié)合的決策分析方法。該方法將定量分析與定性分析結(jié)合起來，用決策者的經(jīng)驗(yàn)判斷各衡量目標(biāo)能否實(shí)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)之間的相對重要程度，并合理地給出每個(gè)決策方案的各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的權(quán)數(shù)，利用權(quán)數(shù)求出各方案的優(yōu)劣次序。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)復(fù)方血竭跌打膏中各藥味君臣佐使配伍原則和藥味占比大小，將5 項(xiàng)考察指標(biāo)量化分為5 個(gè)層次，各指標(biāo)重要性由強(qiáng)到弱依次為川續(xù)斷皂苷Ⅵ＞延胡索乙素＞羥基紅花黃色素A＞柚皮苷＞出膏率，構(gòu)造5 個(gè)指標(biāo)兩兩比較判斷矩陣。表4為兩兩比較判斷矩陣。

由表4 兩兩比較判斷矩陣計(jì)算得出川續(xù)斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷、出膏率的權(quán) 重 系 數(shù) 分 別 為 0.4185、0.2625、0.1599、0.0973、0.0618，并進(jìn)行了一致性檢驗(yàn)，結(jié)果一致性比率（CR）＝0.0152＜0.10，表明通過AHP 法求得的各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)一致可靠。

2.7.2 CRITIC法計(jì)算權(quán)重[17]

CRITIC 法是以評價(jià)指標(biāo)間的對比強(qiáng)度和沖突性為基礎(chǔ)來確定指標(biāo)客觀權(quán)數(shù)的客觀賦權(quán)法。

評價(jià)指標(biāo)的對比強(qiáng)度用標(biāo)準(zhǔn)差（δj）表示，指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差越大，其所蘊(yùn)含的信息量越大；沖突性是以指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)為基礎(chǔ)，第j 個(gè)指標(biāo)與其他指標(biāo)的沖突性量化指標(biāo)為，其中rij為評價(jià)指標(biāo) i和j之間的相關(guān)系數(shù)。用cj表示第j個(gè)指標(biāo)所包含的信息量，計(jì)算公式為為同一指標(biāo)的評價(jià)數(shù)量），cj越大表明第j個(gè)指標(biāo)所包含的信息量越大，相對重要性也越大。第j 個(gè)指標(biāo)的客觀權(quán)重用ωj表示，計(jì)算公式為

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 兩兩比較判斷矩陣

將表3 中5 項(xiàng)考察指標(biāo)的正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理，5 項(xiàng)指標(biāo)均為越大越優(yōu)型，采用公式：yij-[xij-(xij)min]/[(xij)max-(xij)min]，然后計(jì)算相應(yīng)的對比強(qiáng)度（δj）、沖突性（fj）、信息量（cj）、指標(biāo)權(quán)重（ωj）。結(jié)果，用CRITIC 法計(jì)算出川續(xù)斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷、出膏率5 項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為：0.3004、0.1459、0.1602、0.1314、0.2621。表 5 為相關(guān)計(jì)算數(shù)據(jù)。

2.7.3 AHP-CRITIC混合加權(quán)法計(jì)算權(quán)重[18]

AHP 法求得的權(quán)重系數(shù)體現(xiàn)決策者的主觀經(jīng)驗(yàn)，CRITIC 法考慮到樣本數(shù)據(jù)存在的客觀信息，將兩者相結(jié)合，兼顧主客觀因素，AHP-CRITIC 混合加權(quán)法綜合權(quán)重計(jì)算公式為：ω綜合ij＝ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij。計(jì)算得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷、干膏率5 項(xiàng)指標(biāo)的綜合權(quán)重系數(shù)分別為0.5750、0.1752、0.1172、0.0585、0.0741。

2.7.4 綜合評分結(jié)果比較

本研究采用 AHP 法、CRITIC 法及 AHP-CRITIC 混合加權(quán)法計(jì)算求得的權(quán)重系數(shù)分別對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評分。對3 組綜合評分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果CRITIC 法與 AHP 法的相關(guān)系數(shù)為 0.878，CRITIC 法與混合加權(quán)法的相關(guān)系數(shù)為0.875，AHP 法與混合加權(quán)法的相關(guān)系數(shù)為0.995，三者相關(guān)性顯著（P＜0.01），說明通過AHP法、CRITIC 法及AHP-CRITIC 混合加權(quán)法得到的綜合評分結(jié)果具備一致性。對3種方法求得的權(quán)重系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果AHP 法與CRITIC 法的相關(guān)系數(shù)為0.425，兩者相關(guān)性不顯著（P＞0.05），說明所反映的信息不具疊加性。表6 為3 種賦權(quán)法綜合評分結(jié)果。

2.7.5 數(shù)據(jù)處理與分析

對AHP-CRITIC混合加權(quán)法求得的綜合評分進(jìn)行直觀分析和方差分析。表7 為直觀分析結(jié)果，表8 為方差分析結(jié)果。

由表7 直觀分析可知，各因素對崔氏速效損傷靈復(fù)方提取工藝的影響從大到小依次是：B＞A＞C，即溶劑用量＞乙醇濃度＞提取時(shí)間。方差分析結(jié)果表明，溶劑用量對提取工藝具有顯著影響（P＞0.05），而乙醇濃度和提取時(shí)間無顯著影響。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，選擇最佳工藝為：A3B3C2，即用10 倍量70%的乙醇回流提取2次，每次1.5 h。

表5 CRITIC法相關(guān)計(jì)算數(shù)據(jù)

表6 3種賦權(quán)法綜合評分結(jié)果

表7 直觀分析結(jié)果

表8 方差分析結(jié)果

3 提取工藝驗(yàn)證

稱取處方量的續(xù)斷、延胡索、骨碎補(bǔ)、紅花藥材3份，按優(yōu)選出的最佳提取工藝條件重復(fù)3次，測定各指標(biāo)，并進(jìn)行綜合評分，結(jié)果見表9。

由表9 可知，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均含量為3.4591%，RSD 為0.77%；延胡索乙素的平均含量為0.0861%，RSD 為0.64%；羥基紅花黃色素A 的平均含量為1.4690%，RSD 為1.70%；柚皮苷的平均含量為0.9429%，RSD 為1.18%；平均出膏率為29.1955%，RSD為0.52%；綜合評分均值為98.86，RSD 為0.65%，表明優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定可行，可用于復(fù)方血竭跌打膏的實(shí)際提取生產(chǎn)。

表9 工藝驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

4.1 評價(jià)指標(biāo)的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及2015版《中華人民共和國藥典》成方制劑記載，續(xù)斷、骨碎補(bǔ)在復(fù)方制劑中提取工藝有水提，也有醇提，延胡索多采用醇提，紅花多采用水提[19-21]，因此，本研究考察水和不同濃度的乙醇對四味藥材提取效果的綜合影響，選擇合適的提取溶劑。川續(xù)斷皂苷Ⅵ、延胡索乙素、羥基紅花黃色素A、柚皮苷分別為續(xù)斷、延胡索、紅花、骨碎補(bǔ)的主要有效成分，也是《中華人民共和國藥典》規(guī)定的含量測定成分，出膏率為中藥復(fù)方提取工藝研究的常用指標(biāo)。因此，本研究以4種成分的含量和出膏率作為評價(jià)指標(biāo)，多指標(biāo)成分綜合評價(jià)更能體現(xiàn)中藥復(fù)方的整體性、復(fù)雜性和有效性。

4.2 權(quán)重系數(shù)的確定方法

采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法時(shí)，各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)的賦予是綜合評分是否科學(xué)合理的關(guān)鍵[22]。層次分析法（AHP）是一種可將決策者的經(jīng)驗(yàn)予以量化，將定性和定量相結(jié)合，并對決策對象進(jìn)行優(yōu)劣排序、篩選的多目標(biāo)決策分析方法。但個(gè)人主觀因素對整個(gè)過程的影響很大，計(jì)算過程較粗糙，會(huì)忽略了實(shí)際樣本數(shù)據(jù)的信息。CRITIC 法適用于確定指標(biāo)客觀權(quán)重，能體現(xiàn)客觀數(shù)據(jù)信息。本實(shí)驗(yàn)通過加權(quán)求和的方式，將AHP法和CRITIC法相結(jié)合，兼顧主客觀因素，得到指標(biāo)的綜合評分，使得綜合評價(jià)更具有科學(xué)性、客觀性和準(zhǔn)確性。