休眠卵孵化對(duì)策與食物濃度對(duì)萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)兩品系干雌體種群增長(zhǎng)的影響

邢康南,牛翠娟

生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100875

單巢綱輪蟲生活史為典型的世代交替,休眠卵的形成是其生活史中非常重要的一部分,輪蟲依靠休眠卵來(lái)適應(yīng)不良環(huán)境的變化,對(duì)延續(xù)種群、保留基因有重要意義。因此,與休眠相聯(lián)系的有性生殖也被看作是對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)[1-3]。一個(gè)基因要被保留下來(lái),必須在種群中傳遞下去,而環(huán)境中的不利因素對(duì)這一過(guò)程有阻礙作用。由于休眠期的存在,帶有基因變異的休眠卵的形成和這些具有基因變異后代的出生在時(shí)間上分隔開來(lái),分隔時(shí)間或長(zhǎng)或短。輪蟲休眠卵庫(kù)就像“種子貯存庫(kù)”一樣,當(dāng)環(huán)境恢復(fù)到適宜輪蟲生存時(shí), 它們可以在短時(shí)間內(nèi)孵化出來(lái)并依靠孤雌生殖迅速繁衍擴(kuò)大種群,有利于種群避開不利的生態(tài)因子,使該物種的基因在棲息地中保留下來(lái),而不至于滅絕。此外,休眠卵耐干旱的特性是輪蟲在全球范圍內(nèi)廣泛分布的原因,因?yàn)楦吣秃的芰τ兄谛菝呗训纳⒉?例如借助風(fēng)力或鳥類、昆蟲等動(dòng)物的銜食而散布到更廣泛的范圍以致全球范圍內(nèi),這樣可使輪蟲從不適宜生存的環(huán)境中解放出來(lái),盡快在適宜生存的環(huán)境孵化、增殖[4-5]。

對(duì)單巢綱輪蟲休眠卵的早期研究主要集中于休眠卵形成、孵化過(guò)程及其影響因素等方面,隨著研究的逐漸深入,休眠卵的孵化時(shí)間引起了研究者的關(guān)注[6- 8]。有性生殖產(chǎn)生的休眠卵會(huì)沉入自然水體底泥中的休眠卵庫(kù)進(jìn)行休眠,休眠時(shí)長(zhǎng)在輪蟲種間和種內(nèi)均有差異[8]。以往通常認(rèn)為,休眠卵會(huì)休眠至下一個(gè)生長(zhǎng)季,乃至數(shù)年之后才萌發(fā),相對(duì)于輪蟲僅能持續(xù)數(shù)天至幾周的壽命而言,休眠時(shí)間較長(zhǎng)[6,9- 11]。然而,一些實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)部分休眠卵在產(chǎn)生后的幾天之內(nèi)便開始孵化,稱為早孵化現(xiàn)象(early hatching)[11- 15]。雖然目前少有確鑿證據(jù)顯示野外環(huán)境下也存在休眠卵的早孵化現(xiàn)象,但是Gilbert[16]預(yù)測(cè)這個(gè)現(xiàn)象在自然環(huán)境中可能十分普遍,并且具有重要意義。原因有兩點(diǎn),一是為使種群獲得盡可能大的短期適合度,即使已經(jīng)開始進(jìn)行有性生殖,種群也應(yīng)當(dāng)保持優(yōu)良的孤雌生殖,而休眠卵的早孵化恰好對(duì)此有利；二是在生長(zhǎng)季開始了一段時(shí)日之后,種群的基因多樣性在自然選擇作用下減小,此時(shí)休眠卵的早孵化能為種群帶來(lái)新的遺傳變異,其中有可能包含更適應(yīng)此時(shí)環(huán)境的基因型[16]。此外,有研究者提出輪蟲休眠卵的孵化時(shí)間是一個(gè)具有“兩頭下注對(duì)策”的生活史特征[10,17],即輪蟲的單克隆種群能通過(guò)產(chǎn)生具有不同孵化對(duì)策的休眠卵來(lái)分?jǐn)傦L(fēng)險(xiǎn),有研究表明孵化對(duì)策多樣性與該克隆群所處環(huán)境的不可預(yù)測(cè)性呈出明顯的正相關(guān)[18-20]。

目前,關(guān)于休眠卵孵化對(duì)策的研究主要集中于對(duì)孵化對(duì)策的影響因素上[7-8,10],尚不清楚不同輪蟲或同種輪蟲的不同品系在孵化對(duì)策上是否存在偏好；孵化對(duì)策又如何影響其干雌體后代克隆群的增長(zhǎng)與繁殖[11],對(duì)于這些問(wèn)題的定量研究有助于了解早孵化現(xiàn)象對(duì)輪蟲種群適合度的影響。

本研究擬采用萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)的兩個(gè)品系H1、D1為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,通過(guò)比較觀測(cè)兩種孵化對(duì)策下的干雌體單克隆種群的增長(zhǎng)及有性生殖率(混交率)的差異,來(lái)探究孵化對(duì)策對(duì)后代種群增長(zhǎng)的影響。H1、D1兩品系均采集自北京西海(116°38′87.28″E, 39°94′94.31″N),但是在自然水體中的生長(zhǎng)時(shí)間不同：H1的生長(zhǎng)季為8—9月,是窄溫度生態(tài)位品系；而D1的生長(zhǎng)季為5—10月,是寬溫度生態(tài)位品系[21]。兩品系來(lái)源地4—11月部分環(huán)境指標(biāo)數(shù)據(jù)見表1。本研究可為深入了解輪蟲“休眠”的功能作用及其生活史的適應(yīng)性進(jìn)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),并可為水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要餌料生物輪蟲的培養(yǎng)提供一定的理論參考。

表1 北京西海4—11月水體部分環(huán)境因子觀測(cè)數(shù)值

1 材料與方法

1.1 兩種孵化對(duì)策的休眠卵和食物的制備

本研究的兩個(gè)萼花臂尾輪蟲品系均為本實(shí)驗(yàn)室自野外采集,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保種培養(yǎng)的樣本。兩種孵化對(duì)策的休眠卵制備方法為：將從克隆群中收集的休眠卵直接孵化,數(shù)天之內(nèi)萌發(fā)的可認(rèn)定為早孵化休眠卵；將收集的休眠卵置于4℃下避光保存40 d后再放到相同孵化條件下萌發(fā),模擬經(jīng)歷了較長(zhǎng)休眠期的晚孵化休眠卵。

輪蟲的食物為蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidesa)(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)),經(jīng)無(wú)菌接種后,擴(kuò)大培養(yǎng)于SE培養(yǎng)液(根據(jù)中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)的配方進(jìn)行配置)中,恒溫光照培養(yǎng)(25℃,3000 lx,L∶D=24∶0)。選取指數(shù)增長(zhǎng)期的藻液,在4℃,7000 r/min離心6 min,收集的濃縮藻液,使用分光光度計(jì)測(cè)定其原始濃度,4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程

取各品系的休眠卵,兩種孵化對(duì)策組各約80枚,分別置于盛有30 mL COMBO培養(yǎng)液的燒杯中孵化,孵化及后續(xù)的種群培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度20℃、光照強(qiáng)度3000 lx、光周期L∶D=16∶8。挑選健康的、出生2h以內(nèi)的幼體于6孔板中進(jìn)行單克隆培養(yǎng),每孔培養(yǎng)體積為5 mL,培養(yǎng)起始密度為0.2 ind/mL。每個(gè)品系各設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：晚孵化-高食物濃度(LH-HF(2×106個(gè)細(xì)胞/mL)),晚孵化-低食物濃度(LH-LF(5×105個(gè)細(xì)胞/mL)),早孵化-高食物濃度(EH-HF),早孵化-低食物濃度(EH-LF),每個(gè)實(shí)驗(yàn)組10個(gè)重復(fù)。每12h換一次培養(yǎng)液并觀察一次,統(tǒng)計(jì)每個(gè)孔中非混交雌體(amictic female,AF)數(shù)量、混交雌體(mictic female,MF)數(shù)量和個(gè)體總數(shù)(N),計(jì)算混交率MR “MR=MF/N”。統(tǒng)計(jì)時(shí),帶有非混交卵的成熟個(gè)體計(jì)入非混交雌體數(shù)量,帶有雄卵或休眠卵的成熟個(gè)體計(jì)入混交雌體數(shù)量,所有個(gè)體均計(jì)入總數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組種群增長(zhǎng)曲線進(jìn)行Logistic方程擬合,得出方程中參數(shù)的估計(jì)值。擬合使用的公式為：N=K/(1+ea-rt),其中N為種群數(shù)量觀測(cè)值,待定參數(shù)K為環(huán)境容納量,r為內(nèi)稟增長(zhǎng)率,a為積分常數(shù)。對(duì)混交率、內(nèi)稟增長(zhǎng)率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。用S-W正態(tài)分布檢驗(yàn)和Levene方差齊性檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性,若符合,則對(duì)各品系的內(nèi)稟增長(zhǎng)率、最大種群數(shù)量、開始進(jìn)行有性生殖時(shí)的種群密度和混交率進(jìn)行雙因素方差分析,進(jìn)一步用LSD進(jìn)行兩兩比較；若數(shù)據(jù)經(jīng)一定轉(zhuǎn)換后仍不滿足進(jìn)行方差分析的要求,則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE)表示,差異顯著性水平設(shè)定為0.05,全部統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件,并采用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組種群數(shù)量隨時(shí)間的變化

2.1.1種群數(shù)量增長(zhǎng)曲線

兩品系不同處理組的種群增長(zhǎng)曲線如圖1所示。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)處理組的種群數(shù)量增長(zhǎng)曲線(數(shù)據(jù)表示為：Mean±SE)Fig.1 Population growth curve of different experimental groups( Data are shown as Mean±SE)D1：寬溫度生態(tài)位品系；H1：窄溫度生態(tài)位品系；LH-HF：晚孵化-高食物濃度; LH-LF：晚孵化-低食物濃度; EH-HF：早孵化-高食物濃度; EH-LF：早孵化-低食物濃度

2.1.2Logistic方程擬合

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組種群增長(zhǎng)曲線進(jìn)行了Logistic方程擬合,獲得K、r的估計(jì)值和擬合優(yōu)度R2,如表2所示。除H1品系的低食物濃度下兩實(shí)驗(yàn)組擬合優(yōu)度較低外,其余各組均獲得較好地?cái)M合效果。

表2 Logistic方程擬合結(jié)果

2.1.3內(nèi)稟增長(zhǎng)率

要實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)、路經(jīng)和模式，任務(wù)比較艱巨，其核心人物主要有內(nèi)部資源管理、內(nèi)容生產(chǎn)管理、渠道管理、用戶管理和運(yùn)營(yíng)績(jī)效分析。

對(duì)各組內(nèi)稟增長(zhǎng)率數(shù)據(jù)進(jìn)行了反正弦轉(zhuǎn)換后,D1仍不符合進(jìn)行參數(shù)檢驗(yàn)的要求,因此進(jìn)行了曼-惠特尼 U 檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)孵化對(duì)策對(duì)D1品系的種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率沒有顯著影響,食物濃度對(duì)種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率有顯著影響,高食物濃度更有利于種群增長(zhǎng),如圖2；對(duì)H1各組數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析,發(fā)現(xiàn)孵化對(duì)策和食物濃度兩因素對(duì)H1品系的內(nèi)稟增長(zhǎng)率的綜合影響是顯著的(P<0.001),并且兩因素之間存在交互作用(P<0.001),孵化對(duì)策對(duì)H1品系的內(nèi)稟增長(zhǎng)率影響不顯著(P=0.235),食物濃度對(duì)H1品系的內(nèi)稟增長(zhǎng)率影響顯著(P<0.001),進(jìn)一步將四組數(shù)據(jù)在單因素下用LSD進(jìn)行兩兩比較,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2。

圖2 各處理組內(nèi)稟增長(zhǎng)率的比較(數(shù)據(jù)表示為：Mean±SE)Fig.2 The intrinsic growth rate of each treatment( Data are shown as Mean±SE)無(wú)相同上標(biāo)字母表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異P<0.05

2.1.4最大種群數(shù)量

為使數(shù)據(jù)滿足方差齊性,符合進(jìn)行雙因素方差分析的要求,對(duì)最大種群數(shù)量數(shù)據(jù)進(jìn)行了平方根轉(zhuǎn)換。

如表3所示,孵化對(duì)策和食物濃度兩因素對(duì)D1品系的最大種群數(shù)量具有顯著的綜合影響(P=0.002),而兩者之間不存在交互作用(P=0.911),兩個(gè)因素單獨(dú)對(duì)最大種群數(shù)量起作用。其中,孵化對(duì)策對(duì)D1品系的最大種群數(shù)量影響顯著(P=0.001), 食物濃度對(duì)D1品系的最大種群數(shù)量也有顯著影響(P=0.004,圖3)。

表3 孵化對(duì)策與食物濃度對(duì)品系D1最大種群數(shù)量影響的雙因素方差分析結(jié)果

孵化對(duì)策和食物濃度兩因素對(duì)品系H1的最大種群數(shù)量具有顯著的綜合影響(P<0.001,表4),且兩者之間存在交互作用(P<0.001)。孵化對(duì)策對(duì)H1品系的最大種群數(shù)量影響顯著(P<0.001),食物濃度對(duì)H1品系的最大種群數(shù)量影響也顯著(P<0.001,圖3)。

表4 孵化對(duì)策與食物濃度對(duì)品系H1最大種群數(shù)量影響的雙因素方差分析結(jié)果

圖3 各處理組最大種群數(shù)量的比較(數(shù)據(jù)表示為：Mean±SE)Fig.3 The maximum population size of each treatment (Data are shown as Mean±SE)無(wú)相同上標(biāo)字母表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異P < 0.05

2.2 有性生殖

2.2.1種群混交率隨時(shí)間變化曲線

圖4 各處理組混交率隨時(shí)間的變化曲線(數(shù)據(jù)表示為：Mean±SE)Fig.4 Mixis ratio curve of each treatment (Data are shown as Mean±SE)

2.2.2各實(shí)驗(yàn)組種群開始進(jìn)行有性生殖時(shí)的種群密度

對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行算數(shù)平方根轉(zhuǎn)換后,“低食物濃度”各組數(shù)據(jù)仍不符合進(jìn)行雙因素方差分析的要求,因此僅探究了高食物濃度下“孵化對(duì)策”這一因素對(duì)種群開始進(jìn)行有性生殖時(shí)的密度有何影響。對(duì)D1數(shù)據(jù)進(jìn)行了單因素方差分析(P=0.041),對(duì)H1數(shù)據(jù)進(jìn)行了曼-惠特尼U檢驗(yàn)(P=0.022),結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同處理組種群開始進(jìn)行有性生殖時(shí)的種群密度比較(數(shù)據(jù)表示為：Mean±SE)Fig.5 Comparison of the population density at the beginning of sexual reproduction in different treatment groups(Data are shown as Mean±SE)無(wú)相同上標(biāo)字母表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異P<0.05

2.2.3各實(shí)驗(yàn)組種群在最高種群密度下的混交率

對(duì)各組混交率數(shù)據(jù)進(jìn)行算數(shù)平方根轉(zhuǎn)換后,“低食物濃度”數(shù)據(jù)仍不符合進(jìn)行雙因素方差分析的要求,因此仍然僅探究高食物濃度下“孵化對(duì)策”這一因素對(duì)種群在最高種群密度下的混交率有何影響。對(duì)D1、H1數(shù)據(jù)進(jìn)行了單因素方差分析,“孵化對(duì)策”對(duì)D1種群在最高種群密度下的混交率影響不顯著(P=0.855),對(duì)H1種群在最高種群密度下的混交率有顯著影響(P=0.044,圖6)。

圖6 不同處理種群在最高種群密度下的混交率(數(shù)據(jù)表示為：Mean±SE)Fig.6 Mixis ratio at peak population density of different experimental groups(Data are shown as Mean±SE)無(wú)相同上標(biāo)字母表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異P<0.05

3 討論

本研究主要觀測(cè)了萼花臂尾輪蟲(B.calyciflorus)的兩個(gè)品系H1、D1在不同休眠卵孵化對(duì)策和不同食物濃度下干雌體形成的單克隆種群增長(zhǎng)的差異。本研究發(fā)現(xiàn),休眠卵孵化對(duì)策確實(shí)對(duì)其干雌體克隆種群的增長(zhǎng)產(chǎn)生了影響,但具體影響的結(jié)果與各品系在自然環(huán)境中的生長(zhǎng)季的時(shí)間有關(guān)。同一品系中,內(nèi)稟增長(zhǎng)率和最大種群數(shù)量的分析結(jié)果表明孵化對(duì)策會(huì)對(duì)種群最終能占領(lǐng)的環(huán)境資源多少產(chǎn)生影響,早孵化更有利于生長(zhǎng)季時(shí)間較長(zhǎng)的D1品系的種群增長(zhǎng),晚孵化更有利于生長(zhǎng)季時(shí)間較短的H1品系的種群增長(zhǎng)。

在長(zhǎng)期自然選擇壓力下,不同環(huán)境、不同品系的輪蟲在與休眠相關(guān)的性狀(如休眠期存活率、休眠時(shí)長(zhǎng)和孵化率等)上會(huì)呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)[22-23]。休眠期的長(zhǎng)短可能受諸多因素的影響[17-18,22],不同孵化對(duì)策所占的比例與萌發(fā)后種群增長(zhǎng)的表現(xiàn)也會(huì)相應(yīng)受到影響。有研究表明,在底泥環(huán)境安全的前提下,水體環(huán)境不適宜種群生長(zhǎng)的時(shí)間越長(zhǎng),休眠卵的休眠期也越長(zhǎng)[17]。也就是說(shuō),環(huán)境適宜的生長(zhǎng)季越短,種群越傾向于選擇較長(zhǎng)的休眠期,較晚孵化的休眠卵形成的種群能夠獲得更高的種群適合度,本研究的結(jié)果支持這一發(fā)現(xiàn)。

本研究使用的D1和H1為不同溫度生態(tài)位的萼花臂尾輪蟲品系,一年之中適宜寬溫度生態(tài)位的品系(D1)生長(zhǎng)的時(shí)間較長(zhǎng),該品系中早孵化的休眠卵在萌發(fā)時(shí)很可能仍處于環(huán)境適宜的生長(zhǎng)季內(nèi),因此后代種群能夠以低混交率快速擴(kuò)增,在適宜生境下參與競(jìng)爭(zhēng)。而水體中窄溫度生態(tài)位品系(H1)生長(zhǎng)的時(shí)間較短,若過(guò)早萌發(fā)則可能面臨著生長(zhǎng)季的結(jié)束,采取晚孵化對(duì)策才是一個(gè)相對(duì)保險(xiǎn)的選擇。另外,影響H1品系的最大種群數(shù)量的兩個(gè)因素(孵化對(duì)策和食物濃度)之間存在交互作用,以及Logistic方程擬合的結(jié)果(表2)都說(shuō)明, H1品系對(duì)食物濃度的要求較高,當(dāng)食物缺乏時(shí),食物會(huì)超越孵化對(duì)策成為影響種群增長(zhǎng)的主要因素。H1品系的生長(zhǎng)季在夏末秋初,早孵化的個(gè)體可能面臨已存在的高種群密度個(gè)體對(duì)食物的競(jìng)爭(zhēng)和秋季食物生產(chǎn)將隨光照和溫度下降而降低的雙重壓力,因而晚孵化更有利。

在一個(gè)生長(zhǎng)季中,產(chǎn)生足夠多的休眠卵可在一定程度上保證種群的長(zhǎng)期適合度[24],但進(jìn)行有性生殖對(duì)種群在當(dāng)下生長(zhǎng)季的短期適合度又有明顯代價(jià)[25,26],種群需要在二者之間進(jìn)行權(quán)衡[27]。種群開始進(jìn)行有性生殖時(shí)的種群密度可以反映出在增長(zhǎng)早期對(duì)密度信號(hào)響應(yīng)的靈敏性,再結(jié)合種群密度較高(達(dá)到環(huán)境容納量)時(shí)的有性生殖率,可以反映出種群在不同時(shí)期通過(guò)有性生殖產(chǎn)生休眠卵的傾向性。本研究中,在種群增長(zhǎng)的早期,D1品系早孵化的種群比晚孵化的更能經(jīng)受較高的種群密度,先以較低的有性生殖率迅速擴(kuò)大種群(圖5),優(yōu)先保證種群在當(dāng)下生長(zhǎng)季的短期適合度,而不急于產(chǎn)生休眠卵保種,這可能和D1品系生長(zhǎng)季較長(zhǎng)有關(guān)。H1品系恰恰與D1相反,早孵化的種群比晚孵化的種群更傾向于盡早產(chǎn)生休眠卵(圖5)以應(yīng)對(duì)接下來(lái)可能面臨的環(huán)境脅迫,優(yōu)先保證種群的長(zhǎng)期適合度,對(duì)種群增長(zhǎng)造成的代價(jià)由增長(zhǎng)后期相對(duì)較低(圖6,相對(duì)于晚孵化休眠卵后代種群)的混交率來(lái)彌補(bǔ)。

總體上,本研究有助于我們了解休眠卵在孵化時(shí)間上的兩頭下注對(duì)策與種群自身特性、種群的原始生境之間存在的聯(lián)系,很可能是輪蟲種群對(duì)生境時(shí)間變異的適應(yīng)性表現(xiàn),也使我們能夠進(jìn)一步了解休眠的功能作用,并可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖中合理利用和培養(yǎng)餌料生物提供參考。即便是在同一輪蟲品系中,甚至是同一克隆群中,也存在著休眠卵孵化對(duì)策的差異[15,19],但原因以及不同孵化對(duì)策如何影響后代種群動(dòng)態(tài)還需要更多的定量研究。