PRRSV、PCV2和HPS混合感染的診斷及病理學(xué)分析

楊勇 金鑫 張望元 周煜 閆偉武 謝軍

摘要：為了解豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）與副豬嗜血桿菌（HPS）混合感染時(shí)的病理變化特征，對(duì)臨床收集的經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷為PRRSV、PCV2和HPS混合感染的8例患豬進(jìn)行大體病理變化與組織病理學(xué)變化觀察。結(jié)果表明，PRRSV、PCV2與HPS混合感染時(shí)大體病理學(xué)變化表現(xiàn)為胸腔與腹腔纖維素性滲出物增多，全身淋巴結(jié)腫大出血，肺尖葉與心葉實(shí)變，腎表面有出血點(diǎn)，肝表面有白斑。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)多發(fā)性漿膜炎、間質(zhì)性腎炎、化膿性肺炎、化膿性脾炎、化膿性淋巴結(jié)炎等。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒;豬圓環(huán)病毒2型;副豬嗜血桿菌;混合感染;病理學(xué)變化

中圖分類號(hào)：S858.28? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）18-0099-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.019 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Pathological analysis of co-infection of PRRSV，PCV2 and HPS

YANG Yong1，JIN Xin2，ZHANG Wang-yuan1，ZHOU Yi2，YAN Wei-wu3，XIE Jun2

（1. Jingshan Animal Disease Control and Prevention Centre，Jingshan? 431800，Hubei，China;2.Hubei Center for Animal Disease Control and Prevention，Wuhan? 430064，China;3.Hubei Agriculture Development Center，Wuhan? 430064，China）

Abstract： 8 cases of swine co-infected with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus（PRRSV）， Porcine Circovirus Type 2 （PCV2）， Haemophilusparasuis （HPS） were collected. In order to distinguish the difference in pathological between these three pathogens， gross pathology and histopathological were carried out. The results showed that when the swine co-infected with PRRSV， PCV2 and HPS， the gross pathology mainly included with increasing of fibrous exudation in the thoracic cavity and abdominal cavity， systemic lymph node enlargementing and hemorrhaging， consolidation of lung in tip and heart leaf， hemorrhagic spots on the surface of kidney and white spots on the surface of liver. The histopathological changed mainly showed polyserositis， interstitial nephritis， suppurative pneumonia， suppurative splenitis， suppurative lymphadenitis.

Key words： porcine reproductive and respiratory syndrome virus; porcine circovirus type2; Haemophilus parasuis; co-infection; pathological diagnosis

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）與副豬嗜血桿菌（HPS）是危害養(yǎng)豬業(yè)的常見病原。PRRSV和PCV2均是免疫抑制性病毒，豬感染后容易導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，繼而引起其他病毒或者細(xì)菌感染。副豬嗜血桿菌是一種豬的呼吸道病傳染病病原，該菌常繼發(fā)或混合感染其他病毒、細(xì)菌，造成高死亡率，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。宋宏立等[1]通過實(shí)驗(yàn)室診斷確診了一例PRRSV、PCV2和副豬嗜血桿菌的混合感染病例。Cheong等[2]通過對(duì)豬場(chǎng)的病料進(jìn)行PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PRRSV、PCV2和HPS這3種病原的感染率很高，PRRSV為52.3%、PCV2為29.4%和HPS為69.6%，且發(fā)病具有顯著的混合感染趨勢(shì)。

病原體的混合感染給臨床疾病的診斷帶來了很大的挑戰(zhàn)。對(duì)于混合感染病例的診斷既要求精確地診斷出動(dòng)物群體中混合感染的各種病原，又要區(qū)分出疾病的主要病原和次要病原，才能有效地控制疫情。實(shí)驗(yàn)室診斷一般采用PCR和RT-PCR檢測(cè)病原，而PCR和RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果只能說明這些病原在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)存在，并不能反映機(jī)體的實(shí)際狀態(tài)[3]。不同的病原體有不同的主要攻擊靶細(xì)胞，在臨床感染后會(huì)出現(xiàn)特征性的病理變化。因此，病理診斷技術(shù)是從宏觀病變觀察結(jié)合微觀診斷，進(jìn)而得出疾病診斷的結(jié)論[4]。本研究主要通過大體病理變化與組織病理學(xué)觀察對(duì)PRRSV、PCV2和HPS混合感染病例進(jìn)行病理學(xué)分析，旨在為臨床快速診斷與鑒別診斷疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

臨床病例8例，分別來源于荊門市京山市的8家規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑

DL2000 Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司;磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司;豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型RT-PCR檢測(cè)試劑盒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測(cè)試劑盒，購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.3 病毒的檢測(cè)

用磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒提取病毒核酸，按照豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型RT-PCR檢測(cè)試劑盒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測(cè)試劑盒說明書操作，進(jìn)行PCR和RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳成像，觀察記錄病原檢測(cè)結(jié)果。

1.4 細(xì)菌的分離與鑒定

無菌挑取病豬的肺組織，劃線接種于TSA培養(yǎng)基（5%無支原體新生牛血清+1%NAD），置于37 ℃恒溫箱中，培養(yǎng)24 h。挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，并鏡檢。通過觀察細(xì)菌染色形態(tài)與菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行傳代純化培養(yǎng)。將細(xì)菌純培養(yǎng)物按常規(guī)方法接種到微量生化鑒定管，在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察記錄結(jié)果。

1.5 病理學(xué)分析

對(duì)送檢病豬進(jìn)行剖檢，觀察各組織器官的病理學(xué)變化，取心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、扁桃體等組織，經(jīng)福爾馬林溶液固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色。利用Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化，同時(shí)詳細(xì)記錄組織微觀病變。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)RT-PCR和PCR檢測(cè)，從8家豬場(chǎng)病料中擴(kuò)增出的基因片段與試劑盒陽性對(duì)照大小一致，結(jié)果見圖1、圖2。結(jié)果表明，8家豬場(chǎng)的病料均為PRRSV、PCV2陽性。

2.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果

分離得到的細(xì)菌在TSA培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈灰白色，光滑，透明，邊緣規(guī)則，呈露滴狀。革蘭氏染色后鏡檢呈革蘭氏陰性的長桿菌。生化鑒定結(jié)果表明，氧化酶呈陰性，尿素酶呈陰性，觸酶呈陽性，CAMP試驗(yàn)陰性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖和半乳糖。該細(xì)菌鑒定為副豬嗜血桿菌。

2.3 PRRSV、PCV2與HPS混合感染豬的大體病理學(xué)特征

8例病豬臨床表現(xiàn)消瘦，被毛粗亂，耳朵與腹部常有出血點(diǎn)，存在腹式呼吸。剖檢可見胸腔、腹腔與關(guān)節(jié)腔內(nèi)漿液性滲出物增多，嚴(yán)重時(shí)可觀察到心外膜呈絨毛狀，肺胸膜和肋胸膜有大量纖維素性滲出物附著并發(fā)生黏連（圖3A），腹腔臟器表面有纖維素性假膜覆蓋，關(guān)節(jié)腔有濃稠的黃色液體（圖3B）。肺尖葉、心葉有暗紅色的實(shí)變區(qū)，呈斑駁狀，部分肺表面有出血點(diǎn)（圖3C）。心表面除纖維素性滲出物增多外，常有針尖狀的出血點(diǎn)。全身淋巴結(jié)腫大，輕微出血，顏色呈棕黃色（圖3D），部分淋巴結(jié)切面粗糙，有顆粒感。腎色淡，皮質(zhì)與髓質(zhì)有針尖大小的出血點(diǎn)，部分腎表面有大小不等的白色斑點(diǎn)（圖3E）。肝變性，質(zhì)地脆軟（圖3F），偶爾肝硬化，表面有白斑。

2.4 PRRSV、PCV2與HPS混合感染豬的組織病理學(xué)特征

組織切片觀察可見心、肺、肝等組織被膜外可觀察到大量纖維素性滲出物，呈明顯的纖維素性胸膜炎與纖維素性腹膜炎變化（圖4A、圖4E）。心肌細(xì)胞壞死，間質(zhì)有淋巴細(xì)胞浸潤灶（圖4B）。肺泡腔及支氣管內(nèi)有中性粒細(xì)胞浸潤（圖4C）。淋巴結(jié)水腫，淋巴細(xì)胞減少，中性粒細(xì)胞浸潤（圖4D）。肝竇擴(kuò)張，枯否氏細(xì)胞、中性粒細(xì)胞增多（圖4F）。脾淋巴細(xì)胞嚴(yán)重減少，中性粒細(xì)胞浸潤（圖4G）。腎間質(zhì)有淋巴細(xì)胞浸潤灶（圖4H），腎小球腫大，毛細(xì)血管淤血，腎小管變性、壞死（圖4I），髓質(zhì)間質(zhì)中有多個(gè)出血灶。

3 討論

PRRSV、PCV2與HPS 3種病原的單獨(dú)感染與混合感染時(shí)病理變化有較大的差別。PRRSV單獨(dú)感染病理變化以間質(zhì)性肺炎，淋巴結(jié)出血和淋巴細(xì)胞減少為特征[5]。PCV2單獨(dú)感染時(shí)組織病理變化以淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞耗竭，巨噬細(xì)胞浸潤，扁桃體和脾內(nèi)存在PCV抗原的包涵體，其他多個(gè)器官有淋巴細(xì)胞浸潤或肉芽腫性炎癥為特征[6]。HPS急性感染經(jīng)常產(chǎn)生急性敗血癥，其內(nèi)毒素誘導(dǎo)血管內(nèi)彌散性凝血，導(dǎo)致多個(gè)器官形成微血栓，全身感染特征為胸腔與腹腔漿液成分增多，呈現(xiàn)關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。慢性感染則出現(xiàn)嚴(yán)重的纖維素性膿性心包炎、胸膜炎、腹膜炎和慢性關(guān)節(jié)炎[7]。PRRSV與HPS混合感染病理變化表現(xiàn)為胸腔內(nèi)積有大量混濁液體，心外膜呈“絨毛心”狀，肺間質(zhì)增寬、水腫，氣管和支氣管內(nèi)有大量帶泡沫的液體，全身淋巴結(jié)腫大、出血[8]。PCV2與HPS混合感染病理變化表現(xiàn)為全身淋巴結(jié)腫大，胸腔與腹腔纖維素性滲出物增多，肺水腫，關(guān)節(jié)炎，腎臟呈土黃色表面布滿白斑[9]。

PRRSV與PCV2感染屬于免疫抑制性疾病，破壞機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)，使機(jī)體易感染其他病毒或細(xì)菌。研究表明，PRRSV感染通過其編碼的蛋白質(zhì)抑制宿主先天免疫，損害巨噬細(xì)胞并阻斷局部免疫;PCV2感染后優(yōu)先靶向淋巴組織，導(dǎo)致豬的淋巴細(xì)胞耗竭和免疫抑制，損害宿主的免疫防御能力。PRRSV感染可加速機(jī)體對(duì)HPS的感染[10]，HPS感染可以增強(qiáng)PRRSV感染介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)PRRSV、PCV2與HPS混合感染時(shí)大體病理學(xué)變化為胸腔與腹腔纖維素性滲出增多，全身淋巴結(jié)腫大出血，肺尖葉、心葉實(shí)變，膈葉間質(zhì)增寬、水腫。組織病理學(xué)觀察到多發(fā)性漿膜炎、間質(zhì)性腎炎、化膿性肺炎、化膿性脾炎、化膿性淋巴結(jié)炎、壞死性腎炎、肝竇擴(kuò)張中性粒細(xì)胞浸潤。PRRSV、PCV2與HPS混合感染時(shí)通過組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)各組織中中性粒細(xì)胞大量浸潤，推測(cè)這可能是PRRSV與PCV2促進(jìn)了HPS的易感性，增強(qiáng)了HPS的致病性，導(dǎo)致機(jī)體組織中中性粒細(xì)胞增多。

結(jié)合送檢病例的發(fā)病情況，通過臨床病理剖檢、細(xì)菌分離鑒定和病毒檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)室檢查，綜合判定為PRRSV、PCV2與HPS的混合感染。組織切片結(jié)果表明，PRRSV、PCV2與HPS的混合感染病例各組織的病理變化均較單獨(dú)感染病例嚴(yán)重。因此，不同規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)均應(yīng)通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、強(qiáng)化生物安全和使用有效藥物等綜合措施來預(yù)防控制疫病，尤其是混合感染疫病的發(fā)生。

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