原發(fā)性膽汁性膽管炎患者肝組織中自然殺傷細(xì)胞活化性受體及其配體的表達(dá)及意義

余海燕， 韋進(jìn)香， 付海艷， 楊依娜， 涂榮芳， 唐映梅

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 昆明 650101

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是以進(jìn)行性肝內(nèi)小膽管非化膿性炎癥為特征的慢性膽汁淤積性自身免疫性肝病。近年來，我國PBC的發(fā)病率顯著增加[1]。但是目前PBC的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。

NK細(xì)胞活化性受體(NK cell activating receptor，NKG2D)為目前研究較清楚的NK細(xì)胞的活化性受體之一，MHC-Ⅰ類(MHC class Ⅰchain-related molecule，MIC)是最早被發(fā)現(xiàn)且研究較充分的NKG2D受體的配體。NK細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)可能是PBC初始階段的關(guān)鍵[2]。有研究[3]表明，阻斷NKG2D可降低NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和IFNγ的產(chǎn)生，阻斷IL-10可增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和IFNγ的產(chǎn)生。IL-15可誘導(dǎo)先天性和適應(yīng)性淋巴細(xì)胞亞群上NKG2D的表達(dá)[4]。本實(shí)驗(yàn)著重探討單核細(xì)胞是否通過NKG2D/MICA及細(xì)胞因子途徑參與PBC發(fā)病，為闡明PBC的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年8月-2015年6月在本院住院且確診為PBC(PBC組，n=30)、慢性乙型肝炎(CHB組，n=15)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD組，n=10)患者的肝穿刺活檢標(biāo)本。PBC的診斷符合美國肝病學(xué)會2009年修訂的PBC診療指南[5]，CHB的診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[6]，NAFLD的診斷符合2010年修訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)》[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：自身免疫性肝炎，原發(fā)性硬化性膽管炎，病毒性肝炎，肝豆?fàn)詈瞬∽兊冗z傳代謝性疾病，酒精性肝病，肝、膽、脾和其他器官的占位性病變，其他引起肝脾腫大的相關(guān)疾病，嚴(yán)重的心肺疾病。

1.2 試劑 鼠抗人NKG2D、IL-15、IFNγ單克隆抗體、兔抗人IL-10、MICA多克隆抗體(美國GeneTex公司)；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗(武漢谷歌生物科技有限公司)；蘇木素液(武漢博士德生物工程有限公司)；檸檬酸鹽抗原修復(fù)液/EDTA(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.3 結(jié)果判斷 根據(jù)肝組織HE染色結(jié)果，按照我國慢性肝炎的病理學(xué)分級、分期判斷肝臟標(biāo)本的肝臟炎癥活動度(G)和纖維化程度(S)，分析各表達(dá)因子與肝內(nèi)炎癥的關(guān)系。肝臟炎癥活動度分級和纖維化程度分期標(biāo)準(zhǔn)參見《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[6]。

采用SP法行免疫組化染色。各指標(biāo)細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核和/或細(xì)胞膜有棕黃色顆粒為陽性表達(dá)；根據(jù)染色細(xì)胞多少及染色深淺計算染色評分，判斷各指標(biāo)表達(dá)情況。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)染色深淺將所有細(xì)胞分為4個等級：A不著色，0分；B淺黃色，1分；C棕黃色，2分；D棕褐色，3分。每個視野中陽性細(xì)胞A、B、C、D所占的百分?jǐn)?shù)分別為a、b、c、d；細(xì)胞的染色評分按A×a+B×b+C×c+D×d計算。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究通過昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(批號:審-PJ-2019-38)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 3組患者一般資料見表1。

表1 3組患者的一般資料比較

2.2 NKG2D表達(dá)情況 CHB組與NAFLD組肝組織中NKG2D均陰性表達(dá)。PBC組：NKG2D陽性表達(dá)主要位于匯管區(qū)(50%)及中央靜脈(10%)與匯管區(qū)之間(40%)，且NKG2D的表達(dá)隨炎癥程度加重而上升，G3～4級者明顯高于G1～2級者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(G1 vs G2 vs G3 vs G4：1.4±0.05 vs 1.56±0.05 vs 1.86±0.11 vs 2.60±0.17,F=150.8,P<0.05)；隨纖維化程度加重而下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(S3 vs S4：2.30±0.17 vs 1.56±0.05,t=-1.52 ,P<0.05)(圖1)。

注:a,CHB組；b,NAFLD組；c,PBC組。

2.3 MICA表達(dá)情況 CHB組、NAFLD組及PBC組G1～2級MICA均為陰性表達(dá)。PBC組:G3～4級MICA的陽性細(xì)胞主要位于匯管區(qū)(60%)及中央靜脈與匯管區(qū)之間(40%)，G3與G4級比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.11±0.01 vs 0.20±0.03，t=-2.20，P>0.05)，S3與S4級比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.12±0.02 vs 0.18±0.03,t=-2.64，P>0.05)(圖2)

2.4 IL-15表達(dá)情況 IL-15在NAFLD組陰性表達(dá)，在CHB組與PBC組肝內(nèi)表達(dá)。PBC組:IL-15的陽性細(xì)胞主要位于匯管區(qū)(60%)及中央靜脈與匯管區(qū)之間(30%)，炎癥程度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(G1 vs G2 vs G3 vs G4：0.70±0.10 vs 1.50±0.10 vs 1.93±0.11 vs 2.60±0.17，F(xiàn)=251.3，P<0.05)，纖維化程度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(S3 vs S4：2.00±0.05 vs 2.40±0.30，t=-1.62，P>0.05)。CHB組IL-15的表達(dá)：炎癥程度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(G1 vs G2 vs G3：0.73±0.15 vs 1.96±0.15 vs 2.50±0.17,F=150，P<0.05)，纖維化程度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(S1 vs S2 vs S3：0.70±0.10 vs 21.96±0.15 vs 2.50±0.17,F=158.7，P<0.05)(圖3)。

2.5 IL-10表達(dá)情況 NAFLD組、CHB組G3～4級及PBC組G2～4級IL-10均陰性表達(dá)。PBC組：IL-10的陽性細(xì)胞主要位于匯管區(qū)(60%)及中央靜脈與匯管區(qū)之間(20%)，且僅G1期表達(dá)(0.16±0.01)。CHB組G1、G2級均表達(dá)IL-10，炎癥程度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(G1 vs G2：0.19±0.01 vs 0.13±0.01，t=-1.522，P>0.05)(圖4)。

2.6 IFNγ表達(dá)情況 3組IFNγ均為陰性表達(dá)(圖5)。

2.7 PBC組IL-15、IL-10、IFNγ表達(dá)與肝功能的相關(guān)性分析 PBC患者肝組織IL-15的表達(dá)與ALP、GGT水平均呈正相關(guān)(r值分別為0.241、0.407，P值分別為0.014、0.045)(圖6)。

注：a，CHB組；b，NAFLD組；c，PBC組。

注：a，CHB組；b，NAFLD組；c，PBC組。

注：a，CHB組；b，NAFLD組；c，PBC組。

圖6 PBC患者IL-15表達(dá)與ALP、GGT相關(guān)性

3 討論

近年來，天然免疫在PBC發(fā)病中的作用日益受到重視[8]。NK細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)在PBC的早期階段至關(guān)重要[9]。前期研究[10]也發(fā)現(xiàn)，PBC患者肝內(nèi)NK細(xì)胞功能增強(qiáng)，提示NK細(xì)胞上游存在調(diào)節(jié)機(jī)制，但目前PBC時NK細(xì)胞如何被激活的機(jī)制仍不清楚，需進(jìn)一步探究。

NKG2D是NK細(xì)胞特異性基因家族中的一個基因編碼，可與MICA結(jié)合，且主要表達(dá)在有免疫活性的細(xì)胞上(如NK細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+T淋巴細(xì)胞表面)，可為NK細(xì)胞同時提供完全激活信號和協(xié)同刺激信號，通過增強(qiáng)殺傷作用，參與天然免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)中NKG2D主要表達(dá)于PBC肝臟匯管區(qū)，與PBC非化膿性小膽管炎癥及破壞、膽管增生的病理特征一致。PBC患者肝組織中高表達(dá)NKG2D，且隨著炎癥程度加重而上升，隨纖維化程度加重而下降，提示NKG2D可能參與了PBC的早期發(fā)病，而PBC晚期NK細(xì)胞活性則受到抑制。前期研究[11]亦表明，PBC患者外周血NK細(xì)胞比例低于正常對照組，以CD56+NK亞群為主，由于CD56+NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用，提示NK細(xì)胞可能主要以免疫調(diào)節(jié)參與PBC的發(fā)病。

MICA在表達(dá)異常時被NKG2D識別并結(jié)合，啟動NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在自身免疫性疾病中，異常表達(dá)的MICA分子，可能導(dǎo)致NK細(xì)胞異?；罨瘡亩l(fā)自身免疫反應(yīng)[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)PBC患者肝組織MICA表達(dá)明顯升髙，且隨著炎癥及纖維化程度的加重呈上升趨勢，提示PBC患者M(jìn)ICA異常表達(dá)，巨噬細(xì)胞處于“應(yīng)激”狀態(tài)，參與免疫反應(yīng)。PBC患者肝組織中MICA的表達(dá)升高，NKG2D表達(dá)亦升高。因此，單核細(xì)胞與NK細(xì)胞之間可能通過NKG2D/MICA途徑參與PBC的發(fā)生發(fā)展。此外，MICA的表達(dá)較NKG2D的表達(dá)減少，可能是細(xì)胞上的抑制性受體與單核細(xì)胞上一部分MICA結(jié)合干擾所致，或是持續(xù)上調(diào)的NKG2D負(fù)反饋調(diào)節(jié)MICA，這提示可能還有其他因素影響NKG2D的活化。

外源性HBsAg刺激了CHB患者NK細(xì)胞NKG2D表達(dá)[13]。本研究中CHB組NKG2D、MICA均為陰性表達(dá)，可能是因?yàn)榧{入的慢性乙型肝炎患者均治療過，且慢性乙型肝炎免疫激活期患者NK細(xì)胞活化受體NKG2D的表達(dá)、IFNγ和TNFα的產(chǎn)生分別低于免疫耐受期[14]。

IL-15能誘導(dǎo)NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時還能增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的存活，促進(jìn)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)IL-15在PBC患者肝臟中表達(dá)，隨炎癥程度加重呈上升趨勢。其次，IL-15的表達(dá)與血清GGT和ALP的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。有研究[15]表明，IL-15激動劑可使CD8+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)IFNγ和TNFα分泌增加，并上調(diào)CD8+T淋巴細(xì)胞上NKG2D的表達(dá)。

肝內(nèi)單核巨噬細(xì)胞被HBV抗原活化導(dǎo)致IL-15大量釋放，而增高的IL-15反過來刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，其通過介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用直接參與自身免疫病理過程[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中CHB組IL-15高表達(dá)，且隨著炎癥程度和纖維化程度的加重呈上升趨勢。有研究[17]表明，抗病毒藥物替比夫定可通過上調(diào)IL-15和NKG2D來恢復(fù)CD56 NK細(xì)胞的功能。因此，提示IL-15可能參與PBC的發(fā)生發(fā)展，且在膽管上皮細(xì)胞的損傷中具有一定作用，但I(xiàn)L-15在PBC中的具體作用及機(jī)制需進(jìn)一步研究探索。

NK細(xì)胞表達(dá)IL-10和IL-10受體，單獨(dú)的IL-10對NK細(xì)胞毒性具有顯著影響，在IL-15存在下，其可增加NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性[18]。其次，IL-10作為一種免疫抑制和抗炎細(xì)胞因子，內(nèi)源性IL-10在維持免疫耐受中起關(guān)鍵作用，外源性IL-10會加劇肝臟炎癥和纖維化[19]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-10在PBC組、CHB組表達(dá)，提示IL-10可能在肝內(nèi)炎癥及纖維化發(fā)生的進(jìn)程中發(fā)揮一定作用，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

PBC患者中由NK細(xì)胞合成的IFNγ、IL-6和IL-8的水平顯著降低，且NK細(xì)胞頻率的降低和NKG2A的增加可能通過IFNγ分泌減少而導(dǎo)致細(xì)胞毒活性降低，有助于恢復(fù)NK細(xì)胞相關(guān)免疫力[20-21]。IFNγ的缺失降低了肝臟中炎性巨噬細(xì)胞的頻率，并減輕了肝纖維化[22]。而NK細(xì)胞上IL-15受體的上調(diào)可能促進(jìn)IFNγ的產(chǎn)生[23]。本研究3組中IFNγ均陰性表達(dá)，PBC患者高表達(dá)的NKG2D、IL-15可能通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致IFNγ表達(dá)減少，但需進(jìn)一步深入研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PBC肝內(nèi)表達(dá)NKG2D，同時在晚期表達(dá)MICA，提示可能通過NKG2D/MICA促進(jìn)NK細(xì)胞的活化，并介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用，調(diào)節(jié)肝內(nèi)炎癥反應(yīng)的程度，進(jìn)而引起膽管上皮的損傷，從而參與PBC的發(fā)生發(fā)展。其相關(guān)細(xì)胞因子分泌異常在PBC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，但細(xì)胞因子之間的相互調(diào)節(jié)作用需要進(jìn)一步深入探究。因此，NKG2D/MICA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化通路可能是PBC治療的一個靶點(diǎn)，而IL-15可能作為一個輔助診斷PBC的指標(biāo)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：余海燕、楊依娜參與撰寫論文，修改論文，資料分析；韋進(jìn)香收集數(shù)據(jù)，研究過程及數(shù)據(jù)分析；付海艷指導(dǎo)撰寫文章，負(fù)責(zé)擬定寫作思路；涂榮芳參與資料分析；唐映梅負(fù)責(zé)課題設(shè)計，最后定稿。