中藥復(fù)方制劑對鴨沙門氏菌病治療效果研究

李心海，任士飛，張林吉

中藥復(fù)方制劑對鴨沙門氏菌病治療效果研究

李心海，任士飛，張林吉

（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221151）

選取白頭翁、連翹、黃連、石榴皮等16種中藥組成5種中藥組方，將中藥超聲波震蕩后煎煮制得水煎劑。采用打孔法制備5種中藥組方的藥敏片，將中藥藥敏片和抗菌藥藥敏片共同進行藥敏試驗，得出中藥組方2及環(huán)丙沙星對沙門氏菌有較好的抑菌效果。動物攻毒保護試驗得出中藥組方2高劑量的保護效果僅次于環(huán)丙沙星的保護效果。由于抗生素易產(chǎn)生耐藥性，可用中藥制劑防治鴨沙門氏菌病。

沙門氏菌；中藥；藥敏試驗

沙門氏桿菌在環(huán)境中廣泛存在，能引起各種日齡的家禽發(fā)病，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成很大損失。而用抗生素治療沙門氏菌病，會造成用藥量大、費用高、產(chǎn)生耐藥性、產(chǎn)生毒性等一系列問題。為此，我們選擇中藥制劑來防治沙門氏菌病，取得較好的療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 白頭翁、連翹、黃連、石榴皮、黃柏、大黃、黃芩、甘草、吳茱萸、苦參、蒲公英、穿心蓮、金銀花、五倍子、五味子、烏梅，購自徐州益豐大藥房。環(huán)丙沙星、新霉素、恩諾沙星等各種藥敏片購自徐州某生物科技公司。

1.1.2 菌株 鴨沙門氏菌，由徐州市生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物實驗室分離并保存。

1.1.3 動物 于孵化場購入1日齡雛鴨，經(jīng)沙門氏菌抗體檢測，呈陰性。

1.1.4 培養(yǎng)基 普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)液、無水乙醇、顯色培養(yǎng)基，均購自徐州某生物科技公司。

1.1.5 試劑 甲醛溶液、EDTA、乙醇、生理鹽水均購自徐州某生物科技公司。

1.1.6 儀器 高壓蒸氣滅菌鍋、中草藥粉碎機、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、烘箱、游標卡尺、超聲波震蕩器、高速離心機等。

1.2 中藥組方及菌液制備

1.2.1 中藥組方 選擇對鴨沙門氏菌有抑菌效果的單味中藥，結(jié)合中藥的組方原則，配制了5個復(fù)方制劑(見表1)。

1.2.2 中草藥液的制備 中藥組方1~5按照組方的比例稱取，每一組方共計200g。燒杯編號1~ 5，將中藥組方分裝到相應(yīng)編號的燒杯中，各加入2000ml的純凈水，浸泡24h。浸泡后用超聲波震蕩器作用20min，充分溶解藥物的有效成分。先用武火煮沸，后用文火煎煮20min，再用4層紗布過濾藥液。將藥渣加1000min純凈水。先用武火煮沸，后用文火煎煮20min，再用4層紗布過濾藥液。將2次制得的藥液合并，用文火煎煮濃縮至200m，使生藥含量1g/ml。將生藥分裝，用高壓滅菌器滅菌20min，放置于4℃冰箱冷藏保存。

表1 中藥復(fù)方制劑組成及含量 (g)

1.2.3 菌液培養(yǎng) 將保存的沙門氏菌菌種接種于普通肉湯中，于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，可見沙門氏菌在普通肉湯生長良好。然后將復(fù)活的沙門氏菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，選取典型菌落，接種LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫箱培養(yǎng)18h，使其濁度達到1.0×108CFU/ ml。置于冰箱4℃冷藏。

1.3 抑菌試驗

1.3.1 藥敏紙片的制備 用打孔器將中性濾紙打成直徑為8mm的圓片，每個青霉素小瓶裝20片，放入高壓滅菌器滅菌。在無菌操作臺上，用移液槍取配制好的中藥制劑向青霉素小瓶加入800μl，浸泡12h，使每片含為40μl藥量。于37℃烘干，放于冰箱4℃冷藏備用。

1.3.2 抑菌試驗及判定標準 吸取800μl復(fù)活后的鴨沙門氏菌液接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，并均勻涂抹。將5種中藥制劑藥敏片及各種抗菌藥藥敏片貼于培養(yǎng)基上，并做好標記。將培養(yǎng)皿倒置放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。中藥制劑藥敏片的判定標準，抑菌圈直徑d>20mm為高度敏感，15mm≤抑菌圈直徑d≤20mm為中度敏感，10mm≤抑菌圈直徑d<15mm為低度敏感，抑菌圈直徑d<10mm為耐藥。各種抗菌藥藥敏片抑菌標準判定以中國藥檢所制定的標準判斷。

1.3.3 人工模型的建立 選取6日齡肉鴨240只，每只注射鴨沙門氏菌培養(yǎng)液0.5ml。隨機分成7組，每組30只。

1.4 預(yù)防試驗

組1~組5為中藥制劑治療組，組6為頭孢唑啉治療組，組7為攻毒陽性對照組。另設(shè)健康陰性對照組30只同日齡雛鴨。分別隔離飼養(yǎng)，觀察鴨的發(fā)病情況，分組情況見表2。

表2 分組及給藥 (g.kg-1)

2 結(jié)果與分析

2.1 攻毒后情況

攻毒24h后雛鴨開始發(fā)病，出現(xiàn)臨床癥狀食欲下降，離群，嗜睡。解剖可見心包內(nèi)積液有滲出物，肝臟腫大呈銅綠色，腸黏膜脫落，盲腸腫大，內(nèi)有腸栓，脾臟壞死。取肝臟觸片，放在顯微鏡下鏡檢可見革蘭氏陰性小桿菌。將病料接種顯色培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，觀察菌落呈紫色。

2.2 中藥組方對鴨沙門氏菌藥敏試驗結(jié)果

組方1的抑菌圈直徑為13.1mm，為低度敏感；組方2的抑菌圈直徑為20.2mm，為高度敏感；組方3、組方4、組方5的抑菌抑菌圈直徑分別為17.6、15.3、16.7mm，為中度敏感(見表3)。

表3 中藥組方對鴨沙門氏菌藥敏試驗結(jié)果

2.3 抗菌藥物藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示，沙門氏菌菌株對環(huán)丙沙星、頭孢唑啉等藥物敏感(見表4)。

2.4 預(yù)防試驗

對雛鴨注射沙門氏菌菌液24h后，雛鴨逐漸出現(xiàn)發(fā)病癥狀，并有死亡病例出現(xiàn)。攻毒陽性對照組癥狀明顯，死亡較多，7d后只有1只存活。健康陰性對照組有3只死亡，平均增重892g。環(huán)丙沙星組有4只死亡，保護率87%，平均增重863g。組方2低、中、高3個劑量組試驗結(jié)果可見，高劑量組效果最好，死亡5只，保護率83%，接近于環(huán)丙沙星組；平均增重885g高于環(huán)丙沙星組(見表5)。

表4 抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果 (mm)

表5 部分藥物給藥效果試驗結(jié)果

3 討論

（1）中獸醫(yī)辨證認為沙門氏菌病是由疫毒內(nèi)侵、肺胃熱盛、血瘀氣滯引起，治療應(yīng)清熱解毒、涼血止瀉[1]。白頭翁、黃連、黃柏、黃芩、苦參、蒲公英、穿心蓮性苦、寒，具有清熱解毒的功效；石榴皮性酸、澀，具有止血，止瀉的功能；吳茱萸性苦辛，祛寒止痛；金銀花性甘寒，具有清熱解毒、消炎的功效；五倍子、烏梅性酸、澀具有止血、收濕的功能；五味子性酸、甘，具有收斂的功效；甘草可以調(diào)和中藥。藥敏試驗表明16種中藥組成的5種中藥組方對鴨沙門氏菌均有一定的抑制效果。其中，組方2的抑菌圈直徑為20.2mm，為高度敏感。（2）中草藥具有不易產(chǎn)生耐藥性，且能調(diào)節(jié)機體的免疫機能及無殘留等特點[2]。在藥物預(yù)防試驗中，中藥組方2高、中、低劑量拌入飼料，觀察防治和增重效果。結(jié)果表明，高劑量組的防治和增重效果最優(yōu)，僅次于抗菌藥環(huán)丙沙星組的效果，說明可以用中藥組方2作為抗菌藥的替代藥物。

[1] 馮翠蘭, 馮國金, 林崇瑜, 等. 中草藥治療鴨腸炎沙門氏菌病作用機制的初步研究 [J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2005(3): 45-48.

[2] 劉立新, 劉芳萍, 李睿, 等. 雞白痢沙門氏菌耐藥性中藥抑制劑的臨床治療效果[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2009, 40(1): 89-91.

（2020–07–22）

S853.73+2

A

1007-1733(2020)11-0015-03