氣相色譜-燃燒-同位素比質(zhì)譜在檢測尿樣中外源性睪酮及其代謝物中的應(yīng)用

溫超 王靜竹 朱天碩 劉欣 王杉 張亦農(nóng)

國家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

1 引言

睪酮（testosterone，T）是人體內(nèi)主要的固醇激素之一，可以促進(jìn)機(jī)體的合成代謝，促進(jìn)肌肉和力量的增長[1-3]，因此被某些運(yùn)動(dòng)員作為興奮劑使用。由于體內(nèi)自身合成的睪酮和睪酮制劑中的睪酮的分子結(jié)構(gòu)完全一致，常規(guī)的質(zhì)譜儀難以區(qū)分體內(nèi)自身合成的睪酮和外源攝入的睪酮。同時(shí)，由于個(gè)體差異、不同的生理狀況，尿樣中的睪酮濃度變化范圍較大，因此，尿樣中外源性的睪酮確證，一直以來都是興奮劑檢測領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)[4-6]。按照世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）的規(guī)定[7，8]，當(dāng)體內(nèi)睪酮、表睪酮及其代謝物的濃度或者比例發(fā)生異常變化時(shí)，如睪酮和表睪酮濃度比例大于4，或者在男性尿樣中睪酮含量大于200 ng/mL 時(shí)，需要對尿樣中的睪酮以及其主要代謝物進(jìn)行氣相色譜-燃燒-同位素比質(zhì)譜（GC-C-IRMS）確證[7-12]，區(qū)分被分析物是否為外源性類固醇激素。

GC-C-IRMS 檢測技術(shù)在興奮劑檢測領(lǐng)域已經(jīng)有20年左右的應(yīng)用[13-21]。通過對樣品待測物中13C/12C 的比例與內(nèi)源性激素參照物中13C/12C 比例進(jìn)行比較，可以判斷樣品中待測物是否為內(nèi)源產(chǎn)生或外源攝入。通常13C/12C 的比例表示為δ13C 值，使用維也納Pee Dee 箭石標(biāo)準(zhǔn)（Vienna Pee Dee Belemnite，VPDB）作為國際單位進(jìn)行校準(zhǔn)[22]。

目前，大多數(shù)人工合成的類固醇激素均來自于植物基質(zhì)，相對于人體自身合成的類固醇激素，人工合成的類固醇激素具有更貧乏的δ13C值[7，17，22-24]。當(dāng)人體攝入外源性睪酮，其體內(nèi)睪酮及其代謝物的δ13C值將隨之變化，而與睪酮代謝無關(guān)的其他類固醇激素則不受影響。在興奮劑尿樣檢測中，常采用指定一種內(nèi)源性類固醇激素為內(nèi)源性參照化合物（endogenous reference compound，ERC），將其的δ13C值與待測檢測目標(biāo)化合物（target compound，TC）的δ13C 值進(jìn)行比較，可以判斷出TC 是否與ERC 一樣為內(nèi)源性產(chǎn)生。在興奮劑檢測領(lǐng)域，孕烷二醇（pregnanediol，PD）、11β-羥基-雄酮（11βhydroxyandrosterone，11OHAn）、5α-雄烷-16-烯-3β-醇（5α-androst-16-en-3β-ol，16en）、11-ketoetiochola?nolone（11-keto）等常被作為內(nèi)源性參照化合物[7]。按WADA 技術(shù)文件規(guī)定，當(dāng)ERC 和TC 的δ13C 值差（表示為Δ）大于3‰或4‰時(shí)（根據(jù)TC 種類而定），則認(rèn)為該TC來自于外源性攝入。

當(dāng)樣品進(jìn)入GC-C-IRMS 后，先經(jīng)過氣化，然后在氣相色譜中進(jìn)行分離，分離后的組分經(jīng)過燃燒管轉(zhuǎn)化為CO2后再進(jìn)入同位素比質(zhì)譜進(jìn)行檢測，最終得到待測物質(zhì)的δ13C 值。由于GC-C-IRMS 分析僅能對待測物的δ13C值進(jìn)行測定，無法對待測樣品的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行確認(rèn)，因此當(dāng)待測物質(zhì)在氣相色譜有干擾或者共流出峰時(shí)，測定的δ13C值將不準(zhǔn)，無法用于結(jié)果判斷。所以，樣品的前處理對于GC-C-IRMS 分析極其重要。由于尿樣中基質(zhì)成分復(fù)雜，而待測物睪酮及其代謝物濃度較低，如何采用高效的純化分離技術(shù)對尿樣中的待測物質(zhì)進(jìn)行分離提純，并測定其δ13C值，是興奮劑檢測領(lǐng)域中亟待解決的技術(shù)之一。目前國際常用的方法是使用兩次液相分離純化，提高分析物的純度，或通過化學(xué)衍生化手段，使分析物在氣相色譜上完全分離[9-12，23-24]，這些方法可以有效提高尿樣中待測組分的分離效率，但需要大量時(shí)間和人力進(jìn)行監(jiān)測分析。

目前國際通用的方法大多基于Piper 等的兩次液相色譜純化結(jié)合衍生化法[17]。該方法先將尿樣進(jìn)行酶解處理，然后進(jìn)行第一次液相色譜分離，通過收集經(jīng)過液相洗脫的待測物質(zhì)餾分達(dá)到分離純化作用。在經(jīng)過第一次液相分離后，將其中難以分離的待測組分，睪酮、5α-雄烷-3α，17β-二醇、5β-雄烷-3α，17β-二醇物質(zhì)餾分進(jìn)行乙?；磻?yīng)，將待測物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的乙?；a(chǎn)物。對經(jīng)過乙?；慕M分進(jìn)行第二次液相色譜分離，收集對應(yīng)的餾分。經(jīng)過以上液相色譜分離的樣品可以進(jìn)行GC-C-IRMS 分析。通過兩次液相分離以及衍生化反應(yīng)，可以對尿樣中的睪酮及其代謝物進(jìn)行純化，滿足GC-C-IRMS測試的樣品需求。該方法的兩次液相色譜分離以及衍生化反應(yīng)需要大量時(shí)間以及人工操作，在大型體育比賽及樣品高峰期間，會(huì)對常規(guī)檢測工作帶來巨大壓力。同時(shí)，由于對待測物質(zhì)進(jìn)行衍生化后化學(xué)基團(tuán)發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此測定的δ13C值需要進(jìn)行校正，該過程也會(huì)產(chǎn)生一定測量誤差。

建立高效快捷的GC-C-IRMS檢測方法，對于我國興奮劑檢測工作具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本研究根據(jù)WA?DA的相關(guān)技術(shù)文件要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，建立檢測方法，主要對方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及線性、不確定度、人群值等進(jìn)行驗(yàn)證評價(jià)，建立一套GC-C-IRMS 檢測方法，用于對尿樣中睪酮及其代謝物進(jìn)行來源分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

E.coli IX-A 型β-葡萄糖醛酸甙酶購置于Sigma公司；睪酮、表睪酮（epitestosterone，ET）、孕二醇、5α-雄烷-3α，17β-二醇（5α-androst-3α，17β-diol，5α-di?ol）、5β-雄烷-3α，17β-二醇（5β-androst -3α，17β-di?ol，5β-diol）、雄酮（androsterone，An）、本膽烷醇酮（etiocholanolone，Etio）、11-β-羥基雄酮、甲基睪酮（17α-Methyltestosterone，MT）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購置于澳大利亞國家計(jì)量研究所；磷酸二氫鉀（KH2PO3）、磷酸氫二鉀（K2HPO3）、乙酸乙酯、正己烷等購置于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、正己烷（C6H14）、乙酸乙酯（C4H8O2）、乙腈（CH3CN）、叔丁基甲醚（（CH3）3COCH3）購置于Sigma-Aldrich 公司；所用的氦氣、二氧化碳以及氧氣來自于北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司。

液相色譜采用安捷倫公司Agilent 1200 series HPLC，配有Agilent 1260 Infinity collector 系列接收器，氣相色譜-燃燒-同位素比質(zhì)譜來自于賽默飛世爾科技有限公司，配置有Trace1310 系列氣相色譜儀Thermo Scientific MAT 253同位素比質(zhì)譜。

2.2 本研究的實(shí)驗(yàn)原理和方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

待測物睪酮及其代謝產(chǎn)物在尿樣中均以葡萄糖苷酸形式存在，此類結(jié)合形式由于沸點(diǎn)高等原因，無法使用氣相色譜進(jìn)行分離，因此無法進(jìn)行GC-C-IRMS 分析。在實(shí)際尿樣檢測中，使用β-葡萄糖醛酸甙酶將尿樣中的待測物質(zhì)進(jìn)行酶解，將其轉(zhuǎn)化為游離態(tài)化合物后再進(jìn)行GC-C-IRMS分析[7]。

GC-C-IRMS 檢測原理為將待測物質(zhì)通過氣相色譜氣化分離后，經(jīng)由燃燒管轉(zhuǎn)化為CO2，通過分析CO2中的13C/12C 的比例計(jì)算得到δ13C 值，即為待測物質(zhì)的δ13C值。當(dāng)待測物質(zhì)中有干擾物時(shí)，會(huì)在氣相色譜中出現(xiàn)共流出峰，測定出的δ13C值為待測物和干擾物的混合值，無法進(jìn)行結(jié)果判定。因此，在GC-C-IRMS 檢測過程中，樣品的前處理非常重要。雖然氣相色譜具有一定分離能力，但由于尿樣基質(zhì)復(fù)雜，氣相色譜的分離能力已經(jīng)無法滿足實(shí)驗(yàn)要求。尿樣中基質(zhì)種類復(fù)雜，因此需要在GC-C-IRMS 分析前將尿樣中的待測組分進(jìn)行分離富集，得到純度較高的樣品。在實(shí)際尿樣檢測中，通常使用液相色譜將尿樣中的待測物質(zhì)進(jìn)行分離純化，其原理為將尿樣中的待測組分在液相色譜柱上進(jìn)行洗脫[9]，按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間，收集純化后的液相色譜餾分[6，7，9，17]。該餾分中含有純度較高的待測物質(zhì)，后續(xù)經(jīng)過氣相色譜分離，可以得到純凈的氣相色譜峰，對待測物質(zhì)進(jìn)行δ13C值測定。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

現(xiàn)將實(shí)際檢測中的樣品處理操作舉例說明。取適量尿樣，以待測物濃度100 ng/mL 的尿樣為例。取2份，每份3 mL尿樣，每份加入1 mL磷酸緩沖液（pH約為6.0～7.0），加入100μL β-葡萄糖醛酸甙酶（5000 units），55℃恒溫水浴保溫180分鐘以上或過夜，取出樣品冷卻至室溫，加入4 mL叔丁基甲基醚，振蕩萃取，離心后取上層有機(jī)相，75℃加熱下氮?dú)獯蹈?，冷卻至室溫，加入65 μL含有內(nèi)標(biāo)MT濃度為的0.3 mg/mL的甲醇溶液，振搖后轉(zhuǎn)移至液相進(jìn)樣瓶中，封口。經(jīng)過離心后靜置待用。樣品采用HPLC 分離純化。選用色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 μm×250 μm，5 μm），梯度如下：80∶20（A∶B）→15 min→50∶50（A∶B）-保持10min→8 min→10∶90（A∶B）→1min→0∶100（A∶B）-保持5min→4 min→80∶20（A∶B），平衡6 min.流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃。流動(dòng)相A 為水，B為乙腈。通過檢測在192和244 nm處的紫外檢測信號來對樣品收集時(shí)間以及運(yùn)行穩(wěn)定性進(jìn)行判斷。HPLC分離組分經(jīng)過收集后，在75℃加熱下氮?dú)獯蹈纱?。使?0 μL IRMS 上機(jī)溶液進(jìn)行溶解封口后進(jìn)行GCC-IRMS分析。

3 結(jié)果與分析

本研究根據(jù)WADA技術(shù)文件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法驗(yàn)證，以達(dá)到WADA對于GC-C-IRMS檢測的技術(shù)要求和相應(yīng)指標(biāo)。本方法中所有測定的δ13C值均使用可溯源標(biāo)準(zhǔn)品CU/PCC34-3 對儀器參考?xì)膺M(jìn)行校準(zhǔn)。本方法涵蓋7種物質(zhì)的檢測，其中PD和11OHAn為ERC，T、5α-雄烷-3α，17β-二醇（5α-diol）、5β-雄烷-3α，17β-二醇（5β-diol）、雄酮（An）、本膽烷醇酮（Etio）為TC。在實(shí)際樣品中，T、5α-diol、5β-diol 三種物質(zhì)的濃度往往低于其他的物質(zhì)。

3.1 液相色譜分離

為進(jìn)一步提升待測物質(zhì)ERC 和TC 的純度以及對樣品進(jìn)一步富集，需要在進(jìn)行GC-C-IRMS 檢測前，對尿樣中的待測物質(zhì)進(jìn)行液相色譜分離提純，收集經(jīng)液相色譜柱分離后的各個(gè)組分的流出物，該過程可以將尿樣中的大量基質(zhì)排除，有效提高待測物質(zhì)的純度。尿樣通過液相色譜柱的過程中，會(huì)產(chǎn)生同位素分餾效應(yīng)[25-26]，流出物的收集時(shí)間差異導(dǎo)致最終測定結(jié)果的δ13C 值出現(xiàn)偏差。根據(jù)WADA 技術(shù)文件要求，當(dāng)Δ大于3‰或4‰時(shí)（根據(jù)TC種類而定）時(shí)可判定待測物TC為外源攝入，因此在液相色譜純化過程中一定要避免同位素分餾效應(yīng)對最終結(jié)果的影響，造成假陽性或假陰性。

在方法驗(yàn)證過程中，須將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在液相分離前后進(jìn)行對比，確認(rèn)收集時(shí)間窗口內(nèi)收集的樣品未受到同位素分流效應(yīng)影響。圖1為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過液相純化的色譜圖，由圖中可見，所有的待測物質(zhì)，包括ERC 和TC，均可以較好分離。通過測定標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過液相色譜分離前后的δ13C值的差異，可以對收集時(shí)間窗口進(jìn)行評估。經(jīng)過優(yōu)化后，各物質(zhì)在液相色譜出峰前0.05 min和出峰后0.12 min進(jìn)行收集為最佳的液相色譜收集窗口。圖2為一份真實(shí)尿樣的液相色譜分離譜圖。實(shí)驗(yàn)中使用9 mL 尿樣進(jìn)行測定，由圖可知，由于尿樣中存在大量基質(zhì)，液相色譜譜圖極為復(fù)雜，無法對樣品中各組分進(jìn)行區(qū)分。因此前期的收集窗口確認(rèn)對樣品的純化分離有重要影響。在實(shí)際樣品運(yùn)行序列中，需要在序列前后分別加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對收集窗口的有效性進(jìn)行確認(rèn)。同時(shí)，通過使用具有紫外吸收的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)甲睪（MT）作為內(nèi)標(biāo)，監(jiān)測樣品中MT保留時(shí)間的變化，可以對樣品液相色譜運(yùn)行情況進(jìn)行評估。收集后的待測物質(zhì)重新定容進(jìn)行GC-C-IRMS 分析。通過真實(shí)尿樣的分析物濃度及其最終在GC-C-IRMS 上的信號相應(yīng)進(jìn)行折算，測定本方法液相分離過程的回收率在70%左右。

圖1 各分析物的標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖及時(shí)間收集窗口

圖2 真實(shí)樣品液相色譜圖

3.2 液相色譜穩(wěn)定性評價(jià)

液相色譜的保留時(shí)間穩(wěn)定性對樣品中的待測物質(zhì)檢測具有較大影響，本實(shí)驗(yàn)通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間窗口確認(rèn)，應(yīng)用于尿樣中待測組分進(jìn)行分離富集，因此保留時(shí)間是否穩(wěn)定對最終檢測結(jié)果至關(guān)重要。在尿樣檢測過程中，要求尿樣中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間與該批次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中內(nèi)標(biāo)在液相純化過程中的保留時(shí)間絕對差值小于0.1分鐘，以避免在待測物收集過程中產(chǎn)生的同位素分餾效應(yīng)[26]。本研究提供的檢測方法具有較高穩(wěn)定性，在液相色譜柱以及液相色譜主要備件不更換的狀態(tài)下，液相色譜柱前壓波動(dòng)小于10 bar，各批次中尿樣中內(nèi)標(biāo)物之保留時(shí)間偏離標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間超過0.1分鐘占總樣品約為3%?？紤]到不同尿樣中基質(zhì)不同，因此在實(shí)際檢測中出現(xiàn)保留時(shí)間偏差是不可避免的。當(dāng)實(shí)際樣品運(yùn)行中內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間與該批次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)運(yùn)行保留時(shí)間差絕對值超過0.1分鐘時(shí)，應(yīng)對該樣品進(jìn)行重新分析，并在收集時(shí)適當(dāng)擴(kuò)大收集窗口以保證待測物質(zhì)可以完全收集。

3.3 儀器線性范圍測定

GC-C-IRMS 的工作原理為待測物質(zhì)經(jīng)過GC分離后通過燃燒管轉(zhuǎn)化為CO2，再對產(chǎn)生的CO2進(jìn)行δ13C 進(jìn)行測定，即可得到待測樣品的δ13C值。在樣品經(jīng)進(jìn)樣口進(jìn)入氣相色譜過程中，由于不同進(jìn)樣條件、進(jìn)樣量，進(jìn)樣濃度等都會(huì)發(fā)生同位素分餾現(xiàn)象[26]，導(dǎo)致測定的δ13C發(fā)生偏差，因此需要對儀器的線性條件進(jìn)行評價(jià)。按照WADA技術(shù)文件要求，GC-C-IRMS方法的儀器線性評價(jià)至少要包含8 個(gè)以上進(jìn)樣量，同時(shí)要求每種物質(zhì)測定的δ13C 值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）須小于0.5。在本研究方法中，我們將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品配制成三份不同濃度的溶液，每份溶液使用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL 進(jìn)樣測試，得到一系列每種分析物在不同信號下的δ13C值。表1列出了使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對儀器線性的測定結(jié)果。根據(jù)所得到的測量結(jié)果可知，所有的檢測物質(zhì)在300～5000 mV 具有穩(wěn)定的δ13C 值。因此，在實(shí)際檢測中，需要對處理后的樣品在上機(jī)前進(jìn)行進(jìn)一步稀釋，得到合適的濃度，在1～2.5 μL的進(jìn)樣條件下樣品信號在儀器線性范圍內(nèi)才能得到準(zhǔn)確的值。

表1 GC-C-IRMS儀器線性范圍測定

3.4 檢測濃度線性范圍

由于個(gè)體差異及環(huán)境差異，不同尿樣中的TC 和ERC 濃度會(huì)有極大差別[7，12]，因此GC-C-IRMS 確證方法測定的δ13C 值不能受到尿樣中待測物質(zhì)的濃度的影響。按照WADA 技術(shù)文件規(guī)定，對于同一來源的待測物在不同濃度下（例如同一人在不同時(shí)間段留取的尿樣中待測物質(zhì)濃度不同）的δ13C值測定結(jié)果應(yīng)一致。該評價(jià)又稱為方法的檢測濃度線性范圍。在本方法評價(jià)過程中，選取的尿樣檢測濃度可以覆蓋當(dāng)前我國興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測中的待測物尿樣濃度范圍。如表2所示，同一待測物質(zhì)在不同的濃度下測定的δ13C值非常穩(wěn)定，測定的SD均小于0.5，表明本研究的方法可以對不同濃度的尿樣進(jìn)行檢測。

表2 GC-C-IRMS的檢測濃度線性范圍

3.5 最低檢測濃度

由于GC-C-IRMS的靈敏度所限，通常需要至少15純物質(zhì)進(jìn)入氣相色譜柱才能得到可靠的信號，因此在常規(guī)檢測中，對于低濃度的尿樣，需要提高樣品使用量來得到穩(wěn)定的信號。根據(jù)WADA 要求，每份尿樣中的A瓶尿量不小于45 mL，B瓶尿樣量不小于30 mL。興奮劑檢測常為多個(gè)方法對不同類別興奮劑藥物同時(shí)檢測，對可疑樣品須進(jìn)行確證程序，因此各檢測方法取用尿樣應(yīng)盡量少，以保證其他檢測方法具有足夠檢測尿樣可用。本研究方法中最低檢測濃度是基于15 mL尿樣而測定的最小待測物質(zhì)濃度。通常An 和Etio 在尿樣中濃度較高，因此本方法僅驗(yàn)證了100 ng/mL 尿樣。其他的ERC 驗(yàn)證了10 ng/mL 尿樣。在進(jìn)行驗(yàn)證過程中，分別連續(xù)三天進(jìn)行三次測定，同一分析物得到三份結(jié)果。從表3的比對結(jié)果中可知，在采用15 mL尿樣分析時(shí)，使用本方法可以對含量為10 ng/mL 的PD、11OHAn、T、5α-diol、5β-diol測定δ13C值，且結(jié)果穩(wěn)定。

表3 GC-C-IRMS方法最低檢測濃度測定

3.6 不確定度

本文中方法的結(jié)合不確定度包括方法中間精密度和偏差的均方根。具體公式如下：

其中Uc為方法的不確定度，Sw為方法的中間精密度的貢獻(xiàn)，RMSbias為方法測量偏差貢獻(xiàn)。實(shí)際測定中Sw為10 份陰性質(zhì)控尿樣和10 份陽性質(zhì)控尿樣的測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。而方法測量偏差是通過Keeling plot進(jìn)行線性擬合結(jié)果得到[7，12，17]。表4列出了不確定度的評價(jià)結(jié)果，從表中可知，所測的質(zhì)控樣品Sw分別為0.5～0.7 之間，表明本方法具有較高穩(wěn)定性，所有測定的不確定度均小于1‰，滿足WADA 對于興奮劑檢測的要求。

表4 GC-C-IRMS方法不確定度測定

3.7 人群值分析

通過GC-C-IRMS方法比較尿樣中的ERC與TC的δ13C值差異，可以判斷TC是否與ERC一樣為內(nèi)源性代謝產(chǎn)生。按照WADA 技術(shù)文件要求，當(dāng)ERC 和TC 的Δ＞3‰或4‰時(shí)，可以判定測定的TC 為外源性攝入。在實(shí)際檢測中，需要對方法的檢測的人群值進(jìn)行評價(jià)，通過測定40份陰性樣本，得到樣本的ERC和TC的Δ值和對應(yīng)Δ值的SD，要求ERC 與TC 的平均Δ±2SD≤3‰。表5列出了本研究方法的人群值分析結(jié)果。如表中所示，所有的分析結(jié)果的Δ±2SD 值均小于3‰，滿足WA?DA要求，表明本方法具有極高穩(wěn)定性。

表5 GC-C-IRMS方法人群值分析

4 結(jié)論

本研究建立了一套完整的GC-C-IRMS 方法對尿樣中的睪酮及其主要代謝物的來源進(jìn)行區(qū)分。尿樣經(jīng)液相色譜純化分離，進(jìn)行富集，有效提高了分析物的純度，通過測定，樣品前處理回收率在70%以上。本方法在取用15 mL 尿樣的情況下，可以對10 ng/mL 的睪酮及其主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行GC-C-IRMS 檢測。不同濃度待測物的尿樣檢測結(jié)果，以及不確定度、人群值分析結(jié)果表明本方法測定結(jié)果較為穩(wěn)定，滿足WADA 對于興奮劑檢測的要求，可以適用于興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測以及大賽檢測。