微量元素Se的生物活性及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

馬風(fēng)偉，許 粟，程永友，陳海江，費(fèi) 強(qiáng)，馬立志

(1.貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550005)

硒(Selenium，Se)為人體不可缺少的微量元素，其最早引起人們的注意是因其過量攝入而產(chǎn)生的毒副作用，過量的硒攝入會產(chǎn)生呼氣大蒜味、腹痛、嚴(yán)重者呼吸困難并導(dǎo)致死亡。[1]Schwarz等[2]在1957年提出動物體內(nèi)缺硒與蛋白質(zhì)不良癥密切相關(guān)，硒作為人體的必需微量元素被人們關(guān)注。1981年我國黑龍江省克山縣發(fā)生的地方性心臟病—“克山病”被證實(shí)為缺硒所致，硒與人類健康的關(guān)系受到越來越多的重視。[3]硒作為和硫(Sulphur，S)元素同族的元素，其物理化學(xué)性質(zhì)與S元素有相似性，也有多個價態(tài)，在自然界的存在方式可呈現(xiàn)出有機(jī)態(tài)和無機(jī)態(tài)，不同的硒價態(tài)和形態(tài)與生物活性差別很大。[4]人體對硒的日需求適宜量為60～250 μg[5-6]，相對于常量營養(yǎng)元素，如此微量的需求對分析檢測技術(shù)的要求很高，為了準(zhǔn)確定量食物中硒的含量，研究者開發(fā)了多種檢測手段，從最初的滴定法、化學(xué)比色法到最新的質(zhì)譜分析，對硒的檢測也是從微量到痕量。[7]本文對硒的生物活性以及分析檢測進(jìn)行綜述，以期為硒相關(guān)的深入研究提供參考。

1 硒的存在形式

圖1 常見的硒化合物

2 硒的生物活性

2.1 硒的毒性

圖2 亞硒酸鹽在機(jī)體內(nèi)的代謝途徑

2.2 硒的益處

雖然過量的硒對人體有毒害作用，但硒作為人體必需的微量元素是機(jī)體內(nèi)很多酶和蛋白的活性中心，對人體正常機(jī)能的正常運(yùn)行起到非常重要的作用[13]，如抗氧化[14]、抗癌、免疫調(diào)節(jié)[15]、維護(hù)甲狀腺功能、重金屬解毒等。

2.2.1 抗氧化作用

GSH-Px是人體重要的過氧化物分解酶，其活性中心就是硒代半胱氨酸[16]，機(jī)體內(nèi)GSH-Px活力的大小可以反映出人體是否缺硒。人體GSH-Px酶系可分為4種[17-19]，分別為胞漿GSH-Px(GPX1，由203個氨基酸組成，活性中心為U49)、血漿GSH-Px(GPX3，由226個氨基酸組成，活性中心為U73)、磷脂氫過氧化物GSH-Px(GPX4，由197個氨基酸組成，活性中心為U73)和胃腸道專屬性GSH-Px(GPX2，由190個氨基酸組成，活性中心為U40)。GSH-Px在人體內(nèi)的作用主要是分解過氧化物，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的羥基化合物，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整和功能。

注：*為活性催化中心-硒代半胱氨酸圖3 人類4種谷胱甘肽過氧化物酶的氨基酸序列

2.2.2 抗癌作用

硒元素的抗癌機(jī)理雖然并不完全清楚，但流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)癌癥高發(fā)區(qū)居民的血硒水平普遍偏低，同時發(fā)現(xiàn)癌癥組織中硒蛋白P的含量較正常組織低。[20-21]硒元素抗癌的作用機(jī)理可能有以下幾個方面：a硫氧還蛋白還原酶1(Thioredoxin reductase 1, TrxR1)作為一個含硒蛋白可以激活腫瘤抑制因子p53蛋白的表達(dá)；[22]b位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的硒蛋白15(Selenoprotein 15，Sep15)被發(fā)現(xiàn)在多個腫瘤組織細(xì)胞中的表達(dá)減少，其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用；[23]c谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px2分布于小腸上皮細(xì)胞，可通過上調(diào)Nrf2/Keap1(NF-E2-related factor 2/Kelch-like ECH-associated protein 1)信號通路的表達(dá)對致癌物進(jìn)行脫毒，對結(jié)腸癌的發(fā)生有預(yù)防作用。[24]

2.2.3 免疫調(diào)節(jié)作用

在機(jī)體內(nèi)，硒存在于多種免疫器官中，如胸腺、骨髓、脾、淋巴結(jié)等；在細(xì)胞內(nèi)，硒存在于多種免疫細(xì)胞中，如淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等。[25]機(jī)體缺硒會導(dǎo)致T細(xì)胞數(shù)目減少[15]，并致使免疫反應(yīng)減弱，如人類致命的強(qiáng)毒性流感病毒在中國缺硒地區(qū)進(jìn)化[26]，小鼠試驗(yàn)顯示，柯薩奇病毒更易在缺硒的機(jī)體內(nèi)發(fā)展為致命的心臟毒性反應(yīng)。[27]

2.2.4 其他作用

甲狀腺是人體組織中含硒濃度最高的器官，脫碘酶(Deiodinase)有三種類型，均為含硒酶，缺硒會影響甲狀腺功能；硒通過形成重金屬-硒-蛋白復(fù)合物來拮抗有毒重金屬對機(jī)體的毒害作用。[28]

3 硒的含量檢測

硒作為人體必需的微量元素，人體血液或毛發(fā)中的硒含量很低，這就為分析檢測增加了難度，研究者開發(fā)了多種分析檢測方法對硒元素進(jìn)行檢測。

3.1 滴定法

滴定法測定樣品中的硒含量采用的是氧化還原滴定法，其原理是利用亞硒酸離子氧化碘離子(I-)生成碘分子(I2)，通過硫代硫酸鈉滴定碘來定量樣品中硒的含量。其反應(yīng)方程式如圖4所示，硫代硫酸鈉與亞硒酸鈉的化學(xué)計(jì)量比為4∶1，通過滴定消耗的硫代硫酸鈉體積及濃度可以計(jì)算樣品中硒的含量。

圖4 氧化還原滴定法測定樣品中硒的反應(yīng)方程式

3.2 化學(xué)比色法

化學(xué)比色法測定硒含量的方法比較多，如2,3-二氨基萘法、3,3’-二氨基聯(lián)苯胺法、鉬藍(lán)法、硫氰化鉀-羅丹明B法等，其原理為高溫消解樣品，然后加入還原劑使硒轉(zhuǎn)變?yōu)?4價，通過與發(fā)色團(tuán)吸光物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成絡(luò)合物(圖5)，該絡(luò)合物在一定條件的顏色深度與硒濃度呈正比關(guān)系，然后根據(jù)最小二乘原理建立回歸曲線，對溶液中硒含量進(jìn)行測定?；瘜W(xué)比色法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，不需要昂貴的儀器，缺點(diǎn)是靈敏度低，其無法對不同價態(tài)的Se進(jìn)行分析。

圖5 化學(xué)比色法測定樣品中的硒

3.3 氣相色譜法

硒(IV)與鄰苯二胺發(fā)生反應(yīng)生成具有揮發(fā)性的產(chǎn)物(圖6)，通過用有機(jī)溶劑萃取后，可以進(jìn)行氣相色譜分析[29]，色譜柱可分為鍵合型和非鍵合型，其中非鍵合型色譜柱內(nèi)徑較大，柱內(nèi)有固定液和擔(dān)體(support)組成，用于硒分離的固定液多為非極性的，如100%聚甲基硅氧烷(100% dimethyl polysiloxane)或含5%苯基的聚甲基硅氧烷(5% phenyl dimethyl polysiloxane)；擔(dān)體多為高純度硅藻土(SiO2·nH2O)。檢測器一般不選擇氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)，而是選擇靈敏度高的電子捕獲檢測器(electron capture detector，ECD)，若選擇溴代或硝基取代的鄰苯二胺類似物發(fā)生反應(yīng)，可進(jìn)一步提供靈敏度。

圖6 氣相色譜法測定樣品中的硒

3.4 原子光譜法

硒的特征發(fā)射波長為196.0nm，通過特征譜線的波長和強(qiáng)度可以進(jìn)行定性和定量分析，但實(shí)際應(yīng)用中，多采用硒原子的吸收光譜法進(jìn)行定量分析，因基態(tài)原子能量最低，也最穩(wěn)定，定量分析時基線平穩(wěn)，外層電子吸收能量躍遷至較高能級，也會瞬間回到基態(tài)，譜圖上表現(xiàn)為銳利的尖峰。Kubota等[30]采用鉬酸鹽型陰離子交換樹脂富集水中痕量的不同價態(tài)的Se，然后直接導(dǎo)入石墨爐原子化進(jìn)行原子吸收檢測，取得良好的檢測結(jié)果。

由于硒化氫(H2Se)具有沸點(diǎn)低、易原子化的特點(diǎn)，一般多采用氫化物發(fā)生裝置使硒化物還原生成硒化氫，然后進(jìn)行原子吸收光譜法檢測。[31]

硒原子還有一個特性，其吸收特定波長的電磁波后，由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，在從激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)過程中，會發(fā)射特征的熒光，通過檢測熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，具有靈敏度高，且專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)。Deng等人[32]采用原子熒光法測定食物中Se的含量，定量限達(dá)到0.050 ng/mL。

3.5 質(zhì)譜法

質(zhì)譜作為一個新的檢測離子的技術(shù)，具有快速、靈敏的特點(diǎn)，硒在自然界有6種同位素(表1)，其豐度有很大差異，故相對原子質(zhì)量為78.96。質(zhì)譜分析中多采用78Se進(jìn)行定量，同時以82Se為內(nèi)標(biāo)參照。

表1 自然界中硒元素的同位素

硒的離子化一般選擇電感耦合等離子體(inductively coupled plasma，ICP)技術(shù)，ICP具有溫度高、電子密度高、化學(xué)惰性等優(yōu)點(diǎn)，既可以作為離子源又可以作為原子化器，在元素分析中有重要應(yīng)用。

樣品的前處理可以選用電熱蒸發(fā)(electrothermal vaporization)法，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，可固體取樣。[33-34]Liu等人[35]采用電熱蒸發(fā)原子吸收法測定水果汁中的Se含量，通過考察不同基質(zhì)改性劑最終可實(shí)現(xiàn)Se的定量限為28 pg。

3.6 硒的形態(tài)分析

硒的形態(tài)分析研究多數(shù)限于無機(jī)硒和有機(jī)硒的簡單分析，或?qū)τ袡C(jī)硒的形態(tài)進(jìn)行初步分析。分析方法多采用HPLC或陰離子交換色譜(anion-exchange LC)進(jìn)行分離，然后采用ICP-MS與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比對分析[36-37]，也可采用分子質(zhì)譜對硒形態(tài)進(jìn)行輔助分析。對硒蛋白的檢測分離也可以采用凝膠電泳(gel electroghoresis)，然后采用ICP-MS分析。[34]Jorge[38]等人采用HPLC-ICP-MS同時對富硒區(qū)產(chǎn)的干果(巴西栗)Se含量和Se形態(tài)進(jìn)行的分析，最低定量限可達(dá)到0.014 ppm，Se形態(tài)分析發(fā)現(xiàn)巴西栗中含有SeMet和SeCys2，并通過軌道阱質(zhì)譜確證了巴西栗中不含有SeOMet。

3.7 其他分析方法

中子活化分析是一種放射分析方法，以中子或質(zhì)子照射引發(fā)局部微小核反應(yīng)，激發(fā)活化的復(fù)合核產(chǎn)生輻射γ射線，根據(jù)波峰進(jìn)行定性，根據(jù)輻射強(qiáng)弱進(jìn)行定量分析。[39]Mohammed等人[40]采用放射化學(xué)中子活性技術(shù)對薄荷樣品中Se含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)阿爾及利亞地區(qū)薄荷中Se的含量為0.037ppm。

4 展望

隨著人們對硒的研究深入，對其生物活性的機(jī)理機(jī)制有了更深入的了解，同時隨著現(xiàn)代分析儀器的研制和迭代，靈敏度、專屬性越來越好，但對硒的分析檢測還有待改進(jìn)，今后可以從以下兩個方面開展工作：(1)自動化、一體化、聯(lián)用化的檢測設(shè)備研制和開發(fā)，不需要樣品前處理或僅僅簡單的樣品處理，就可以實(shí)現(xiàn)樣品的在線、準(zhǔn)確的定量分析；(2)硒的形態(tài)分析需要更精細(xì)的分離手段，開發(fā)專屬性更好的色譜分離技術(shù)。