Wnt/β-catenin、BMP-2/Runx2/Osterix、OPG/RANKL、LGR4/RANKL通路的相關(guān)因子在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折中的表達(dá)

王斌 麥彩園 謝勝德 曹燕明 汪志中 李新旭 徐茂森

1.佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣東 佛山 528100 2.廣東省婦幼保健院產(chǎn)科，廣東 廣州 510010 3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510260

目前我國骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)患者已超過7 000萬，50歲以上女性患病率為20.7%[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的發(fā)病率為未絕經(jīng)女性的2～3倍[2]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折(postmenopausal osteoporotic fracture，PMOPF)是PMOP的嚴(yán)重后果，可顯著增加患者的致殘率、病死率，并帶來較大的家庭、社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此，研究骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)的發(fā)病、愈合因素，有效的解決研究OP及OPF的發(fā)病機(jī)制及影響因素及治療成為科研及臨床的重點(diǎn)[4]。成骨、破骨是研究、防治OP的熱點(diǎn)，Wnt/β-catenin通路中LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc是關(guān)鍵的成骨因子[5-6]。BMP-2/Runx2/Osterix通路中Runx2、Osterix也是關(guān)鍵的成骨因子[7-8]。OPG/RANKL通路中OPG、RANKL是關(guān)鍵的破骨因子[9]。LGR4/RANKL通路中LGR4、RANKL是關(guān)鍵的破骨因子[10]。本研究采用RT-qPCR方法分析檢測PMOPF骨組織LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、Osterix、OPG、RANKL、LGR4水平。ELISA技術(shù)檢測PMOPF血清LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、Osterix、OPG、RANKL、LGR4水平，并用ELISA進(jìn)一步檢測PMOPF組分時段各因子的水平，探討PMOPF及PMOP的發(fā)病機(jī)制和影響因素。

1 材料與方法

1.1 研究對象、受試基本條件

本試驗挑選2018年1月至2019年12月佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科就診的閉合脛骨骨折女性患者68例(對照組31例和PMOPF組37例)，傷后1 d內(nèi)行骨折內(nèi)固定手術(shù)。患者傷前完全民事行為能力及活動能力正常，無精神、認(rèn)知障礙，需切開或者有限切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)，同意為本實(shí)驗研究受試，簽署知情同意書等相關(guān)事項。入院后登記姓名、年齡(歲)、身高(cm)、體重(kg)等各項資料，所有患者入院后術(shù)前檢測骨密度及T值；骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物β-CTX、PINP、N-MID-OT、25(OH)D；雌二醇。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1PMOPF組入組的標(biāo)準(zhǔn)：滿足前述的基本條件及不滿足后述的排除標(biāo)準(zhǔn)；DXA測骨密度T值≤-2.5，診斷為PMOP。

1.2.2對照組入組的標(biāo)準(zhǔn)：滿足前述的基本條件及不滿足后述的排除標(biāo)準(zhǔn)；DXA測T≥-1.0。

1.2.3排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重慢性疾?。粚?dǎo)致繼發(fā)性PMOP的內(nèi)分泌性等代謝異常的疾??；1年內(nèi)接受藥物或激素治療；手術(shù)不需要顯露骨折端或者很難取骨；骨折斷端硬度大、松質(zhì)骨少。

1.3 標(biāo)本收集

所有患者傷后1 d內(nèi)(術(shù)前)行骨折內(nèi)固定術(shù)，術(shù)中于骨折端刮取骨組織≥100 mg，保存于液氮中，再轉(zhuǎn)深低溫冰箱(-80 ℃)內(nèi)保存。對照組患者傷后1 d內(nèi)(術(shù)前)采集空腹外周靜脈血，離心后血清放入深低溫冰箱內(nèi)保存。PMOPF組患者根據(jù)受傷后血液標(biāo)本采集時間分為A組(1 d內(nèi)、術(shù)前)、B組(2～3 d)、C組(4～7 d)，D組(8～14 d)，E組(15～28 d)，F(xiàn)組(29～42 d)，保存同對照組。

1.4 實(shí)驗主要儀器和試劑

1.4.1儀器：雙能X線骨密度儀(DXA)：Discovery-Wi型數(shù)字化型，美國Hologic公司；紫外分光光度計：美國Nano Drop Technologies公司；PCR 儀、熒光定量PCR儀：美國伯樂公司；血液分析儀：羅氏COPAS6000型(日本東京)。

1.4.2試劑: PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、RNAiso Plus: Takara公司；引物：Takara公司；ELISA試劑盒：德國Immundiagnostik公司。

1.5 RT-qPCR過程

1.5.1RNAiso Plus方法提取骨組織總RNA及定量：取骨標(biāo)本100 mg，用液氮研磨勻漿，移至1 mL RNAiso Plus液的EP管，加入氯仿0.2 mL，將水相上層移至無RNA酶離心管中。加等體積異丙醇，離心后移去上清，加1 mL的75%乙醇?；靹?，離心5 min后棄去上清，室溫干燥10 min。加入無RNA酶水40 μL，得到RNA溶液。讀取OD比值介于1.9～2.0。

1.5.2RT-PCR和實(shí)時熒光定量分析：1×Total RNA 1 μg，5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNase Free ddH2O up to 10 μL，混均勻后行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用Primer Premier5.0設(shè)計、Takara公司合成的引物(序列見表1)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)7.5 μL, PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL， RT反應(yīng)液(cDNA溶液)2 μL，滅菌蒸餾水4.5 μL， Total 15 μL。預(yù)變性Repeat：98 ℃，1 min，PCR反應(yīng)Repeat 40 cycles：98 ℃，15 s；60 ℃，10 s；72 ℃，30 s。選用GAPDH為內(nèi)參基因，使用qPCR儀自帶軟件計算所有樣品的Ct值，用2-ΔΔCT表示PMOPF組因子對比對照組表達(dá)變化的倍數(shù)。

1.6 ELISA檢測過程

按照試劑盒使用說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品和對照品，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)板加樣并按要求孵育，再測量450 nm處的OD值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中檢測物的濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 患者的一般資料、骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物比較

從表2可以看出，兩組年齡、身高、體重?zé)o差異性(P>0.05)。PMOPF組BMD較正常組降低(P<0.05)，對照組T值正常，PMOPF組T值<-2.5，符合分組的規(guī)律。

表2 對照組與PMOPF組一般資料比較Table 2 Comparison of general data between control group and PMOPF group

兩組間比較β-CTX、PINP有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；N-MID-OT、25(OH)D、雌二醇比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。符合骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物等指標(biāo)在兩組的水平變化，見表3。

表3 對照組和PMOPF組骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物等的比較Table 3 Comparison of bone turnover markers between control group and PMOPF group

2.2 各組患者血清、骨組織各因子檢測表達(dá)比較

ELISA法檢測PMOPF組中A、B、C、D、E、F 6組與對照組各因子血清水平(表4、圖1)

表4 對照組和PMOPF組各因子表達(dá)水平的比較Table 4 Comparison of factor expression levels between control group and PMOPF group

圖1 PMOPF組各個因子在A、B、C、D、E、F組血清水平的折線圖Fig.1 Line diagram of serum levels of each factor in PMOPF group in group A, B, C, D, E, and F

ELISA法檢測PMOPF組(A、B、C、D、E、F 6組的因子)相比對照組血清中LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、Osterix、OPG、LGR4水平明顯下降(P<0.05)，RANKL水平明顯上升(P<0.05)。各因子在分時間段中的表達(dá)水平顯示：LRP5、Runx2在B組(3 d內(nèi))最低，β-catenin、C-myc在C組(4～7 d內(nèi))最低，RANKL在C組(8～14 d內(nèi))最高，Osterix在D組(8～14 d)最低，OPG、LGR4在E組(15～28 d)最低，見折線圖所示。各因子與A、B、C、D、E、F六組中的其它時段的因子比較上升、下降幅度較小(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

RT-qPCR法檢測PMOPF組較對照組骨組織中LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、Osterix、OPG、LGR4水平明顯下降(P<0.05)，RANKL水平明顯上升(P<0.05)。見圖2。

圖2 對照組和PMOPF組各個因子的mRNA相對表達(dá)值Fig.2 mRNA expression of factors in control group and PMOPF group

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平迅速下降破骨細(xì)胞(OC)導(dǎo)致的骨吸收大大增加，而成骨細(xì)胞(OB)卻未相應(yīng)增加，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成引起的代謝性疾病[11]。在調(diào)控成骨和破骨中主要包括Wnt/β-catenin[5-6]、BMP-2/Runx2/Osterix[7-8]、OPG/RANKL[9]、LGR4/RANKL等通路[10]?；诠钦塾系慕M織學(xué)觀察和分子學(xué)研究，骨折愈合早期又分為早期炎癥反應(yīng)期、非特定合成代謝期(骨折后3 d內(nèi))、非特定分解代謝期(骨折后3 d至1周)和更多骨組織的特定合成代謝期(骨折1周以后)；而骨折全部愈合分為三階段：血腫機(jī)化期、原始骨痂形成期、骨痂改造塑形期，其中血腫機(jī)化期約在骨折后2～3周內(nèi)完成[12-13]。故本研究將PMOPF組血清檢測時再分為A組(1 d內(nèi))、B組(2～3 d)、C組(4～7 d)，D組(8～14 d)，E組(15～28 d)，F(xiàn)組(29～42 d)。

典型的Wnt/β-cateinin信號通路中當(dāng)Wnt信號關(guān)閉時，游離的β-catenin和GSK-3β結(jié)合出現(xiàn)磷酸化，之后降解，胞質(zhì)中β-catenin濃度較低，當(dāng)Wnt通路被激活，Wnt和LRP5/6、Frizzled結(jié)合成復(fù)合體，從而招募Dvl及降解復(fù)合物，抑制GSK-3β對于β-catenin的磷酸化。未磷酸化的β-catenin積累到一定的量就會進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF結(jié)合，從而激活下游靶因子Runx2、C-myc等轉(zhuǎn)錄表達(dá)[5,14]。

LRP5存在于多種細(xì)胞膜表面[15]。有研究發(fā)現(xiàn)LRP5缺失后OB功能和增殖受阻，使骨形成受影響[16]。Andrei等[17]研究認(rèn)為LGR5可通過Wnt/β-catenin介導(dǎo)激動劑R-海綿體信號調(diào)節(jié)胚胎模式和干細(xì)胞增殖。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)PMOPF組LRP5的表達(dá)明顯減少，考慮PMOP患者LRP5水平下降，與OP成骨受限相關(guān)，也可能存在很多因子比如骨硬化蛋白會與LRP5/6結(jié)合，使Wnt/β-catenin通路抑制，引起骨形成受阻[18]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路最關(guān)鍵的因子，它本身或者通過激活下游的種種因子可以影響OB及其相關(guān)的表達(dá)。Hill等[19]發(fā)現(xiàn)在小鼠的BMSCs中敲除β-catenin基因后其生成軟骨增加而OB減少，揭示了β-catenin對早期MSCs向OB定向分化的必需性。β-catenin在PMOPF組內(nèi)表達(dá)降低，表明Wnt通路處于抑制的狀態(tài)，可能是OP的原因之一，這種狀態(tài)反映了PMOPF后成骨不足。Runx2是成骨過程中最早、特異性極強(qiáng)的標(biāo)志因子，是決定骨脆性的關(guān)鍵因素，在骨形成和骨發(fā)育中是一個必須的基因，Runx2能上調(diào)OB中存在的各種礦化相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄[20-21]。有研究證實(shí)激活Wnt/β-catenin通路可直接調(diào)節(jié)骨關(guān)鍵因子Runx2，加強(qiáng)成骨的分化，加快骨折的愈合[22]。本實(shí)驗PMOPF組Runx2明顯降低，說明Runx2的表達(dá)低可能是影響PMOPF的重要因素。C-myc是Wnt/β-catenin通路下游的重要因子。有實(shí)驗用Wnt-3a蛋白感染iSCAP細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)C-myc基因表達(dá)會上調(diào)[23]。C-myc促進(jìn)細(xì)胞周期由G1進(jìn)入S期，促進(jìn)OB分化增殖[24]。本實(shí)驗檢測發(fā)現(xiàn)C-myc在PMOPF組中表達(dá)下降，說明C-myc作為Wnt下游靶因子，進(jìn)一步從核內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平表明OP內(nèi)的Wnt通路的成骨不足或處于抑制狀態(tài)。

本實(shí)驗中LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc在PMOPF組中表達(dá)均降低，說明4個因子在Wnt/β-catenin信號通路中的成骨作用一致，符合它們在通路中正相關(guān)和互相促進(jìn)的密切相互作用。有研究顯示LRP5通過激活Runx2的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞發(fā)育和骨質(zhì)形成[22]。LRP5、Runx2均在骨折3 d內(nèi)水平降至最低，之后出現(xiàn)上升，說明它們在成骨階段中的變化一致。Yan等[25]研究表明β-catenin在骨折修復(fù)不同的階段具有不同功能。β-catenin可通過抑制糖酵解及谷氨酰胺抑制其下游目標(biāo)C-myc，可使其表達(dá)下調(diào)[26]。胞漿β-catenin的濃度決定了與核內(nèi)C-myc的表達(dá)能否被激活[24]。β-catenin、C-myc均在骨折7 d內(nèi)降至最低然后升高，兩因子的同步性與相關(guān)的研究成一致。同一個通路4個因子升高幅度太小(差異無統(tǒng)計學(xué)意義)，可能與PMOPF較難短期內(nèi)愈合有關(guān)。

BMP-2/Runx2/Osterix通路包括BMP-2/p38MAPK/Runx2/Osterix和BMP-2/Smads/ Runx2/Osterix兩條通路。經(jīng)Smads通路中，Smads蛋白家族可將TGF-β信號從細(xì)胞膜傳遞至細(xì)胞核，BMP-2結(jié)合某種受體后，細(xì)胞表面受體-II可以立刻被激活并使細(xì)胞表面受體-I某些區(qū)域磷酸化，從而使下游因子Smad1/Smad5/Smad8激活后與Co-Smads形成復(fù)合體，共同轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)Runx-2下游基因Osterix的表達(dá)，調(diào)控OB分化[27]。經(jīng)p38MAPK通路中BMP-2因子與細(xì)胞表面受體-I結(jié)合為復(fù)合體，再結(jié)合細(xì)胞表面受體-II一起形成異聚體，進(jìn)一步激活p38MAPK從而轉(zhuǎn)導(dǎo)增加Osterix的表達(dá)使OB增值[28]。Runx2在Wnt/β-catenin、BMP-2/Runx2/Osterix兩個通路里均為核心因子并影響成骨，故Runx2的表達(dá)量明顯增多。Phimphila等[29]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2可增強(qiáng)Runx2轉(zhuǎn)錄，Runx2可以提供激活BMP-2的必需因子，OB分化可由BMP-2/Runx2軸調(diào)控。本實(shí)驗PMOPF組表達(dá)Runx2降低，說明Runx2也可能通過調(diào)控BMP-2/Runx2軸對OB分化從而影響OP形成。Osterix為Runx2下游的重要的調(diào)控OB的因子，依賴Runx2水平的高低而變化，而且Osterix只在成骨性質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)[30]，MScs在沉積后其中部分分化成為OB的前體，于Runx2的作用之下分化為OB，Osterix在OB的成熟和再分化中具有較大作用；部分沉積的MSc則分化成軟骨細(xì)胞，在Sox9的作用下分化為軟骨[8]。本實(shí)驗PMOPF組表達(dá)Osterix降低，進(jìn)一步說明Osterix作為Runx2下游的成骨因子，其表達(dá)下調(diào)影響成骨，可能是導(dǎo)致PMOPF的因素。Kaback等[31]研究表明，在小鼠的骨折模型建立后，它們7 d后有軟骨及組織形成，持續(xù)第10天并出現(xiàn)Sox9的mRNA水平增加，骨折后14 d Osterix主要在傷處附近的OB中表達(dá)，sox9表達(dá)減少，此時傷處組織處軟骨重塑成為硬骨。大量的研究及臨床表現(xiàn)證實(shí)BMP具有獨(dú)特的誘導(dǎo)成骨作用，在骨折后2周完成纖維連接[7-8]。本實(shí)驗BMP-2/Runx2/Osterix通路中Osterix在D組(8～14 d)最低，與此研究一致。

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是OC分化中相當(dāng)重要的信號通路，包括RANKL及其位于OC細(xì)胞膜上的RANK和假性受體OPG。OPG與RANKL之間有著很高的親和力，進(jìn)而競爭抑制RANKL和RANK間的互相作用，抑制OC分化[9]。OPG可以抑制成熟OC骨吸收、誘導(dǎo)其凋亡，可引起B(yǎng)MD升高[9]。PMOPF內(nèi)OPG表達(dá)下降，說明其競爭抑制OC減弱，促進(jìn)了OP進(jìn)一步發(fā)生。RANKL是研究發(fā)現(xiàn)唯一具有刺激OC分化及成熟，并阻止OC凋亡的因子[32]。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，PMOPF內(nèi)RANKL表達(dá)上升，說明RANKL促進(jìn)OC分化引起OP。RANKL在其表達(dá)的多種組織中以骨組織中表達(dá)最強(qiáng)[33]，故本實(shí)驗中檢測PMOPF內(nèi)RANKL表達(dá)上升在骨組織中較血清中更為明顯。OPG在骨折28 d內(nèi)水平降至最低，RANKL在骨折7 d內(nèi)水平升至最高，之后出現(xiàn)小幅度上升或下降，反映了其在破骨中的變化趨勢，也可能存在PMOPF后成骨有所增加抑制了RANKL有關(guān)。

在LGR4/RANKL/RANK傳導(dǎo)信號通路中，LGR4為RANKL的一個重要的受體。在OC分化過程中LGR4和RANK競爭結(jié)合RANKL，抑制典型的RANKL/RANK作用，抑制體內(nèi)OC分化[10]。Luo等[10]體外研究表明，LGR4缺乏促進(jìn)OC形成，抑制OC凋亡。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)LGR4在PMOPF組中表達(dá)下降，推論表明LGR4抑制OC作用減弱，同時RANKL在PMOPF組內(nèi)表達(dá)升高，這符合LGR4和RANK競爭結(jié)合RANKL，并抑制RANKL/RANK破骨的作用。LGR4在骨折28 d內(nèi)水平降至最低，反映了LGR4緩慢持久的變化趨勢。LGR4負(fù)向調(diào)控OC分化可用于治療OP等疾病[34]。人的全基因組測序也發(fā)現(xiàn)LGR4對OPF的作用很大[35]。地諾單抗作為特異性靶向RANK配體的抗體阻斷RANKL與RANK的結(jié)合導(dǎo)致OC滅活，其作為治療OP的一線選擇的副作用有鈣穩(wěn)態(tài)失衡等[36]。而相關(guān)研究LGR4-ECD蛋白在小鼠中比OPG與RANKL結(jié)合親和力低，對小鼠的生理負(fù)影響小，以上研究說明LGR4拮抗RANKL副作用的優(yōu)勢對治療OP有很大的價值[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)PMOPF與Wnt/β-catenin、BMP-2/Runx2/Osterix、OPG/RANKL、LGR4/RANKL通路的相關(guān)因子影響成骨、破骨有關(guān)，各因子在PMOPF各組中出現(xiàn)分時段變化。因此，可通過干預(yù)這些因子水平的變化促進(jìn)PMOPF愈合，降低其并發(fā)癥的發(fā)生。