基于分子印跡技術(shù)分離淡竹葉中異葒草苷的研究＊

朱俊訪，李 博，聶 陽(yáng)

（廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心 廣州 510520）

淡竹葉為禾本科植物淡竹葉（Lophatherum gracileBrongn）的干燥莖葉[1]，具有解熱、利尿、抗菌和抗腫瘤等藥理作用[2]。淡竹葉在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，具有良好的藥理活性且資源十分豐富。淡竹葉藥材含有豐富的碳苷黃酮[3]，包括牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷、日當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥黃素等，其中以異葒草苷含量較高[4]?，F(xiàn)有報(bào)道[5-6]表明，淡竹葉總黃酮具有清除自由基、抗氧化和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等藥理作用，其中葒草苷具有抗缺氧、保護(hù)心肌、抗血栓等作用，牡荊素具有抗心肌缺血等作用[7]，異葒草苷具有較強(qiáng)的抗氧化作用[8]。淡竹葉生長(zhǎng)周期短，更生能力旺，資源豐富，除藥用外，尚可用于食品、保健品等方面，值得充分開(kāi)發(fā)利用，因此，淡竹葉是一種具有廣闊開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的天然藥物。

傳統(tǒng)的中藥活性成分提取、純化方法主要是先采用有機(jī)溶劑提取，如竹葉黃酮常用的提取方法有回流提取、超聲提取等，然后通過(guò)層析、大孔吸附樹(shù)脂、重結(jié)晶、制備色譜等進(jìn)一步分離、純化，存在步驟多而繁瑣、溶劑消耗大、成本高、污染環(huán)境等方面的問(wèn)題[9-11]。因此針對(duì)傳統(tǒng)分離方法的缺點(diǎn)，有需要開(kāi)發(fā)一種有效、簡(jiǎn)便、選擇性高的分離新技術(shù)來(lái)解決這種高成本、低收率的問(wèn)題，分子印跡技術(shù)恰好滿足這一要求。分子印跡技術(shù)具有制備簡(jiǎn)單、成本廉價(jià)、能重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，尤其是特異的分子識(shí)別性能、高效率的富集與分離能力能夠使結(jié)構(gòu)類(lèi)似的物質(zhì)很容易得到分離，使中藥成分純化工藝得以簡(jiǎn)化，節(jié)省了溶劑的用量，減少了環(huán)境污染，因此，分子印跡聚合物在中藥活性成分的分離純化應(yīng)用中具有極大的發(fā)展空間[12-15]。

本研究利用分子印跡技術(shù)，以異葒草苷為模板分子，制備異葒草苷的分子印跡聚合物（MIPs），采用電鏡掃描對(duì)MIPs 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，對(duì)其吸附性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并研究了該聚合物對(duì)淡竹葉中黃酮類(lèi)成分異葒草苷的吸附分離效果。分子印跡技術(shù)具有強(qiáng)特異性及選擇性，在中藥有效成分研究中具有良好的應(yīng)用前景[16]，通過(guò)本研究以期為分子印跡聚合物在中藥有效成分分離上的應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究所用的材料與儀器包括：LC-2010A 高效液相色譜儀（日本島津儀器公司）；UV2600 紫外分光光度計(jì)（尤尼科儀器有限公司）；JSM7800掃描電鏡（日本電子株式會(huì)社）；AUY120 電子天平（日本島津儀器公司）；HH-4 恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；SB5200DTN 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；異葒草苷對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.26%，批號(hào)18020610），成都曼思特生物科技有限公司；淡竹葉（批號(hào)20160401，廣州市華宇藥業(yè)有限公司），經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院康大力副教授鑒定為淡竹葉；2-乙烯基吡啶（2-VP）、丙烯酰胺（AM）、偶氮二異丁氰（AIBN），科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），喬科化學(xué)有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 功能單體選擇及用量篩選

本研究采用紫外分光光度法考察異葒草苷與AM和2-VP 兩種功能單體在甲醇中的相互作用，通過(guò)紫外光譜的變化，對(duì)功能單體進(jìn)行篩選。在0.1 mmol·L-1異葒草苷溶液中分別加入不同濃度的AM 和2-VP，使異葒草苷與功能單體的比例分別為1∶2、1∶4、1∶6，充分振蕩后放置12 h，分別以相同濃度的功能單體做參比，測(cè)定紫外光譜，分析紫外光譜變化，分析確定最佳功能單體的種類(lèi)及配比。

為了確定模板分子與功能單體的最佳比例，固定制備工藝中除功能單體外的其他條件，通過(guò)改變功能單體的用量，分別制備印跡聚合物，根據(jù)所得聚合物的性狀及平衡吸附量（Q）來(lái)判斷功能單體最佳用量。

1.3 印跡聚合物的制備[17]

稱(chēng)取1.5 mmol 異葒草苷溶解于25 mL 甲醇/氯仿（2∶3）中，超聲振蕩10 min，再加入一定量的功能單體2-VP，超聲振蕩10 min靜置30 min，加入30 mmol交聯(lián)劑EDMA，加入50 mg 引發(fā)劑AIBN，充分混勻超聲振蕩10 min，通氮?dú)?5 min，密封，置于65℃水浴中聚合24 h，得果凍塊狀聚合物。將聚合物取出晾干后研磨，粉末過(guò)120目篩后放入索氏提取器中，用甲醇-冰醋酸（9∶1，V/V）回流提取，直至提取液在360 nm下無(wú)模板分子吸收，再用甲醇洗去殘留的冰醋酸，粉末晾干后真空干燥24 h 后備用，得異葒草苷的分子印跡聚合物。空白印跡聚合物（NIPs）的制備除了不加模板分子異葒草苷外，其余步驟同MIPs的制備。使用掃描電鏡測(cè)定所得異葒草苷MIPs和NIPs的外貌形態(tài)并進(jìn)行分析。

1.4 印跡聚合物靜態(tài)吸附性能實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取40 mg 的異葒草苷印跡聚合物10 份，分別放入25 mL具塞錐形瓶中，分別加入用甲醇配制的濃度為0.01 mmol·L-1、0.02 mmol·L-1、0.03 mmol·L-1、0.04 mmol·L-1、0.05 mmol·L-1、0.06 mmol·L-1、0.07 mmol·L-1、0.08 mmol·L-1、0.09 mmol·L-1和 0.10 mmol·L-1的異葒草苷對(duì)照品溶液，室溫振蕩24 h，取吸附后的溶液進(jìn)行離心、過(guò)濾，濾液于360 nm 處測(cè)定吸光度?？瞻拙酆衔锏撵o態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的處理和操作同上。根據(jù)吸附前后溶液中模板分子異葒草苷的濃度變化計(jì)算分子印跡聚合物的吸附量（Q），并繪制等溫吸附曲線，計(jì)算公式見(jiàn)公式（1）。

上式中Q為平衡吸附量（μmol/g），C0為溶液中異葒草苷的起始濃度（μmol/L），Ce為平衡時(shí)溶液中異葒草苷的濃度（μmol/L），V為溶液體積（mL），W為印跡聚合物的質(zhì)量（g）。

1.5 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

取二支玻璃色譜柱分別加入2.5 g干燥的MIPs，得異葒草苷的MIPs 填充柱A 柱和B 柱，另外再取一玻璃色譜柱加入2.5 g NIPs 為C 柱，分別以甲醇平衡色譜柱。分別吸取濃度為0.10 mmol·L-1的異葒草苷對(duì)照品溶液0.5 mL 加至平衡后的萃取柱MIPs-A 柱、MIPs-B 柱和NIPs-C柱。MIPs-A柱先用甲醇進(jìn)行淋洗，收集洗脫液，每份2 mL，再用甲醇-冰醋酸（9∶1）洗脫，收集洗脫液，每份2 mL。MIPs-B 柱直接用甲醇-冰醋酸（9∶1）洗脫，收集洗脫液，每份2 mL。NIPs-C柱用甲醇進(jìn)行淋洗，收集洗脫液，每份2 mL。在360 nm 處分別測(cè)定各洗脫液吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分別繪制MIPs-A柱與MIPs-B柱、MIPs-A柱與NIPs-C柱的洗脫曲線。

1.6 淡竹葉提取液的制備

取淡竹葉100 g，粉碎后過(guò)50 目篩，使用80%乙醇浸泡提取24 h，提取3 次，合并提取液并濃縮至無(wú)醇味，使用等體積石油醚萃取3次，合并水相并濃縮得浸膏[18]。用甲醇超聲溶解上述浸膏，過(guò)濾，定容至25 mL容量瓶中，得供試品溶液（含異葒草苷37.6%）。

1.7 HPLC分析

吸取淡竹葉提取液上樣，用甲醇洗脫，分別收集MIPs 柱和NIPs 柱洗脫液。使用以下色譜條件進(jìn)行分析，考察MIPs對(duì)淡竹葉中異葒草苷的分離效果。

表1 流動(dòng)相梯度表

色譜條件：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇和0.5%醋酸水溶液，按表1 進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫25℃，體積流量為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能單體選擇

功能單體在聚合物制備過(guò)程中，主要是與模板分子通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)作用形成復(fù)合物，模板分子和功能單體在聚合前能否形成穩(wěn)定的復(fù)合物是獲得高選擇性分子印跡聚合物的關(guān)鍵，因此，選擇合適功能單體種類(lèi)及確定功能單體用量至關(guān)重要。增加功能單體的用量，會(huì)使模板分子和功能單體的預(yù)組裝更完全，但用量過(guò)大單體自身會(huì)發(fā)生締合，影響印跡聚合物中特異性結(jié)合位點(diǎn)的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法來(lái)確定最佳功能單體的種類(lèi)和配比。根據(jù)紫外光譜原理，價(jià)電子與氫原子形成氫鍵，電子能量發(fā)生變化，分子軌道發(fā)生扭曲變形，電子躍遷概率發(fā)生變化，這些原因?qū)е挛舛劝l(fā)生變化。因此，通過(guò)比較紫外光譜的變化，可推測(cè)模板分子與功能單體間相互作用強(qiáng)度和配比等信息。

模板分子異葒草苷結(jié)構(gòu)具有多個(gè)酚羥基，具有一定的酸性，羰基氧原子上的未共用電子對(duì)有微弱的堿性。理論上，選擇堿性功能單體更有利于模板分子和功能單體形成穩(wěn)定的復(fù)合物，因此以AM 和2-VP 為備選功能單體。使用紫外分光光度法分別對(duì)0.1 mmol·L-1異葒草苷、異葒草苷：AM（1∶2、1∶4、1∶6）的和異葒草苷：2-VP（1∶2、1∶4、1∶6）進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。可以看出異葒草苷與不同比例的2-VP 混合后，在250-290 nm 范圍內(nèi)的吸收曲線發(fā)生了明顯變化，吸光值隨2-VP 濃度增大而減小，說(shuō)明模板分子與2-VP 之間有較強(qiáng)的作用力。異葒草苷與不同比例的AM 混合后，紫外圖譜沒(méi)有發(fā)生明顯變化，說(shuō)明模板分子與功能單體作用較弱。由此可推斷2-VP 是一種較理想的功能單體，這可能是由于其與模板分子間存在氫鍵及酸堿作用，因此產(chǎn)生了較好的識(shí)別位點(diǎn)。

2.2 功能單體用量篩選

固定制備工藝中模板分子用量為1.5 mmol、交聯(lián)劑的用量為30 mmol，將功能單體的用量分別設(shè)為3 mmol、6 mmol、9 mmol 和 12 mmol，分別制備印跡聚合物，記錄所得聚合物的性狀，計(jì)算平衡吸附量（Q）。結(jié)果見(jiàn)表2，不同的功能單體用量制備得到1-4 號(hào)MIPs，其中1-3 號(hào)聚合物為果凍狀固體，而4 號(hào)聚合物由于添加的功能單體較多所形成的聚合物結(jié)構(gòu)不夠緊密因此為膠狀。所以綜合1-4 號(hào)MIPs 的性狀和Q值可判斷較佳工藝為3 號(hào)，即印跡分子異葒草苷的量為 1.5 mmol，功能單體 2-VP 的量為 9 mmol，交聯(lián)劑EDMA的量為30 mmol。

圖1 異葒草苷與不同濃度功能單體的紫外光譜

表2 功能單體用量篩選

2.3 聚合物表面形態(tài)研究

掃描電鏡是一種微觀形貌觀察手段，主要是利用二次電子信號(hào)成像來(lái)觀察樣品的表面形態(tài)。使用掃描電鏡對(duì)制備所得異葒草苷MIPs 和NIPs 的表面形態(tài)進(jìn)行測(cè)定，研究聚合物的微觀結(jié)構(gòu)以及表面的形態(tài)差異，對(duì)聚合物的聚合情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。由圖2可以看出，異葒草苷MIPs 和NIPs 的表面形態(tài)具有較大差異，NIPs 的表面較為光滑、均一、質(zhì)地緊密，而異葒草苷MIPs 表面較為粗糙、具有大量的小孔，這可能是由于異葒草苷MIPs 中模板分子被洗脫后留下的“印跡”空穴，正是這些空穴使得該MIPs具有了特殊的吸附性和選擇性，因此這更有利于對(duì)模板分子的吸附。

2.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

通過(guò)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究異葒草苷在印跡聚合物和非印跡聚合物上的吸附行為，使用吸附量對(duì)平衡濃度作圖，得吸附等溫線見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)在所研究的濃度范圍內(nèi)，MIPs 對(duì)異葒草苷具有一定的吸附能力，吸附量隨著溶液濃度的升高逐漸增大，最大吸附量可達(dá) 2.5 μmol?g-1，在相同濃度下 NIPs 對(duì)異葒草苷的吸附相對(duì)較小。隨濃度的增加，MIPs和NIPs吸附量之差越來(lái)越大，推測(cè)MIPs對(duì)目標(biāo)分子具有選擇性的吸附能力，而NIPs 不存在這種特異性的結(jié)合位點(diǎn)，且對(duì)模板分子只有弱的非選擇性吸附，因此，NIPs 對(duì)目標(biāo)分子吸附能力較差。

圖2 分子印跡聚合物的SEM圖片

圖3 印跡聚合物的等溫結(jié)合曲線

2.5 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

MIPs-A 柱、MIPs-B 柱和 NIPs-C 柱分別使用 0.10 mmol/L 異葒草苷對(duì)照品溶液上樣，使用分光光度法分別測(cè)定異葒草苷在相同MIPs 柱不同洗脫液及MIPs 柱與NIPs 柱間的洗脫保留情況，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。圖4-①為MIPs 柱與NIPs柱上樣后使用甲醇洗脫的泄露曲線圖，由圖可看出NIPs 柱比MIPs 柱更早出峰且峰型更窄，這是由于模板分子異葒草苷在MIPs中具有特異的結(jié)合位點(diǎn)，而在NIPs 中不具有這種結(jié)合位點(diǎn)，因此，異葒草苷在MIPs 柱上的保留時(shí)間更長(zhǎng)。圖4-②為MIPs 柱使用不同洗脫液洗脫的泄露曲線，MIPs-A 柱先使用甲醇洗脫、再用甲醇∶冰醋酸（9∶1）洗脫，相比MIPs-B 柱只使用甲醇進(jìn)行洗脫，MIPs-A 柱在洗脫后期多出一個(gè)峰，這是由于MIPs 對(duì)模板分子異葒草苷具有一定的吸附能力，在使用更強(qiáng)的洗脫劑甲醇∶冰醋酸（9∶1）時(shí)被更集中的洗脫下來(lái)。通過(guò)對(duì)比動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果，可以說(shuō)明制備所得MIPs 對(duì)模板分子異葒草苷具有一定的吸附能力且吸附能力比NIPs強(qiáng)。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

使用1.7 項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定異葒草苷的系列濃度的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測(cè)定3次，對(duì)平均峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性分析，計(jì)算得回歸方程y=251960x+251712（r=0.9991）。結(jié)果顯示異葒草苷在17.44-52.32 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取異葒草苷對(duì)照品溶液10 μL，采用1.7 項(xiàng)的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定異葒草苷峰面積，經(jīng)計(jì)算RSD=0.22%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.6.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一供試品溶液5份，在1.7項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄異葒草苷的峰面積，經(jīng)計(jì)算RSD=2.38%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別于0 h，2 h，4 h，8 h，16 h進(jìn)樣10 μL，記錄異葒草苷的峰面積，經(jīng)計(jì)算RSD=1.35%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱(chēng)取已知含量的供試品6份，分別加入適量的異葒草苷對(duì)照品，按1.6 項(xiàng)操作制備供試品溶液，在1.7 項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定峰面積，計(jì)算異葒草苷的平均回收率為99.1%，RSD=1.40%。

2.7 淡竹葉中異葒草苷分離研究

圖4 異葒草苷的動(dòng)態(tài)吸附曲線

圖5 淡竹葉提取液高效液相色譜圖

圖6 淡竹葉洗脫液高效液相色譜圖

淡竹葉中含有多種黃酮類(lèi)化合物，其中以異葒草苷含量較高，圖5 為淡竹葉提取液（含異葒草苷37.6%）使用1.7 項(xiàng)下色譜條件得到的高效液相色譜圖，圖6 為淡竹葉提取液經(jīng)過(guò)MIPs 柱洗脫所得的中段洗脫液（含異葒草苷83.6%）在同一色譜條件下所得的高效液相色譜圖。對(duì)比兩色譜圖可以看出，淡竹葉提取液經(jīng)MIPs 柱洗脫后的中段洗脫液除異葒草苷外其他色譜峰明顯減少，異葒草苷含量提高了46%，這可能是由于MIPs 對(duì)淡竹葉提取液中的異葒草苷具有一定的選擇性吸附能力，而對(duì)淡竹葉中的其他成分沒(méi)有選擇性吸附。淡竹葉中的其他成分在MIPs 柱中的保留時(shí)間較短，主要在洗脫前期被洗脫下來(lái)，而異葒草苷保留時(shí)間較長(zhǎng)洗脫較慢。因此，說(shuō)明MIPs柱對(duì)淡竹葉提取液中的異葒草苷存在一定的純化能力。

將淡竹葉提取液分別過(guò)MIPs 柱和NIPs 柱，收集洗脫液，洗脫液進(jìn)行HPLC 分析，以異葒草苷為指標(biāo)考察聚合物對(duì)異葒草苷的分離效果。以異葒草苷的百分含量為縱坐標(biāo)，洗脫體積為橫坐標(biāo)，作異葒草苷在MIPs 柱和NIPs 柱的洗脫曲線圖，見(jiàn)圖7。通過(guò)比較兩條曲線可以看出，由于MIPs柱對(duì)異葒草苷具有特異性吸附性能力，異葒草苷在MIPs 柱的保留時(shí)間要比在NIPs 柱長(zhǎng)，因此可將該MIPs 用于異葒草苷的分離純化。

3 討論

本研究制備了異葒草苷分子印跡復(fù)合物，并對(duì)該聚合物的表面形態(tài)和吸附性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該分子印跡復(fù)合物對(duì)異葒草苷有較好的結(jié)合性能與分離能力，這是由于MIPs與模板分子異葒草苷之間存在多個(gè)相互作用的位點(diǎn)和相互匹配的空間，且形成了氫鍵等非共價(jià)鍵，使得MIPs對(duì)模板分子具有較強(qiáng)的吸附能力。制備的分子印跡聚合物能有效的富集淡竹葉中的異葒草苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)83.6%，與傳統(tǒng)方法相比，分子印跡聚合物在分離的效率、效果上有明顯的提高，不過(guò)與制備色譜的分離結(jié)果相比[11]，在純度上仍存在一些差距。雖然制備色譜能達(dá)到很好的分離純化效果，但也存在成本高、應(yīng)用不便等問(wèn)題。因此制備所得異葒草苷分子印跡聚合物的吸附性能還有待進(jìn)一步提高，可考慮進(jìn)一步優(yōu)化制備條件、引入先進(jìn)的制備方法，或者結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)來(lái)提高合成和研發(fā)效率。

圖7 淡竹葉中異葒草苷的洗脫曲線圖

本研究為淡竹葉中異葒草苷的提取分離提供了新的方法，也為中藥有效成分的分離純化提供了新的思路。分子印跡技術(shù)具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、周期短、穩(wěn)定性好、選擇性好、消耗少等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于中藥有效成分的分離純化，可以提高分離效率，減少溶劑用量，并有助于推動(dòng)綠色中藥的發(fā)展。但是，分子印跡技術(shù)在其應(yīng)用過(guò)程中仍然存在一些問(wèn)題，如水相中分子印跡聚合物的不相容性、結(jié)合位點(diǎn)不均勻、模板滲漏等，因此，分子印跡技術(shù)在中藥方面的應(yīng)用有待更進(jìn)一步的研究。