交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究進(jìn)展

張 潔，劉春麗，李 欣，張 媛，韓碧瑩，趙躍芳

(內(nèi)蒙古大學(xué) 省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070)

蛋白質(zhì)作為生命功能的“執(zhí)行者”，在生命體中通過高度復(fù)雜且動態(tài)變化的相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)控各種生物過程，蛋白質(zhì)相互作用的研究是闡明生物學(xué)過程的關(guān)鍵。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)相互作用的研究方法主要有酵母雙雜交篩選(Y2H)法、免疫共沉淀(Co-IP)法、親和純化與質(zhì)譜聯(lián)用(AP-MS)法[1]、鄰近依賴性生物素鑒定(BioID)法[2]等，這些方法雖然已經(jīng)應(yīng)用到許多生物學(xué)研究中，但具體操作仍存在一定的局限性。Y2H法假陽性較高，由于融合蛋白受表達(dá)條件限制，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的修飾與折疊發(fā)生改變，不能形成正確的相互作用關(guān)系； Co-IP法與AP-MS法靈敏度較低，無法捕捉瞬時與低親和力的相互作用蛋白，且不能區(qū)分作用方式[3]；BioID法可用于蛋白質(zhì)相互作用的篩選，但由于需要添加過量生物素，可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，而且生物素化會改變蛋白的電荷與修飾，影響鄰近蛋白的行為。

交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(XL-MS)是將蛋白質(zhì)化學(xué)交聯(lián)技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)相互作用的新方法。通過在樣品中加入適量的小分子化學(xué)交聯(lián)劑，使空間足夠接近的氨基酸與交聯(lián)劑發(fā)生共價連接，從而將已經(jīng)發(fā)生的相互作用穩(wěn)定下來，通過質(zhì)譜與交聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件解析確定發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)以及具體作用的交聯(lián)位點，獲取蛋白質(zhì)相互作用信息，結(jié)合交聯(lián)劑的長度對蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)復(fù)合體亞基的空間排列進(jìn)行預(yù)判[1]。

XL-MS的優(yōu)勢[4]在于：(1)樣品制備簡單。蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)后經(jīng)過常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)的酶切、純化、質(zhì)譜分析便可得到交聯(lián)信息，操作簡便，不受分子量以及樣品純度限制；(2)檢測通量高。基于質(zhì)譜技術(shù)特點，可以高通量地同時進(jìn)行多種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和相互作用的分析；(3)靈敏度高。生物反應(yīng)轉(zhuǎn)瞬即逝，交聯(lián)劑可以使瞬時相互作用和結(jié)合不牢固的反應(yīng)的特定氨基酸發(fā)生共價連接，揭示瞬時或者微弱的蛋白質(zhì)相互作用；(4)作用方式明確。XL-MS可確定蛋白質(zhì)之間是直接相互作用還是間接相互作用，結(jié)合晶體結(jié)構(gòu)信息可以明確相互作用界面信息；(5)應(yīng)用范圍廣。交聯(lián)劑除了可以在蛋白分子水平上交聯(lián)，部分交聯(lián)劑還可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)交聯(lián)，在細(xì)胞水平上實現(xiàn)生理狀態(tài)的相互作用研究。

1 交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的工作流程

XL-MS的工作流程(圖1)包括：蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行(體外純化蛋白質(zhì)復(fù)合物交聯(lián)、親和純化蛋白質(zhì)交聯(lián)、體內(nèi)交聯(lián))；交聯(lián)蛋白質(zhì)或肽段的富集純化；交聯(lián)蛋白質(zhì)的酶切；交聯(lián)多肽的質(zhì)譜鑒定；質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析與交聯(lián)位點的確定，結(jié)合已有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行復(fù)合體結(jié)構(gòu)模型建立，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析和亞基拓?fù)鋱D譜分析。

圖1 XL-MS的工作流程

蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)是XL-MS分析的關(guān)鍵步驟之一，直接影響著實驗結(jié)果的成敗。在研究簡單蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體亞基的相互作用界面時，要預(yù)先根據(jù)目的蛋白的結(jié)構(gòu)及感興趣的結(jié)構(gòu)域選擇合適的交聯(lián)劑，在不影響蛋白質(zhì)正常構(gòu)象且交聯(lián)劑反應(yīng)活性較高的條件下進(jìn)行交聯(lián)，通過確定交聯(lián)劑與目的蛋白反應(yīng)比例、反應(yīng)酸堿度與反應(yīng)時間等，使交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)和緩沖液體系相匹配，避免破壞蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)而引起交聯(lián)反應(yīng)過度或不足，出現(xiàn)少交聯(lián)或假交聯(lián)的錯誤信息[4]；在研究未知蛋白質(zhì)相互作用時，交聯(lián)劑中間臂的長度也是重要影響因素。

酶切反應(yīng)通常選用常規(guī)的胰蛋白酶(trpsin)切割精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)的C端。Leitner等[5]研究發(fā)現(xiàn)，除了使用胰蛋白酶外，添加4種蛋白酶天冬氨酸(Asp)-N、谷氨酸(Glu)-C、Lys-C和Lys-N等多酶酶切可以增加交聯(lián)位點的鑒定數(shù)。

交聯(lián)肽段的特異性富集和分離，可以提高交聯(lián)肽段的信號強度并降低樣品的復(fù)雜性，提高交聯(lián)肽段的鑒定效率，根據(jù)富集時間的不同分為消化前蛋白質(zhì)富集和消化后肽段富集。消化前蛋白質(zhì)富集指對感興趣的細(xì)胞器或目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行提純或靶向富集，即將交聯(lián)與親和純化相結(jié)合，通過親和純化釣取交聯(lián)反應(yīng)后目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合物或先釣取目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合物再進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，可以有效降低交聯(lián)肽段鑒定的復(fù)雜性[6]。交聯(lián)蛋白也可通過SDS-PAGE膠內(nèi)分離與酶解。在質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集時，可以通過設(shè)定二級質(zhì)譜條件采集，只采集高價態(tài)離子的二級質(zhì)譜信息，提高交聯(lián)肽段的鑒定率[7]。消化后肽段富集指將發(fā)生交聯(lián)的肽段與非交聯(lián)的線性肽進(jìn)行分離，常用的方法是尺寸排阻色譜法(size exclusion chromatography,SEC)。Leitner等[5]使用SEC分析，基于其較高的分子量選擇交聯(lián)線性肽段，從而減少了存在于交聯(lián)體系中大多數(shù)非交聯(lián)的線性肽，證明SEC是一種有效的交聯(lián)肽段富集方法。此外，由于交聯(lián)肽段的電荷數(shù)增加，交聯(lián)肽段比線性肽擁有更多的帶正電荷的堿性氨基酸，可使用強陽離子交換色譜法(strong cation exchange chromatography,SCX)進(jìn)行富集分離[8]。

2 交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的主要應(yīng)用

2.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的常規(guī)方法有：X-射線晶體衍射法、核磁共振波譜法等。雖然這些方法具有精密度高、獲得信息豐富等優(yōu)點，但對于蛋白質(zhì)樣品的純度、濃度、分子大小及可結(jié)晶性等要求很苛刻，不利于對大分子蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)的解析。而XL-MS在這一方面起到不可或缺的作用，當(dāng)電鏡的分辨率不夠或蛋白難以形成結(jié)晶時，可通過XL-MS結(jié)果解析出蛋白質(zhì)不同結(jié)構(gòu)域或不同亞基之間的相互作用界面[9]。通過軟件預(yù)測出多種可能構(gòu)象后，XL-MS數(shù)據(jù)可以輔助排除一些不合理的構(gòu)象[10]。XL-MS以其獨特優(yōu)勢，與低溫冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)、X-射線晶體衍射法等其它研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法相結(jié)合，在超大分子量蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)的解析中起到了提供距離約束、指導(dǎo)計算模型確定亞結(jié)構(gòu)作用位點的重要作用，體現(xiàn)了其在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中的實用性和重要性[1]。

核糖體蛋白S1由于其動態(tài)的特征，無法通過X-射線晶體衍射技術(shù)進(jìn)行觀察。2011年，Lauber等[11]通過新型的賴氨酸反應(yīng)性交聯(lián)劑(亞乙基次硫亞氨酸二乙酯,DEST)，利用XL-MS探測柔性組件中亞基間作用關(guān)系的特性，成功定位了大腸桿菌核糖體復(fù)合物上核糖體蛋白S1的結(jié)合位點[12]。蛋白酶體26S由調(diào)控亞基19S和催化亞基20S組成，20S的結(jié)構(gòu)早在1995年通過X-射線晶體衍射技術(shù)完成了解析[13]，但完整的26S復(fù)合體由于其溶解性差、結(jié)晶困難未能獲得結(jié)構(gòu)信息。2012年，Lasker等[14]通過XL-MS、EM及其它方法的聯(lián)合使用獲得了蛋白酶體26S的完整結(jié)構(gòu)。2014年，Erzberger等[15]將XL-MS、EM、X-射線晶體衍射技術(shù)以及綜合建模相結(jié)合，闡明了釀酒酵母的40S核糖體·eIF1·eIF3復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，共鑒定到965對蛋白內(nèi)和蛋白間的交聯(lián)。線粒體的核糖體在結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能上與胞質(zhì)核糖體差異很大，主要負(fù)責(zé)合成一定數(shù)量的疏水膜蛋白，晶體培養(yǎng)難度大限制了X-射線晶體衍射技術(shù)對其結(jié)構(gòu)的解析，在高分辨率cryo-EM研究線粒體核糖體結(jié)構(gòu)的研究中，XL-MS對復(fù)合體中單個亞基的定位起到了關(guān)鍵作用[16]。2015年，Martinez-Rucobo等[17]通過XL-MS成功解析了體外重組的加帽酶(capping enzyme,CE)與磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡp)形成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體PolⅡp-CE的結(jié)構(gòu)，共獲得527個交聯(lián)肽段，其中337個符合賴氨酸-賴氨酸交聯(lián)的距離限制。此項研究再次證實了XL-MS是研究動態(tài)柔性蛋白質(zhì)復(fù)合體的有效方法。此外，XL-MS還成功地用于解析TriC/CCT伴侶蛋白系統(tǒng)[18]、核孔復(fù)合物[19]、CRISPR-Cas復(fù)合物[20]以及PolⅡ-介體起始復(fù)合物[21]的結(jié)構(gòu)。

2.2 蛋白質(zhì)相互作用的鑒定

由于AP-MS法與Co-IP法研究蛋白質(zhì)相互作用存在局限性，可將其與XL-MS結(jié)合，在親和純化或免疫共沉淀之前進(jìn)行共價交聯(lián)，就可以順利將瞬時或微弱的蛋白質(zhì)相互作用固定下來，并且通過交聯(lián)位點的解析獲得相互作用的空間界面信息。2012年，Herzog等[22]通過對蛋白質(zhì)磷酸酶2A(PP2A)信號通路檢測到的已知蛋白質(zhì)進(jìn)行親和標(biāo)記純化后在磁珠上進(jìn)行交聯(lián)，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定到涉及特定三聚體PP2A復(fù)合物與許多銜接子蛋白之間相互作用的176個蛋白間和570個蛋白內(nèi)交聯(lián)，并闡明了免疫球蛋白結(jié)合蛋白1(IGBP1)和PP2A之間的結(jié)合界面，揭示了TCP1環(huán)復(fù)合物(TRiC)伴侶蛋白與PP2A調(diào)節(jié)亞基2ABG相互作用的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。2015年，Shi等[23]利用免疫共沉淀結(jié)合XL-MS，使用工程設(shè)計的GFP納米抗體從細(xì)胞中親和捕獲GFP標(biāo)記的蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后直接在磁珠上進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將交聯(lián)結(jié)果結(jié)合計算機模擬解析了多個蛋白質(zhì)復(fù)合物的天然結(jié)構(gòu)。

除此之外，XL-MS也可以單獨應(yīng)用于細(xì)胞環(huán)境(活細(xì)胞或細(xì)胞裂解液)中研究生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的相互作用，捕獲生理條件下廣譜的瞬時、微弱的蛋白質(zhì)相互作用。目前XL-MS已經(jīng)用于幾種不同生物全蛋白質(zhì)組范疇的相互作用研究。2012年，Yang等[24]通過在大腸桿菌和線蟲的裂解液中進(jìn)行交聯(lián)，使用pLink軟件分別鑒定到394對和39對交聯(lián)肽對，之后開發(fā)了一種類似BS3的以賴氨酸為靶標(biāo)的可富集的交聯(lián)劑，在大腸桿菌裂解液中得到3 130個相互作用的賴氨酸肽對，屬于677個蛋白質(zhì)；在線蟲裂解液中鑒定到893個相互作用賴氨酸肽對，屬于121個蛋白質(zhì)[25]。2015年，Liu等[26]在HeLa細(xì)胞裂解液中利用二琥珀酰亞胺基亞砜(DSSO)交聯(lián)后鑒定到2 179個獨特的賴氨酸-賴氨酸交聯(lián)肽段，并闡述了80S核糖體核心復(fù)合體與纖溶酶原激活物抑制劑 RNA結(jié)合蛋白1(SERBP1)之間的相互作用結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)；2017年，他們在大腸桿菌和HeLa細(xì)胞裂解液中進(jìn)行全蛋白質(zhì)組范圍的相互作用研究，對質(zhì)譜碎裂方法以及數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行優(yōu)化后，分別鑒定到1 158對和3 301對交聯(lián)肽對，并重點描述了涉及翻譯、蛋白質(zhì)折疊和碳水化合物代謝的幾種蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息，這些蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)為許多內(nèi)源性大分子復(fù)合體結(jié)構(gòu)及相互作用研究提供了重要信息[27]。2018年，F(xiàn)asci等[28]利用XL-MS繪制了人源細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)相互作用圖，在確定的8 700個交聯(lián)肽段的2/3代表不同蛋白質(zhì)間的相互作用，并重點闡述了核小體上核心組蛋白的相互作用，建立了USF3和Ran GTPase與核小體結(jié)合模式的低分辨率模型。諸多的研究證實XL-MS在復(fù)雜樣品中有著較好的應(yīng)用，設(shè)法在體內(nèi)(細(xì)胞內(nèi))進(jìn)行交聯(lián)可以在蛋白質(zhì)復(fù)合物保持天然構(gòu)象且不會破壞翻譯后修飾的生理條件下研究蛋白質(zhì)相互作用。

3 交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)

交聯(lián)劑、交聯(lián)肽段的富集以及反應(yīng)位點具有特異性、交聯(lián)肽段豐度低、交聯(lián)肽段譜圖復(fù)雜、解析困難等諸多因素限制了XL-MS的發(fā)展。XL-MS中應(yīng)用最廣泛的交聯(lián)劑是基于N-羥基琥珀酰亞胺酯類(NHS)的胺基交聯(lián)劑，但NHS易發(fā)生水解，而且當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)缺乏賴氨酸(如膜蛋白的跨膜區(qū)域賴氨酸較少)時，胺基交聯(lián)劑則無法捕捉相互作用蛋白。雖然研究開發(fā)了許多靶向其它氨基酸的新型交聯(lián)劑，但在具體應(yīng)用時仍會受到一定限制。此外，全蛋白質(zhì)組范疇的蛋白質(zhì)交聯(lián)質(zhì)譜研究對于交聯(lián)肽段的富集純化以及交聯(lián)肽段譜圖的解析提出了更大的挑戰(zhàn)，交聯(lián)蛋白濃度通常很低，有效的富集分離是交聯(lián)質(zhì)譜鑒定的關(guān)鍵。而產(chǎn)生的交聯(lián)肽段極大地增加了譜圖解析的復(fù)雜度，目前可用的軟件工具中，都有其特殊性及一定的適用范圍，還沒有十分理想的通用軟件，交聯(lián)位點鑒定的可靠性與覆蓋率仍需不斷提升。

3.1 交聯(lián)劑

為捕捉與穩(wěn)定蛋白質(zhì)間的相互作用可利用反應(yīng)活性較高的側(cè)鏈基團(tuán)，如賴氨酸上的氨基、天冬氨酸和谷氨酸上的羧基、精氨酸上的胍基、半胱氨酸上的巰基，分別設(shè)計開發(fā)氨基反應(yīng)的交聯(lián)劑、羧基反應(yīng)的交聯(lián)劑、胍基反應(yīng)的交聯(lián)劑以及巰基反應(yīng)的交聯(lián)劑，同時可以將這些化學(xué)交聯(lián)劑不斷優(yōu)化，使交聯(lián)劑具有可進(jìn)行化學(xué)切割、質(zhì)譜切割或可富集、含標(biāo)記等不同特性。各種類型的交聯(lián)劑簡單介紹如下：

(1) 氨基反應(yīng)的交聯(lián)劑。目前最常用的氨基反應(yīng)交聯(lián)劑是NHS與亞氨酸酯。根據(jù)實驗不同，可選擇短臂或長臂、可解離或不可解離、膜通透型或細(xì)胞表面型等多種間隔臂類型的NHS，在弱堿性條件下能夠與伯胺反應(yīng)生成酰胺鍵，具有較高的反應(yīng)效率，但反應(yīng)導(dǎo)致的電荷變化可能引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化；亞氨酸酯與NHS不同的是它與氨基反應(yīng)生成堿性脒基，保持了反應(yīng)位點的正電荷性質(zhì)，雖然反應(yīng)效率略低，但特異性高于NHS，水溶性更好。

(2)羧基反應(yīng)的交聯(lián)劑。設(shè)計開發(fā)蛋白質(zhì)酸性氨基酸的羧基反應(yīng)基團(tuán)的交聯(lián)劑能夠擴大XL-MS的應(yīng)用范圍，與羧基反應(yīng)的常見化學(xué)基團(tuán)主要有碳化二亞胺(EDC)、重氮烷和羰二咪唑。EDC在酸性條件下具有較高的反應(yīng)活性，ADH和PDH能夠?qū)崿F(xiàn)生理條件(pH 值7.0～7.5)下的交聯(lián)。目前羧基反應(yīng)交聯(lián)劑的最大缺陷是破壞了蛋白質(zhì)本身構(gòu)象，因此在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的情況下完成交聯(lián)是未來羧基反應(yīng)交聯(lián)劑的優(yōu)化方向。

(3)胍基反應(yīng)的交聯(lián)劑。精氨酸作為蛋白質(zhì)中較為豐富的氨基酸之一，大量存在于蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域，特異靶向精氨酸胍基的交聯(lián)劑主要有以乙二醛為反應(yīng)基團(tuán)的PDG與BDG，這類交聯(lián)劑的不足是生成較多不穩(wěn)定產(chǎn)物，質(zhì)譜信號分散，檢測較為困難[29]。

(4)巰基反應(yīng)的交聯(lián)劑。由于馬來酰亞胺具有與巰基極高的反應(yīng)活性，可基于馬來酰亞胺設(shè)計巰基特異性反應(yīng)的交聯(lián)劑，反應(yīng)時蛋白質(zhì)中的游離巰基與交聯(lián)劑的雙鍵發(fā)生烷化反應(yīng)生成穩(wěn)定的硫醚鍵，但這類交聯(lián)劑易發(fā)生水解，且對pH值較為敏感，pH值越大越易發(fā)生水解[30]，可利用它的pH值敏感性，將交聯(lián)應(yīng)用到藥物與蛋白載體的連接，起到藥物在體內(nèi)定量/定位釋放。另外，基于馬來酰亞胺和酰肼反應(yīng)基團(tuán)的交聯(lián)劑可適用于連接巰基和糖類，并形成共價交聯(lián)。

(5)化學(xué)切割交聯(lián)劑?；瘜W(xué)切割交聯(lián)劑是在交聯(lián)劑連接臂上設(shè)計特殊的化學(xué)鍵，化學(xué)鍵可在一定條件下發(fā)生斷裂，如DSP、DTSSP交聯(lián)劑連接臂上的二硫鍵在還原劑作用下斷開，分別采集還原前和還原后樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過比對還原前后的譜圖確定交聯(lián)肽段。缺點在于還原后得到的兩條切割肽段可能無法全部鑒定到，導(dǎo)致交聯(lián)信息不準(zhǔn)確，而且要求體系中不能含與二硫鍵反應(yīng)的基團(tuán)，如自由的巰基等。

(6)質(zhì)譜切割交聯(lián)劑。相比于化學(xué)切割交聯(lián)劑，質(zhì)譜切割交聯(lián)劑則是在連接臂上設(shè)計低能量化學(xué)鍵，如與苯基相連的肽鍵、固定電荷的硫離子、亞砜和尿素連接的丁酸酯等，這些低能量化學(xué)鍵在二級質(zhì)譜碎裂時會優(yōu)先斷開實現(xiàn)交聯(lián)肽對的分離[28]。商品化的DSSO是目前應(yīng)用較為廣泛的一類質(zhì)譜切割交聯(lián)劑，它與DSS和BS3具有類似的反應(yīng)活性，結(jié)構(gòu)簡單，兩側(cè)的NHS酯基團(tuán)可與氨基反應(yīng)，特殊設(shè)計在于中間的連接臂插入了亞砜基團(tuán)，使得兩側(cè)對稱的C-S鍵在質(zhì)譜中優(yōu)先發(fā)生斷裂。在二級質(zhì)譜譜圖(MS2)中，DSSO的質(zhì)譜切割產(chǎn)生特征性譜峰，可根據(jù)譜峰識別出交聯(lián)肽對，再利用三級質(zhì)譜譜圖(MS3)結(jié)合搜索引擎進(jìn)行肽測序得到交聯(lián)肽段序列。另一種使用較多的質(zhì)譜切割交聯(lián)劑是protein interaction reporter(PIR)，最早于2005年開發(fā)設(shè)計，其關(guān)鍵點在于在交聯(lián)劑中引入不穩(wěn)定的鍵，通過質(zhì)譜的CID、ECD、IRMPD或其它解離機制使交聯(lián)劑的兩個可切割位點原位解離，生成兩條肽段與一個報告基團(tuán)，且切割生成肽段產(chǎn)生的殘留基團(tuán)是常見的修飾，便于檢索。根據(jù)報告離子與交聯(lián)肽段的比例關(guān)系，識別交聯(lián)肽段提高鑒定準(zhǔn)確性。Hage等[31]引入質(zhì)譜可切割的“零長度”交聯(lián)劑：1,1′-羰基二咪唑(CDI)，連接蛋白質(zhì)中的伯胺和羥基基團(tuán)，其中間臂長度為短羰基單元(～2.6 ?),可以在生理條件(pH 值7.2～8.0)下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。質(zhì)譜切割交聯(lián)劑簡化了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和復(fù)雜相互作用的質(zhì)譜分析，但也存在三級質(zhì)譜信號強度下降、譜圖難以解析的問題。

(7)功能交聯(lián)劑?？筛患慕宦?lián)劑、同位素標(biāo)記的交聯(lián)劑、熒光標(biāo)記的交聯(lián)劑、化學(xué)選擇性連接交聯(lián)劑以及光反應(yīng)交聯(lián)劑等具有特殊功能的交聯(lián)劑是基于上述交聯(lián)劑衍生而來的。例如,在交聯(lián)劑中引入如生物素的可富集基團(tuán)，使交聯(lián)肽段檢測相對量提高，增加實驗結(jié)果真實性，甚至在可富集基團(tuán)設(shè)計化學(xué)切割位點，實現(xiàn)交聯(lián)肽段富集后將富集標(biāo)簽去除，減少標(biāo)簽對質(zhì)譜分析的影響。光反應(yīng)交聯(lián)劑主要是利用芳香疊氮、雙丫丙啶和其它光反應(yīng)基團(tuán)而設(shè)計的異型雙功能交聯(lián)劑，可通過兩步活化使受體-配體相互作用復(fù)合體相關(guān)的蛋白、核酸和其它分子發(fā)生連接。目前，具有各種特殊功能的交聯(lián)劑層出不窮，極大地拓展了XL-MS的應(yīng)用前景，除了用于蛋白質(zhì)相互作用研究，交聯(lián)作為一種生物偶聯(lián)的方式也拓展到了核酸、藥物和固相載體表面的修飾。

表1列出了目前常用的部分交聯(lián)劑。

3.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集以及譜圖解析

由于交聯(lián)產(chǎn)物兩條肽段的結(jié)合使搜索空間呈指數(shù)級擴大、統(tǒng)計復(fù)雜性以及假陽性增加，交聯(lián)肽段的解析鑒定是XL-MS面臨的最大挑戰(zhàn)。早期質(zhì)譜解析是人工對一級質(zhì)譜譜圖(MS1)進(jìn)行解析：在MS1中找到與理論交聯(lián)肽段質(zhì)量相匹配的譜峰，確定其存在，再在MS2的基礎(chǔ)上尋找交聯(lián)位點信息。依據(jù)該原理開發(fā)的數(shù)據(jù)解析鑒定軟件主要有MS2Links[45]、Links[46]、ProteinXXX[47]、NIH-XL[48]、VIRTUALMSLAB[49]、CLPM[50]、GPMAW[51]、CrossSearch[51]等。但人工解析對MS1的鑒定適用范圍小，尤其是當(dāng)樣品復(fù)雜時，檢索難度急劇上升，很難排除背景噪音、非特異酶切和漏切等因素的影響。

隨著質(zhì)譜技術(shù)以及解析軟件的快速發(fā)展，MS2與MS3的解析鑒定優(yōu)勢逐漸呈示出來，實現(xiàn)了母離子和碎片離子的質(zhì)荷比信息的同時利用。基于不同化學(xué)交聯(lián)劑(特殊標(biāo)記、可裂解/不可裂解)引起的交聯(lián)肽段不同的譜圖特點，研究人員針對化學(xué)交聯(lián)劑的特性開發(fā)了與之相匹配的數(shù)據(jù)庫搜索引擎，使得交聯(lián)肽段的譜圖信息更加完整，鑒定結(jié)果更加可靠。早期出現(xiàn)的針對特殊標(biāo)記交聯(lián)劑的搜索引擎：Pro-crossLink[52]、CTUX[53]、Xlink-Identifier[54]、XLink[55]、X!Link[56]、FINDX[57]等可用于簡單樣品的分析。針對不可裂解的交聯(lián)劑解析的搜索引擎：xQuest[58]、pLink[24]、pLink 2[59]、Kojak[60]、XiSearch[61]、Protein Prospector[62]和StavroX[63]等均可對大型數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。xQuest利用輕重同位素標(biāo)記的特殊交聯(lián)劑，第一次嘗試了大型數(shù)據(jù)庫搜索。pLink通過對交聯(lián)肽段碎片離子的特點分析，有效利用內(nèi)部離子、交聯(lián)劑斷裂離子等的特殊性，提高了交聯(lián)譜圖鑒定率。與需要同位素標(biāo)記樣品的xQuest 相比，pLink可解析無同位素標(biāo)記和使用特殊交聯(lián)劑交聯(lián)的肽段，從而能得到更廣泛的應(yīng)用。pLink 2是一種在蛋白質(zhì)組規(guī)模上準(zhǔn)確性和靈敏度更高的搜索引擎，采用兩個階段的開放式搜索策略，將交聯(lián)肽段看作是一條肽段帶有一個未知的修飾，首先通過嚴(yán)格的片段索引，根據(jù)得分情況確定一條肽，再利用這條肽段的部分碎片離子進(jìn)行常規(guī)數(shù)據(jù)搜索。Kojak算法集成了傳統(tǒng)數(shù)據(jù)庫搜索算法采用的譜圖處理和評分方法，并且可以使用許多不同的帶有或沒有同位素標(biāo)記的化學(xué)交聯(lián)劑，可用于分析新的和已有的數(shù)據(jù)集。XiSearch是針對交聯(lián)劑BS3的無標(biāo)記和同位素標(biāo)記設(shè)計的搜索引擎，可使用Skyline軟件進(jìn)行自動化定量，已應(yīng)用于多種純化的蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)分析。此外，Protein Prospector和StavroX均可對復(fù)雜的交聯(lián)數(shù)據(jù)集進(jìn)行檢索，Protein Prospector軟件可用于分析不可裂解交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)產(chǎn)生的交聯(lián)肽段；StavroX可以在網(wǎng)頁上直接進(jìn)行運算，使用非概率參數(shù)來確定交聯(lián)候選者的得分，可在短時間內(nèi)解析交聯(lián)數(shù)據(jù)。

表1 常用的部分交聯(lián)劑

續(xù)表1

針對可裂解交聯(lián)劑的解析方法得益于在MS/MS譜圖中可觀察到的特定交聯(lián)報告離子，利用這些報告離子將搜索空間縮小為少數(shù)交聯(lián)肽的組合，目前可裂解交聯(lián)劑DSBU與DSSO的常用搜索引擎分別為MeroX[64]和XlinkX。MeroX應(yīng)用于MS可裂解交聯(lián)劑，擴展了RISEUP和全蛋白質(zhì)組模式的兩種新型算法，可以實現(xiàn)從單個蛋白到全蛋白質(zhì)組的XL-MS數(shù)據(jù)分析，它允許在MS和MS/MS兩個級別進(jìn)行質(zhì)量重新校準(zhǔn)，減少了質(zhì)量匹配和總體計算時間的要求，同時增加了交聯(lián)肽段鑒定的數(shù)量與可靠性。XlinkX 1.0算法首先通過識別所有特征離子峰并找到兩個交聯(lián)肽中每個肽的質(zhì)量，然后進(jìn)行基于片段的標(biāo)準(zhǔn)搜索以確定其序列，由于嚴(yán)重依賴于高質(zhì)量的CID-MS2譜圖，研究人員不得不使用復(fù)雜的高能碎裂方法進(jìn)行優(yōu)化，最大程度識別到特征離子峰。XlinkX v2.0[27]大幅提高了解析蛋白質(zhì)交聯(lián)的深度和準(zhǔn)確性，它支持MS2-MS3組合的碎裂方法，當(dāng)MS2裂解交聯(lián)共價鍵時，MS3同時將每個交聯(lián)肽進(jìn)行裂解，這樣就可以在兩個水平上提供獨特的序列特異性碎片離子，利用這種多樣化碎裂優(yōu)勢，XlinkX v2.0可以實現(xiàn)對交聯(lián)肽段的更全面準(zhǔn)確的解析。但這種方法的局限性在于仍需要高強度的特征離子，導(dǎo)致相似鍵強度的交聯(lián)劑很難使用該方法區(qū)分，影響使用范圍。此外，與可碎裂交聯(lián)劑PIR相匹配的X-links軟件[65]和Blinks軟件[66]也是常用的檢索軟件，但它們的缺點主要是MS3時間較長且信號較低，較難捕獲解析。

MaXLinker[67]是一種以“MS3為中心”的新型搜索算法，較MS2 有更高的鑒定置信度。雖然XlinkX v2.0、X-Links與Blinks也可進(jìn)行MS3碎裂分析，但它們基于MS3的交聯(lián)肽鑒定率與置信度均非常低，MaXLinker基于MS3的算法不僅可以大幅降低錯誤率，而且提高了交聯(lián)肽的鑒定率，具有出色的靈敏度和特異性。MetaMorpheusXL[68]是MetaMorpheus軟件中一個新的搜索模塊，可用于鑒定解析MS可裂解和不可裂解的交聯(lián)肽。它無需識別交聯(lián)肽的特征離子，可通過離子索引算法識別MS可裂解的交聯(lián)肽，從而進(jìn)行有效的大型數(shù)據(jù)庫搜索。

交聯(lián)鑒定結(jié)果可以通過可視化展示及網(wǎng)絡(luò)圖繪制獲得直觀分析[28]。最直接的可視化方法是在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上直接映射鑒定到的交聯(lián)位點，但隨著鑒定數(shù)據(jù)的增加，可視化元素和初始輸入數(shù)據(jù)之間沒有直接關(guān)聯(lián)，難以檢測數(shù)據(jù)的有效性，為此研究人員開發(fā)了許多網(wǎng)絡(luò)實時可視化的分析軟件。Xwalk[69]是一種在已有的晶體結(jié)構(gòu)的交聯(lián)位點進(jìn)行模擬計算的軟件，通過理論分析交聯(lián)劑分子性質(zhì)獲得一個較為合理的“溶劑可及表面距離”，計算并顯示蛋白質(zhì)表面化學(xué)交聯(lián)氨基酸之間的曲面距離。XLink-DB[70]是第一個允許編譯和分析大規(guī)模交聯(lián)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，不僅可以存儲、共享和處理交聯(lián)數(shù)據(jù)，將交聯(lián)數(shù)據(jù)自動映射到PDB結(jié)構(gòu)，使數(shù)據(jù)可視化并預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用，也可將定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)添加到現(xiàn)有的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行比較，生成蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，還可以進(jìn)行物種水平的相互作用分析。Xlink Analyzer[71]是一種在三維結(jié)構(gòu)中分析和使交聯(lián)數(shù)據(jù)可視化的工具，通過自動分析交聯(lián)數(shù)據(jù)，根據(jù)置信度得分與交聯(lián)類型對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，計算并排除不符合空間約束的交聯(lián)，繪制蛋白質(zhì)表面的化學(xué)修飾，并且可以將交聯(lián)映射到同聚寡聚體以及潛在的相互作用位點，與常用的結(jié)構(gòu)顯示與建模軟件UCSF Chimera交互式綜合分析擬合到EM圖，獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的低分辨率模型。xVis[72]能夠以圓形、條形圖或網(wǎng)絡(luò)圖的形式顯示交聯(lián)位點及距離，可直觀描繪出蛋白質(zhì)區(qū)域的空間鄰近性以及氨基酸的進(jìn)化保守性，并根據(jù)交聯(lián)密度排列和分組聚類算法，確定復(fù)合物的近端與遠(yuǎn)端亞基InterPro，利用現(xiàn)有的原位庫將輕量級技術(shù)和高級數(shù)據(jù)模型進(jìn)行整合，最大程度地減少資源浪費[73]。還可根據(jù)鑒定分?jǐn)?shù)或錯誤率篩選交聯(lián)數(shù)據(jù)，并顯示每條交聯(lián)肽段相應(yīng)的碎片離子譜圖。xiNET[74]則將視圖顯示更加直接明確，將交聯(lián)質(zhì)譜得到的結(jié)果顯示為節(jié)點圖，代表蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，繪制形成蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。ProXL[75]是一個網(wǎng)頁版的應(yīng)用軟件，數(shù)據(jù)易于共享和導(dǎo)入，支持穩(wěn)定同位素標(biāo)記的交聯(lián)肽段鑒定，可進(jìn)行精確的質(zhì)量控制及新穎的可視化分析。Cross-ID[76]不需要文件格式轉(zhuǎn)換，可以直接鏈接到Proteome Discoverer的XlinkX的輸出文件，還可以與其它平臺聯(lián)用實現(xiàn)GO富集分析、翻譯后修飾(PTM)可視化、域和二級結(jié)構(gòu)映射、數(shù)據(jù)集比較等功能分析，通過DisVis在線平臺(http://milou.science.uu.nl/cgi/ services/ DISVIS /disvis/)對具有已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)和復(fù)合物或蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行檢測到的交聯(lián)驗證。

4 展望

XL-MS的興起是傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)方法與現(xiàn)代蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展的結(jié)果，對蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析以及蛋白質(zhì)相互作用研究具有重要作用，“結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)”，了解蛋白質(zhì)的性質(zhì)與所承擔(dān)的功能對生命科學(xué)的發(fā)展至關(guān)重要。但是目前XL-MS的應(yīng)用仍受到交聯(lián)劑反應(yīng)位點具有特異性、交聯(lián)肽段豐度低、交聯(lián)肽段譜圖復(fù)雜、解析困難等諸多因素的限制。新交聯(lián)劑的設(shè)計合成、交聯(lián)肽段富集分離方法的建立以及交聯(lián)肽段譜圖解析鑒定算法的開發(fā)是XL-MS發(fā)展的方向。