NGR 修飾唑來膦酸長循環(huán)脂質(zhì)體制備及其表征研究

葉雪丹 顧露囡 王 增

第三代雙膦酸鹽類藥物唑來膦酸（zoledronic acid，ZOL）臨床上主要用于治療腫瘤相關(guān)高鈣血癥及惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移引起的骨痛。ZOL 血漿半衰期僅為15min，體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征影響ZOL 在腫瘤組織的分布，無法作用到腫瘤細(xì)胞，不利于臨床抗腫瘤治療[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，ZOL 能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macro-phages，TAMs）數(shù)量和活性，抑制腫瘤新生血管的生成，腫瘤細(xì)胞的侵襲、浸潤等作用，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。本課題組擬利用APN/CD13 在腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)的特性，合成APN/CD13 的配體天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸（Asn-Gly-Arg，NGR），將NGR 修飾在脂質(zhì)體表面，構(gòu)建具有腫瘤血管靶向功能的NGR 修飾ZOL 長循環(huán)脂質(zhì)體（NGR-PEG-ZOL-LPs），并對其進行表征，為進一步研究體內(nèi)外抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)[3]。

1 材料與方法

1.1 儀 器 高效液相色譜儀（日本島津公司，型號LC-20AD），激光粒徑分析儀（英國Malvern 公司，型號Nano-ZS），透射電子顯微鏡（日本Jeol 公司，型號JEM-1200EX），冷凍干燥機（美國LABCONCO 公司，型號Labconco FreeZone）。

1.2 試 劑 大豆卵磷脂（德國Ludwigshafen 公司，批號04010025119），膽固醇（美國Avanti Polar Lipids公司，批號Lot X0515），mPEG2000-DSPE（上海芃碩生物科技有限公司，批號Lot L003），Asn-Gly-Arg，NGR 多肽和NGR-mPEG2000-DSPE 由江蘇強耀生物科技有限公司合成（批號Lot L003），ZOL 原料藥（江蘇正大天晴醫(yī)藥股份有限公司，純度>99%，批號20180605），ZOL 標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號100778-201003），其他試劑均為分析純。

1.3 NGR-PEG-ZOL-LPs 制備 在圓底燒瓶中加入磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000、NGR-DSPE-PEG 2000（質(zhì)量比為20:7:5:6:0.4），加入6mL 氯仿/甲醇（4：2v/v）。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40℃減壓下除去溶劑，形成一層薄的脂膜。用預(yù)熱的6mg/mL ZOL pH7.6 緩沖鹽溶液水合，手動震搖。脂質(zhì)體懸浮液在60℃下放置水浴磁力攪拌30min，每15min 取出震搖，快速3次冷凍解凍（-80℃～37℃）。使用14000Da MWCO 透析袋針透析24h 去除游離ZOL。分級過濾后加入58mM 乳糖作為凍干支持劑，再過0.22μm 濾膜，放入-20℃冰箱內(nèi)預(yù)凍48h，抽真空干燥。

1.4 表征研究 取NGR-PEG-ZOL-LPs 樣品（稀釋20 倍）置于樣品池中，用Malvern ZS90 粒徑電位儀測定脂質(zhì)體的粒徑分布和電位，重復(fù)三次。取NGRPEG-ZOL-LPs 樣品（稀釋20 倍），用透射電鏡觀察其表面形態(tài)，采用懸滴法制備樣品，將納米粒水溶液滴加到銅網(wǎng)的支撐膜上，用濾紙小心吸干表面水分后，醋酸雙氧鈾染色，并用濾紙吸取多余的水，晾干，透射電鏡觀察其結(jié)構(gòu)。

1.5 包封率和載藥量檢測

1.5.1 ZOL 色譜條件建立 色譜柱：ZORBAX SBC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈：水相（焦磷酸鈉緩沖液，稱取焦磷酸鈉1.7804g，溶于500mL水，加3mL 10%四丁基氫氧化銨，用50%磷酸調(diào)節(jié)pH 至4.00）=4：96。流速：0.8mL/min；柱溫：30℃；紫外檢測波長：215nm；進樣量：20μL。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取1.07mg ZOL，用pH7.6 緩沖液制備成1070μg/mL 的儲備液。流動相稀釋儲備液并制備含ZOL 為66.88、33.44、16.72、8.36、4.18、2.09μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進樣20μL，記錄峰面積，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 包封率和載藥量測定 制備得到的ZOL 脂質(zhì)體裝入透析袋內(nèi)，透析24h，每隔4h 更換1 次pH7.6緩沖液。取100μL 透析后的樣品，加入300μL 甲醇超聲破壞，再加入600μL 流動相，9000rpm，離心5min，取上清液進HPLC。計算公式：EE%（W0-W1）/W0×100%。DL%＝（W0-W1）/Wt×100%（EE%：包封率；DL%：載藥量；W0：ZOL 投藥量；W1：未包裹進脂質(zhì)體中的藥物量；Wt：脂質(zhì)材料與脂質(zhì)體中ZOL 的質(zhì)量之和）。

2 結(jié)果

2.1 ZOL 色譜條件 NGR-PEG-ZOL-LPs 溶液中ZOL 的主峰與ZOL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液主峰的保留時間一致，說明脂質(zhì)體輔料對ZOL 的檢測無影響，方法專屬性良好。同時，根據(jù)色譜方法學(xué)研究得到的回歸方程為Y=18631X-1494.6，r2=1，表 明ZOL 在2.09～66.88μg/mL 內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系（見插頁圖1）。

圖1 ZOL 色譜圖

圖2 NGR-PEG-ZOL-LPs 透射電鏡圖（醋酸雙氧鈾染色×50000）

2.2 表征研究結(jié)果 透射電鏡下顯示NGR-PEGZOL-LPs 呈類圓形，大小分布均勻，無明顯聚集（見插 頁 圖2）。NGR-PEG-ZOL-LPs 的 平 均 粒 徑 為（271.43±9.23）nm，Zeta 電位為-（36.20±0.20）mv，多分散系數(shù)（PDI）為（0.15±0.03），理化性質(zhì)相對穩(wěn)定。

2.3 包封率和載藥量測定 根據(jù)公式計算，NGRPEG-ZOL-LPs 包封率為8.41%，載藥量為2.12%。

3 討論

靶向遞藥系統(tǒng)已成為腫瘤治療的有效策略。氨肽酶N（APN/CD13）是在腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高度表達(dá)的跨膜蛋白，NGR 是由Asn-Gly-Arg 組成的三肽小分子，對在腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)的APN/CD13 具有高度親和力，可以作為腫瘤血管靶向修飾物[4]。本研究將NGR 的氨基端與mPEG 2000-DSPE 的羧基端通過氨酰脫水縮合反應(yīng)形成NGR-mPEG2000-DSPE，親水端的NGR 多肽暴露在脂質(zhì)體外層，有利于其尋找腫瘤血管特異性靶點[5]。實驗結(jié)果顯示，NGR-PEG-ZOL-LPs 的Zeta 電位為-（36.20±0.20）mv，相關(guān)研究表明，當(dāng)Zeta 電位的絕對值>20 時，脂質(zhì)體相對穩(wěn)定，同時本研究組將脂質(zhì)體凍干粉重新用PBS 分散后測到的多分散系數(shù)（PDI）為（0.15±0.03），說明脂質(zhì)體分散性較好，不易出現(xiàn)聚集，有利于凍干粉臨床使用[6]。

同時，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NGR-PEG-ZOL-LPs 包封率為8.41%，可能主要有以下原因造成：（1）脂質(zhì)體的包封率與粒徑大小密切相關(guān)，粒徑越大，包封率也會越大；（2）與藥物的性質(zhì)有關(guān)，ZOL 水溶性較高，容易從脂質(zhì)體表面存在小孔泄漏出來，導(dǎo)致包封率的下降。因此，我們將在下一步研究中提高ZOL 的包封率。

本研究以腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的炎癥細(xì)胞群TAMs 作為靶點，是腫瘤治療的潛在靶點。TAMs 大量存在于腫瘤血管周圍、無血管區(qū)和低氧區(qū)，其中M2型TAMs（M2-TAMs）則在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫抑制、新生血管形成等方面發(fā)揮了不可忽視的重要作用，不僅是侵入實體腫瘤中單核細(xì)胞群的主要組成細(xì)胞，也是炎癥進展成癌癥的主要橋梁[7-8]。臨床樣本檢測表明，M2-TAMs 在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌等上皮來源的腫瘤組織中大量存在，是引起這些腫瘤耐藥、轉(zhuǎn)移、侵襲的重要因素[9]。由此可見，抑制M2-TAMs 的功能，減少其數(shù)量，是提高抗腫瘤效果的有效手段。

本實驗制備的NGR-PEG-ZOL-LPs 理化性質(zhì)穩(wěn)定，本課題組將通過體內(nèi)實驗進一步探討NGRPEG-ZOL-LPs 對M2-TAMs 抑制作用。