具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的益生乳酸菌篩選

曾 珠 陳艷玲 陳尚武

(1.西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院， 重慶 400715； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400715；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083)

0 引言

Ⅱ型糖尿病(T2DM)是一種發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜的慢性代謝紊亂性疾病，以胰島素抵抗和胰島細(xì)胞損傷導(dǎo)致的慢性高血糖為主要特征[1]。傳統(tǒng)的糖尿病藥物(如雙胍類、磺酰脲類、噻唑烷二酮類等)成本高、副作用大，且治標(biāo)不治本。因此，尋找新型經(jīng)濟(jì)安全的糖尿病藥物具有重要意義。

α-葡萄糖苷酶抑制劑是20世紀(jì)90年代開發(fā)的降糖藥物，是目前臨床治療T2DM的一線口服藥物。α-葡萄糖苷酶抑制劑主要作用于位于腸系膜刷狀緣的α-葡萄糖苷酶，通過抑制α-葡萄糖苷酶分解多糖為葡萄糖的作用，從而減緩葡萄糖的吸收速度和降低血糖水平[2]。常見的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要有阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)和米格列醇(Miglitol)[3]。阿卡波糖最初是從游動(dòng)放線菌的次級代謝物中分離而來，因此許多α-葡萄糖苷酶抑制劑的微生物源研究都是從土壤中的放線菌入手[4]，目前，已用于臨床治療的α-葡萄糖苷酶抑制劑也主要來源于放線菌(井岡霉素產(chǎn)生菌和野尻霉素產(chǎn)生菌)。

乳酸菌被公認(rèn)是安全的食品級微生物，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品生產(chǎn)和食品保藏方面，已經(jīng)有非常悠久的歷史[5-6]。乳酸菌中的某些菌株被認(rèn)為是益生菌，對人體具有多種益生功能[7-11]，常見的有乳酸桿菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌等。由于乳酸菌的天然、安全和益生特性，近年來已成為防治糖尿病的研究熱點(diǎn)[12-16]。關(guān)于乳酸菌防治糖尿病的研究大多是直接通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，具體的調(diào)節(jié)機(jī)理并不清楚，同時(shí)也沒有初步篩選具有潛在降血糖功能的乳酸菌的方法。抑制α-葡萄糖苷酶的活性是調(diào)控糖尿病的主要方法之一，乳酸菌具有的調(diào)節(jié)血糖的功能有可能通過這種機(jī)制發(fā)揮作用，因此體外具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的乳酸菌將是潛在的輔助抗糖尿病的益生菌株。益生菌對宿主發(fā)揮有益作用的前提是能夠通過胃腸道的一系列物理和化學(xué)障礙到達(dá)腸道，并在腸道中定植。因此，一株良好的益生菌必須對模擬的人胃腸道條件具有耐受性，同時(shí)要具有較強(qiáng)的黏附腸道上皮細(xì)胞的能力。

本文基于對α-葡萄糖苷酶的抑制能力和乳酸菌的基本益生特性，包括對人工模擬胃腸液的耐受性和粘附性的考查，篩選具有潛在降血糖作用的益生菌，以期為開發(fā)功能益生菌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胃蛋白酶、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、Transwell insert小室、堿性磷酸酶試劑盒，美國Sigma公司；Tris(氨基丁三醇)、胰蛋白酶，美國Amresco公司；DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶(含0.02% EDTA (乙二胺四乙酸))、雙抗(青、鏈霉素)，美國Gibco公司；胎牛血清，杭州四季青公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔酶標(biāo)板，美國Corning公司；SYBR Green 熒光定量試劑盒，北京Tiangen公司。

TP-2102型電子天平，美國DENVER儀器公司；FA2004B型分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；90-2型恒溫磁力攪拌器，上海振榮科學(xué)儀器有限公司；UB-7型 pH計(jì)，美國DENVER儀器公司；YX-280D手提式壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，美國Thermo Electron公司；SClENTZ-IID型超聲破碎儀，寧波新芝生物科技公司；MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；倒置生物顯微鏡，北京奧特偉業(yè)光學(xué)儀器有限公司；LightCycler 96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))儀，羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1豬小腸α-葡萄糖苷酶的提取

新鮮的豬小腸粘膜用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值6.8)沖洗干凈，然后用載玻片刮取小腸粘膜加入等體積的PBS(pH值6.8)進(jìn)行低溫研磨。研磨充分的混合液在4℃下12 000 r/min離心20 min，收集上清液凍存于-80℃，使用時(shí)用PBS(pH值6.8)稀釋10倍使用。

1.2.2乳酸菌分泌上清的制備

本實(shí)驗(yàn)采用的乳酸菌為實(shí)驗(yàn)室前期分離保存的乳酸菌菌株，其中鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusGG(LGG)作為參考菌株。將菌株活化后，12 000 r/min室溫(20℃)下離心15 min，PBS(pH值6.8)洗滌3遍。然后用PBS(pH值6.8)將菌體濃度調(diào)整為5×1010CFU/mL，37℃孵育6 h(預(yù)實(shí)驗(yàn)表明在6 h時(shí)α-葡萄糖苷酶抑制活性最高)，孵育完成后進(jìn)行離心(12 000 r/min,15 min)，取上清液凍存于-80℃待用。

1.2.3乳酸菌α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參照文獻(xiàn)[13]測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，反應(yīng)體系為100 μL。首先將25 μL的底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG,10 mmol/L)和25 μL的樣品混勻后37℃孵育10 min，然后加入50 μL α-葡萄糖苷酶混勻后于37℃反應(yīng)30 min。隨后迅速加入100 μL Na2CO3(0.1 mol/L)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定405 nm處的吸光度。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。其中，樣品的吸光度用樣品空白對照(體系中用50 μL PBS(pH值6.8)代替α-葡萄糖苷酶)的吸光度進(jìn)行校準(zhǔn)。陰性對照(體系中無抑制α-葡萄糖苷酶的樣品)用25 μL PBS(pH值6.8)代替樣品，陰性空白對照(體系中沒有α-葡萄糖苷酶活性)用25 μL PBS(pH值6.8)代替樣品，50 μL PBS(pH值6.8)代替α-葡萄糖苷酶。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式為

式中A——樣品在405 nm處的吸光度

B——樣品空白對照在405 nm處的吸光度

C——陰性對照在405 nm處的吸光度

D——陰性空白對照在405 nm處的吸光度

1.2.4乳酸菌在人工模擬胃腸液中的存活率

方法參照文獻(xiàn)[13]。首先是模擬胃腸液的配置。模擬胃液(Gj)的配置方法：將胃蛋白酶用pH值2.5 的PBS 溶解，使其終質(zhì)量濃度為3 g/L。模擬十二指腸液(Dj)的配置方法：將膽鹽和胰蛋白酶用pH值 5.0的PBS溶解，使其終質(zhì)量濃度分別為3 g/L和1 g/L。模擬腸液(Ij)的配置方法：將胰蛋白酶用pH值8.0的PBS溶解，使其終質(zhì)量濃度為1 g/L。所有配好的胃腸液經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾。將活化第2代的乳酸菌于MRS培養(yǎng)基中37℃靜止培養(yǎng)18 h，離心收集菌體并用PBS(pH值7.4)洗滌2遍，重懸于同樣體積的模擬Gj(pH值2.5)中，37℃靜止培養(yǎng)3 h，然后取出1 mL菌液置于9 mL的模擬Dj(pH值5.0)中，37℃靜止培養(yǎng)2 h。最后從模擬Dj中取出1 mL菌液置于模擬Ij (pH值8.0)中37℃靜止培養(yǎng)8 h。分別于0、2、3、8 h取樣進(jìn)行梯度稀釋，于MRS固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。乳酸菌在人工模擬胃腸液中存活率計(jì)算公式為

式中a——在模擬胃腸液中孵育特定時(shí)間后的活菌數(shù)

b——每次孵育前乳酸菌總的活菌數(shù)

1.2.5乳酸菌對HT-29細(xì)胞的黏附性分析

黏附方法參照文獻(xiàn)[13]。HT-29細(xì)胞(15～20代)用DMEM培養(yǎng)基(含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%雙抗)于37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖至90%融合時(shí)，用0.25%的胰酶消化后傳代。

對于黏附實(shí)驗(yàn)，將胰酶消化后的細(xì)胞按照105個(gè)/孔接種于24孔板中，于37℃培養(yǎng)24 h，然后用PBS(pH值7.4)洗滌2遍。與此同時(shí)，將靜置培養(yǎng)12 h的乳酸菌6 000 r/min常溫離心5 min，并用PBS(pH 值7.4)洗滌2遍，重懸于不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)整其菌體濃度為109CFU/mL，然后取1 mL菌懸液加入準(zhǔn)備好的HT-29細(xì)胞中，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育完成后，用PBS(pH值7.4)洗滌細(xì)胞6遍去掉未黏附的乳酸菌。單層細(xì)胞用甲醇固定后進(jìn)行革蘭氏染色。每個(gè)樣品隨機(jī)選20個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞和乳酸菌數(shù)，以平均每個(gè)細(xì)胞上黏附的乳酸菌數(shù)目來評價(jià)乳酸菌對腸上皮細(xì)胞的黏附能力。

1.2.6乳酸菌在不同生長階段的α-葡萄糖苷酶抑制活性

將菌株活化2代后按體積分?jǐn)?shù)1%接種到300 mL MRS培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每隔2 h測菌株的600 nm處吸光度及pH值，并取出10 mL菌懸液12 000 r/min常溫離心15 min，收集菌體，PBS(pH值6.8)洗滌3遍，重懸于200 μL PBS(pH值6.8)中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)后進(jìn)行離心，取上清液凍存于-80℃用于測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.2.7Transwell細(xì)胞模型的建立及評估

Caco-2細(xì)胞(10～20代)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%雙抗和1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞貼壁融合率約為80%時(shí)，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞以后，按照密度105個(gè)/cm2接種于6孔板的Transwell小室中(膜孔徑0.4 μm，直徑24 mm，底面積4.67 cm2)。腸腔側(cè)加入1 mL細(xì)胞懸液，基底側(cè)加入3 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，第1～7天隔天換液，從第8天開始每天換液，直到細(xì)胞形成單層致密的細(xì)胞膜。

Transwell細(xì)胞模型的評估：檢測細(xì)胞的跨膜電阻值，待跨膜電阻達(dá)到最大，用試劑盒檢測細(xì)胞的堿性磷酸酶(AKP)極性，腸腔測得的AKP活性應(yīng)顯著高于基底側(cè)[17]。

1.2.8乳酸菌對Caco-2細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶的影響

將已培養(yǎng)好的Transwell小室用PBS洗滌3次，去除葡萄糖。加入800 μL含20 mmol/L的麥芽糖作為底物，并加入乳酸桿菌的上清200 μL(共1 mL)到小室的上層，下層加入3 mL PBS，于37℃培養(yǎng)2 h，從上層取10 μL溶液到微孔板中檢測葡萄糖含量，以此計(jì)算對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，并用試劑盒提取Caco-2的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，α-葡萄糖苷酶基因擴(kuò)增引物為：上游引物5′ CGACGGAGAAGCAGTGGAAG 3′；下游引物5′ GGGTTGGTCTCTTGTGAACATTC 3′。β-actin(β肌動(dòng)蛋白)內(nèi)參引物：上游引物5′ TGACGTGGACATCCGCAAAG3′；下游引物5′ CTGGAAGGTGGACAGCGAGG3′。采用ΔΔCT法計(jì)算基因的表達(dá)量[18]，每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20軟件分析數(shù)據(jù)，成對比較采用Student’sT檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組比較采用One-Way ANOVA中Duncan’s多重檢驗(yàn)來分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株

所選用的10株乳酸菌(表1)均分離于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，包括新鮮牛乳、奶酪(奶疙瘩)和泡菜。這10株菌中，有5株屬于副干酪乳桿菌屬，2株屬于植物乳桿菌屬，3株屬于發(fā)酵乳桿菌屬。乳酸菌中研究最廣泛的益生菌株鼠李糖乳桿菌LGG作為參考菌株。

表1 乳酸菌菌株及來源Tab.1 Lactic acid bacteria strains and their sources

2.2 乳酸菌對豬小腸提取的α-葡萄糖苷酶的抑制活性

所有選用菌株的分泌上清均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率在6%～31%不等，其中副干酪乳桿菌L14的抑制活性最高，為31%，其次是副干酪乳桿菌Z3-11(28%)、植物乳桿菌NL42(27%)和發(fā)酵乳桿菌Z2-91(27%)，這4株菌的抑制率與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG(28%)相比無顯著性差異。已有部分研究報(bào)道乳酸菌的發(fā)酵上清具有α-葡萄糖苷酶抑制活性[13,20]，與本研究結(jié)果保持一致。

α-葡萄糖苷酶抑制活性很大程度上受到α-葡萄糖苷酶來源的影響，最常見的來源是哺乳動(dòng)物和微生物酵母[21-23]。例如，酸奶對來源于哺乳動(dòng)物的α-葡萄糖苷酶不具有抑制活性但卻能抑制來源于酵母的α-葡萄糖苷酶[22]；合成的阿卡波糖對來源于酵母的α-葡萄糖苷酶幾乎沒有抑制活性，卻對來源于哺乳動(dòng)物的α-葡萄糖苷具有很強(qiáng)的抑制活性。這些抑制活性的差別可能歸因于不同來源的酶結(jié)構(gòu)不同所導(dǎo)致的抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)不同[22,24]。因此，本研究中，為了探究與人類健康密切相關(guān)的乳酸菌的α-葡萄糖苷酶抑制活性，選取的是來源于哺乳動(dòng)物的α-葡萄糖苷酶。

2.3 乳酸菌對人工模擬胃腸液的耐受能力

益生菌發(fā)揮對人體的有益作用的前提是必須活著通過人體胃腸道環(huán)境。因此，進(jìn)一步研究所選用菌株對人工模擬胃腸液的耐受性。首先，胃液的極低pH值(2.5～3.5)是阻止細(xì)菌進(jìn)入人體腸道的天然屏障，而食物一般需要在胃中停留2～4 h進(jìn)行消化[25]。由表2可知，LGG、Z3-11和CA14具有較強(qiáng)的抵抗低pH值的能力，在pH值2.5的模擬胃液中存活率超過80%，但是4株菌株(C、SW2、NL31和Z2-91)在模擬胃液中的存活率很低，在同樣稀釋度的情況下未檢測到活菌，說明乳酸菌對人工模擬胃液的耐受性具有菌株差異性。有研究表明菌株的耐酸能力依賴于其H+-ATP酶的活性[26]，所以本文中不同菌株的耐酸能力不同可能與它們的H+-ATP 酶的活性有關(guān)。

表2 乳酸菌在人工模擬胃腸液中的存活率Tab.2 Tolerance of lactic acid bacteria strains to simulated gastrointestinal conditions %

在模擬十二指腸液中，PC41具有最高的存活率，為84.9%。其次是L14、NL41和NL42，存活率超過60%。膽鹽可通過破壞細(xì)胞膜的完整性對活細(xì)胞造成巨大的損害[27]，因此對十二指腸液耐受性高可能是因?yàn)榫陮δ扄}耐受能力好[27-28]。

在模擬腸液中培養(yǎng)8 h后，菌株的存活率得以提高，Z3-11的存活率最高，為98.5%。在模擬腸液中菌株存活率增加可能是因?yàn)槟c液的pH值升高和排除了膽鹽的脅迫。

2.4 乳酸菌對腸上皮細(xì)胞的黏附能力

乳酸菌黏附腸上皮細(xì)胞的能力是長期以來用于篩選益生菌的一個(gè)非常重要的指標(biāo)，因?yàn)槿樗峋挥叙じ接谒拗鞯哪c上皮細(xì)胞才能夠促進(jìn)其長期定植，發(fā)揮免疫功能以及抑制腐敗菌的生長[29-30]。HT-29為人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞，是體外檢測微生物黏附性常用的一種細(xì)胞系。除Z3-11、CA14和Z2-91外，所有被檢測菌株黏附腸上皮細(xì)胞HT-29的能力均顯著高于參考菌株LGG。PC41具有非常強(qiáng)的黏附腸上皮細(xì)胞的能力，每個(gè)細(xì)胞黏附的菌數(shù)約為148，其次是SW2、NL42和L14，每個(gè)細(xì)胞黏附的菌數(shù)分別為80、49和37。細(xì)菌對腸上皮細(xì)胞的黏附能力通常是由細(xì)菌表面的成分所介導(dǎo)，包括黏附蛋白、胞外多糖、脂磷壁酸、S層蛋白以及胞外的一些附屬物(如菌毛和鞭毛等)[31]。例如，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的黏附蛋白SpaCBA、MBF、MabA和SpaFED是介導(dǎo)益生菌L.rhamnosusGG參與黏附腸上皮細(xì)胞的主要因子[32-35]。胞外多糖和2個(gè)黏附蛋白N506_1778、N506_1709是參與益生菌L.gasseriDSM 14869黏附陰道上皮細(xì)胞的主要因子[36]。本研究中黏附能力較強(qiáng)的菌株P(guān)C41、SW2、NL42和L14沒有菌毛或鞭毛，因此，可能是它們表面的一些黏附因子(如胞外多糖、黏附蛋白)參與對上皮細(xì)胞的黏附。下一步可通過對它們進(jìn)行基因組測序及生物信息學(xué)分析深入探討?zhàn)じ降姆肿訖C(jī)理。

結(jié)合這10株乳酸菌對豬小腸提取的α-葡萄糖苷酶的抑制能力、人工模擬胃腸液的耐受性及對腸上皮細(xì)胞的粘附性，菌株L14、Z3-11和NL42的α-葡萄糖苷酶抑制活性較為突出，且更有可能活著通過腸道并在腸道中定植，可作為潛在的輔助調(diào)節(jié)糖尿病的益生菌株，因此選擇這3株菌作進(jìn)一步的研究。

2.5 乳酸菌在不同生長階段的α-葡萄糖苷酶抑制活性

以α-葡萄糖苷酶抑制活性較高且具有較好的益生特性的3株菌(副干酪乳桿菌L14和Z3-11及植物乳桿菌NL42)為例來研究乳酸菌在不同生長階段分泌上清的α-葡萄糖苷酶抑制率。圖1是L14、Z3-11和NL42在生長過程中的600 nm處OD值和α-葡萄糖苷酶抑制率的變化。菌株L14的對數(shù)生長期是2～10 h，600 nm處OD值由0.2升到2.2，其分泌上清的α-葡萄糖苷酶抑制率隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在穩(wěn)定期(12 h時(shí))達(dá)到最大，在接下來的12 h，細(xì)胞600 nm處OD值略有降低，α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸降低。菌株Z3-11和NL42的生長模式及α-葡萄糖苷酶抑制率的變化趨勢與L14幾乎相同，其分泌上清的α-葡萄糖苷酶抑制率也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在穩(wěn)定期(12 h時(shí))或?qū)?shù)末期(6 h時(shí))達(dá)到最大。乳酸菌分泌上清的α-葡萄糖苷酶抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是因?yàn)樵谇捌诰w濃度較低導(dǎo)致具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的功能成分濃度也較低；隨著菌株的生長，菌體濃度逐漸升高，其分泌的功能活性成分濃度也增加，因此α-葡萄糖苷酶抑制活性也逐漸增加；隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長，微生物細(xì)胞逐漸老化并出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，因此具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分可能會(huì)被菌體裂解產(chǎn)生的酶破壞，加上乳酸菌本身代謝產(chǎn)酸，導(dǎo)致生長后期培養(yǎng)液的pH值極低，而功能活性成分可能在極低pH值中不穩(wěn)定，因此出現(xiàn)抑制活性下降的趨勢。

圖1 乳酸菌在不同生長階段的α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.1 α-glucosidase inhibition during growth of Lactobacillus strains

2.6 乳酸菌對Caco-2細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶的抑制作用

Caco-2細(xì)胞為人的結(jié)直腸腺癌細(xì)胞，在Transwell小室中，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)能分化出與人體內(nèi)小腸上皮細(xì)胞類似的結(jié)構(gòu)，包括基底層(相當(dāng)于腸內(nèi)壁一側(cè))和細(xì)胞絨毛層(相當(dāng)于腸腔一側(cè))，并且可以合成各種酶類，如α-葡萄糖苷酶。該細(xì)胞模型目前已廣泛用于研究生化、毒理及藥物吸收和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。上文發(fā)現(xiàn)乳酸菌的分泌上清對豬小腸提取的α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，因此需進(jìn)一步研究乳酸菌是否對來源于人腸道的Caco-2細(xì)胞系的α-葡萄糖苷酶活性也具有抑制作用，同時(shí)研究乳酸菌對α-葡萄糖苷酶基因表達(dá)量的影響。

2.6.1Transwell細(xì)胞模型建立

將Caco-2細(xì)胞接種到6孔板的Transwell小室中，培養(yǎng)至細(xì)胞形成單層致密的細(xì)胞膜。在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，分別檢測細(xì)胞跨膜電阻及堿性磷酸酶(AKP)的極性。

如圖2所示，在培養(yǎng)期間，細(xì)胞的跨膜電阻(TEER值)逐漸增加，從第18天開始已達(dá)到最大且基本保持穩(wěn)定。TEER值是反映細(xì)胞單層完整性的重要指標(biāo)，其與細(xì)胞緊密連接的程度有直接關(guān)系，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞的緊密連接逐漸完善，因此TEER值也逐漸增加，TEER值越大，表明細(xì)胞單層越致密越完整[37]。本研究中培養(yǎng)18 d后細(xì)胞TEER值達(dá)到穩(wěn)定，說明Caco-2細(xì)胞已形成了完整的單層細(xì)胞膜。

圖2 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)期間細(xì)胞跨膜電阻TEER值的變化曲線Fig.2 TEER values of Caco-2 cell monolayer during process of growth

AKP極性檢測結(jié)果見圖3，在培養(yǎng)過程中，基底側(cè)AKP活性幾乎無變化，腸腔側(cè)AKP活性則逐漸增加，在第21天時(shí)， 細(xì)胞單層腸腔側(cè)的AKP活性顯著高于基底側(cè)，約高出2.34倍，表明細(xì)胞單層已經(jīng)形成了極性，標(biāo)志酶AKP已大部分集中在刷狀緣側(cè)。

圖3 Caco-2單層細(xì)胞腸腔側(cè)(AP)和基底側(cè)(BL)的堿性磷酸酶活性(n=3)Fig.3 Alkaline phosphatase activity of Caco-2 monolayer sides of AP and BL (n=3)

綜合跨膜電阻值和堿性磷酸酶AKP活性，Caco-2細(xì)胞在Transwell小室中培養(yǎng)21 d時(shí)已生長和分化成類似于腸上皮細(xì)胞的單層細(xì)胞，并且具有上皮細(xì)胞的極化特征。

2.6.2乳桿菌對Caco-2細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶的影響

乳桿菌L14、Z3-11和NL42的分泌上清對Caco-2細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶的酶活性均具有抑制作用，其中L14的抑制率最高，為28%，顯著高于Z3-11(22%)和NL42(19%)，菌株Z3-11和NL42的抑制率沒有顯著性差異。3株菌均可顯著抑制Caco-2細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶的mRNA表達(dá)量，抑制率分別為58%、21%和38%，表明乳酸菌對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性及酶的表達(dá)量發(fā)揮雙重作用，從而有效減緩碳水化合物的分解速度，減少單糖的生成。文獻(xiàn)[38]報(bào)道兩歧雙歧桿菌F-35對Caco-2細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶的活性及mRNA表達(dá)水平都具有抑制作用，本研究結(jié)果與其保持一致。

大部分的α-葡萄糖苷酶抑制劑是糖類或糖的衍生物，通過競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低多糖分解成葡萄糖的速率，使糖的吸收相應(yīng)減緩，起到降低血糖的作用。也有少部分非糖類化合物被報(bào)道對α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，如文獻(xiàn)[39]報(bào)道非糖類化合物如磺胺類藥可通過疏水作用直接結(jié)合在酶的活性位點(diǎn)上進(jìn)而發(fā)揮抑制作用，另外文獻(xiàn)[23,40]發(fā)現(xiàn)乳蛋白或雞蛋蛋白水解產(chǎn)生的多肽也具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性。關(guān)于乳酸菌的α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的研究，目前還沒有明確的結(jié)果，文獻(xiàn)[41]報(bào)道用產(chǎn)胞外多糖的菌株發(fā)酵的酸奶具有更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，推測這種抑制活性可能是由菌株產(chǎn)生的胞外多糖引起的，但是沒有進(jìn)一步純化出胞外多糖進(jìn)行驗(yàn)證，因此有關(guān)乳酸菌上清液中酶抑制劑的活性成分、抑制機(jī)理及影響因素，尚需進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)束語

本文將分離于傳統(tǒng)乳制品的10株乳桿菌進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定，并研究了乳酸菌的基本益生特性，包括耐酸、耐膽鹽和對腸上皮細(xì)胞的黏附性。結(jié)果表明，這10株菌對豬小腸提取的α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，結(jié)合乳酸菌的基本益生特性，最終篩選出了3株具有較高α-葡萄糖苷酶抑制活性和優(yōu)良益生特性的菌株，分別是副干酪乳桿菌L14、Z3-11和植物乳桿菌NL42；這3株菌在Caco-2細(xì)胞建立的Transwell模型中也能對α-葡萄糖苷酶發(fā)揮抑制活性。本文篩選出的3株乳桿菌可作為潛在的輔助降血糖的益生菌株，為功能益生菌的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。