淫羊藿苷防治股骨頭壞死分子機(jī)制研究進(jìn)展

章曉云 李華南 陳躍平

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院骨科，廣西 南寧 530011 3.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷三科，江西 南昌 330006

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主骨生髓，腎氣充足則骨骼得以生長、修復(fù)，腎氣虛則骨痿，而股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)在古時(shí)稱之為“骨蝕、骨痿、骨痹”。目前以腎主骨理念為指導(dǎo)進(jìn)行中醫(yī)藥治療股骨頭壞死的研究中，淫羊藿是研究比較成熟的中藥之一。淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，認(rèn)為其“味辛，寒。主陰痿絕傷，莖中痛，利小便益氣力，強(qiáng)志”，《本草經(jīng)集注》補(bǔ)充提出：“其可堅(jiān)筋骨，消瘰疬，赤癰”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[1-3]表明淫羊藿治療ONFH效果明顯，主要通過影響Wnt、RANK/RANKL、PI3K-Akt、Notch、MAPK、TGF-β、HIF-1、FoxO等信號(hào)通路發(fā)揮治療ONFH的作用。中藥藥理研究表明淫羊藿苷(Icariin，ICA)是其主要藥效成分，可有效改善骨代謝平衡，增強(qiáng)骨密度與強(qiáng)度[4]，現(xiàn)將ICA治療ONFH的分子機(jī)制研究綜述如下。

1 ICA通過經(jīng)典Wnt/β-catenin促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化

Wnt信號(hào)通路可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、腎臟細(xì)胞等多種細(xì)胞的分化、增殖、遷移。Wnt信號(hào)通路主要有經(jīng)典Wnt/鈣離子、Wnt/PCP與Wnt/β-catenin 3種信號(hào)通路，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路為經(jīng)典通路。Wnt蛋白與存在于細(xì)胞表面的Frizzled家族蛋白受體、低密度脂蛋白受體關(guān)聯(lián)蛋白LRP6及LRP5進(jìn)行結(jié)合后從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而抑制axin、GSK-3、APC蛋白對(duì)β-catenin蛋白的降解作用，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的含量得以穩(wěn)定，并最終與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(TCF/LEF)結(jié)合促進(jìn)下游特定基因的表達(dá)，這是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化的主要路徑。Wnt/β-catenin信號(hào)通路可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞增殖分化，在骨生成與代謝過程中扮演著非常重要的角色。因此，尋找激活Wnt信號(hào)通路以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間骨代謝平衡的方法成為治療股骨頭壞死的關(guān)鍵。隨著對(duì)淫羊藿研究的不斷深入后發(fā)現(xiàn)其主要藥效成分ICA可以通過刺激經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而達(dá)到刺激成骨細(xì)胞增殖分化，并抑制破骨細(xì)胞形成的效果，其可改善骨代謝平衡，抑制股骨頭壞死的進(jìn)一步發(fā)展。Wang等[5]研究表明ICA可激活Wnt信號(hào)通路，提高成骨細(xì)胞增殖分化所需的相關(guān)因子β-catenin、Runx2、cyclinD 1和ALP的表達(dá)水平，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。Liu等[6]在小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)損傷模型中加入ICA后發(fā)現(xiàn)其增強(qiáng)了暴露于超負(fù)荷狀態(tài)下成骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞分化和礦化，其中ALP、β-catenin和Runx 2的基因和蛋白表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比均有提高。這說明ICA可通過提高β-catenin在胞內(nèi)的表達(dá)水平，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)β-catenin與TCF/LEF結(jié)合。另外，ICA可提高成骨分化相關(guān)基因蛋白的表達(dá)，最終促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化(圖1)。由此可見ICA可通過經(jīng)典Wnt/β-catenin促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化。

圖1 ICA通過經(jīng)典Wnt/β-catenin促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化機(jī)制Fig.1 Mechanism of icariin promoting osteoblast proliferation and differentiation through Wnt/β-Catenin

2 ICA介導(dǎo)RANK/RANKL信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化

破骨細(xì)胞由多核巨細(xì)胞組成，促進(jìn)骨吸收為其主要功能，這使它在骨的生長發(fā)育、修復(fù)代謝中發(fā)揮著重要作用，但過快的破骨細(xì)胞增殖分化會(huì)引起骨質(zhì)被過度吸收，使股骨頭區(qū)域的骨代謝平衡被打破從而引起股骨頭局部出現(xiàn)骨塌陷。破骨細(xì)胞的增殖、分化及發(fā)育主要與兩種細(xì)胞因子有關(guān)，即巨噬細(xì)胞刺激集落因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)與NF-κB配體受體活化因子(receptor activator of NF-κβ，RANK)。當(dāng)RANK與破骨細(xì)胞前體表面的受體RANKL相結(jié)合后，會(huì)進(jìn)一步與銜接分子TRAF6相互作用，而TRAF6作為MAPK、NF-κB以及一些破骨細(xì)胞相關(guān)基因的催化細(xì)胞因子，可激活MAPK、NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞形成與分化，因此阻止RANK與RANKL結(jié)合是抑制破骨細(xì)胞分化的方式之一。Kim等[1]研究表明ICA抑制破骨細(xì)胞不僅可以通過OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路，還可以通過調(diào)節(jié)RANKL介導(dǎo)的TRAF6/NF-κB/ERK信號(hào)通路來抑制破骨細(xì)胞的形成。TRAF6是RANK/RANKL在早期吸引而來的細(xì)胞分子，被視為破骨細(xì)胞增殖分化的主要標(biāo)志物。當(dāng)TRAF6含量受到明顯抑制時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)破骨細(xì)胞分化緩慢，成熟破骨細(xì)胞形成有關(guān)的NF-κB蛋白表達(dá)受到抑制，而該蛋白恰好是RANK/RANKL途徑的重要下游靶標(biāo)。目前發(fā)現(xiàn)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)可抑制RANK/RANKL信號(hào)通路的表達(dá)，它通過與RANKL相結(jié)合，阻斷RANK與RANKL的結(jié)合，從而減少破骨細(xì)胞分化，提高骨量，并且RANKL/OPG比值被視為衡量骨量的重要指標(biāo)之一[7]。Sun等[8]研究表明ICA可提高成骨相關(guān)基因ALP，BGP及OPG/RANKL的表達(dá)水平促進(jìn)成骨分化，同時(shí)降低骨吸收標(biāo)志物TRACP-5b水平抑制骨吸收，從而維持骨代謝平穩(wěn)。吳峻等[9]研究表明ICA通過提高OPG的水平，降低RANKL及RANK的表達(dá)水平，從而提高血清中BGP、ALP及Ca2+的水平，最終抑制成骨細(xì)胞凋亡。OPG作為成骨細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，當(dāng)ICA促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化時(shí)，其OPG的分泌也將隨之增多，這對(duì)抑制破骨細(xì)胞分化有著非常積極的作用。由此可見，ICA可通過抑制RANK/RANKL信號(hào)通路及其下游相關(guān)靶基因抑制破骨細(xì)胞的分化，見圖2。

圖2 ICA介導(dǎo)RANK/RANKL信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化機(jī)制Fig.2 Mechanism of icariin-mediated RANK/RANKL signaling pathway inhibiting osteoclast differentiation

3 ICA通過刺激DEC1與PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝

人分化的胚胎軟骨細(xì)胞表達(dá)基因1(differentiated embryo-chondrocyte expressed gene1，DEC1)是基本螺旋-環(huán)-螺旋蛋白的一種。它參與機(jī)體多種生理過程，包括生理節(jié)律性、生理代謝的動(dòng)態(tài)平衡與細(xì)胞增殖、分化和凋亡。研究[10]發(fā)現(xiàn)DEC1的表達(dá)水平與BMSCs中成骨細(xì)胞的表達(dá)密切相關(guān)，DEC1的過表達(dá)會(huì)加速BMSCs向軟骨分化，相反DEC1的低表達(dá)會(huì)抑制BMSCs的成骨分化。另一篇報(bào)道[11]中發(fā)現(xiàn)DEC1在生長期軟骨細(xì)胞中的過度表達(dá)會(huì)增加Runx2和X型膠原的mRNA水平，并使ALP活性提高，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及細(xì)胞礦化，這說明DEC1可通過某種信號(hào)通路表達(dá)調(diào)控成骨分化。雖然目前這種機(jī)制尚未被證實(shí)，但是仍可尋找相關(guān)藥物介導(dǎo)DEC1的表達(dá)水平調(diào)控成骨細(xì)胞的分化。研究證實(shí)[12-13]地塞米松可顯著降低DEC1表達(dá)水平，而ICA作用相反。Hu等[14]研究表明ICA可提高DEC1表達(dá)水平，并且可逆轉(zhuǎn)因地塞米松引起的DEC1低表達(dá)，這種改變主要依賴藥物濃度，研究還證實(shí)了DEC1可促進(jìn)成骨分化，并認(rèn)為ICA可作用PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路參與誘導(dǎo)的成骨過程，促進(jìn)成骨分化。PI3K信號(hào)通路可通過激活下游靶基因蛋白參與多種細(xì)胞增殖分化凋亡及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，其中AKT是PI3K通路中的一種關(guān)鍵激酶，它與PI3K結(jié)合可構(gòu)建成多種信號(hào)的中心網(wǎng)絡(luò)。有研究認(rèn)為PI3K/AKT信號(hào)通路可通過激活下游細(xì)胞因子如HIF-1α、BMPs、GSK-3β等以促進(jìn)血管修復(fù)、調(diào)節(jié)骨代謝平衡，對(duì)治療股骨頭壞死具有非常重要的意義[15]。其中GSK-3β不僅在Wnt/β-catenin信號(hào)中扮演著重要角色，而且當(dāng)GSK-3β受到激活后出現(xiàn)磷酸化可抑制β-catenin的降解，提高β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)的濃度，并與下游成骨細(xì)胞核內(nèi)靶基因cyclin D1與c-myc相結(jié)合，從而加速破骨細(xì)胞凋亡及成骨細(xì)胞增殖分化[16-18]。GSK-3β還可通過抑制NFATc 1與DNA結(jié)合的能力，從而抑制破骨分化[19]。由此可見，ICA通過提高體內(nèi)PI3K、β-catenin、GSK-3β基因的表達(dá)水平從而對(duì)股骨頭壞死血管損傷的修復(fù)以及骨代謝平衡的維持具有非常積極的作用。ICA不僅可單獨(dú)通過提升DEC1的表達(dá)水平促進(jìn)成骨分化，還可刺激PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin的表達(dá)促進(jìn)修復(fù)血管，恢復(fù)血供，調(diào)節(jié)骨代謝平衡，這為股骨頭壞死的治療提供了一種潛在的方法(見圖3)。

圖3 ICA通過刺激DEC1與PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝分子機(jī)制Fig.3 Molecular mechanism of icariin regulating bone metabolism by stimulating DEC1 and PI3K/Akt signaling pathway

4 ICA通過抑制Notch信號(hào)促進(jìn)成骨分化

Notch基因最早由托馬斯于1917年研究果蠅翅膀邊緣切跡原因時(shí)發(fā)現(xiàn)，而該基因形成的信號(hào)通路是一條涉及機(jī)體幾乎所有細(xì)胞增殖分化活動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理及病理過程中起重要作用。該信號(hào)通路主要由Notch受體及其配體(DSL蛋白與CSL蛋白)、Notch調(diào)節(jié)因子及其他效應(yīng)物組成。當(dāng)該受體與配體結(jié)合后會(huì)在Notch跨膜區(qū)胞外端的s1、s2、s3位點(diǎn)分別被furin蛋白酶、ADAM家族的腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)換酶或kuzbanian(Kuz)、早老素(PS)進(jìn)行3次酶切，形成可溶性NICD并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與CSL蛋白結(jié)合，最終與DNA形成多蛋白-DNA復(fù)合體，可激活成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。目前有研究證實(shí)Notch信號(hào)通路在MSCs的多向分化中發(fā)揮著重要作用，主要表現(xiàn)為抑制成骨分化[20]。多種因素可抑制該信號(hào)通路表達(dá)而促進(jìn)成骨分化，如ICA、磷酸鈣及鍶等[21-23]。Xu等[23]通過RNA測(cè)序顯示ICA治療后Notch通路中多個(gè)基因表達(dá)降低，光電導(dǎo)繼電器進(jìn)一步檢測(cè)顯示Notch配體Jagg-1、lunatic fringe基因和Notch信號(hào)下游靶基因Hey-1的mRNA水平也顯著下降，這提示ICA可通過抑制Notch信號(hào)通路的表達(dá)從而促進(jìn)成骨分化，有效提高骨量。鄧宇等[24]研究表明ICA通過激活 Notch 信號(hào)通路促進(jìn)骨BMSCs向成骨細(xì)胞分化，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)ICA提高了BMSCs細(xì)胞成骨分化相關(guān)因子中Hesl、Runx2、mRNA的表達(dá)，但Notch1、Jagged1、CBF1蛋白表達(dá)水平也同樣上升了。上述兩項(xiàng)研究提示Notch信號(hào)通路在成骨分化的作用上仍存在爭議，需要后期更深入的研究，但I(xiàn)CA可作用于該信號(hào)通路刺激成骨分化是普遍認(rèn)可的(見圖4)。

圖4 ICA通過抑制Notch信號(hào)促進(jìn)成骨分化機(jī)制Fig.4 Mechanism of icariin promoting osteogenic differentiation by inhibiting Notch signal

5 ICA通過MAPK通路誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs)是一種由多種信使組成的家族，主要有ERK、p38激酶和JNK 3種。ERK介導(dǎo)的信號(hào)通路一直是BMSCs成骨分化過程中研究的熱點(diǎn)。既往研究[25]表明BMSCs成骨或成脂分化可通過ERK的激活或抑制進(jìn)行控制，而且PDGF、FGF和IGF-I等多種骨活性劑均可通過ERK信號(hào)途徑誘導(dǎo)成骨分化[26]。p38信號(hào)通路是成骨分化過程中的介體，調(diào)控p38也可促進(jìn)BMSCs在體外成骨分化。研究已證實(shí)p38信號(hào)通路在體外有助于促進(jìn)成骨細(xì)胞功能表達(dá)和體內(nèi)骨礦化[27]，而 JNK信號(hào)通路在人骨膜細(xì)胞成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要作用[28]。MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞膜外可被多種因素刺激激活，包括激素、化學(xué)與物理刺激、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子等，激活后可從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核，調(diào)控基因表達(dá)從而控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡。目前有研究認(rèn)為ICA可作為細(xì)胞外因素刺激MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)BMCs進(jìn)行成骨分化[29]。Wu等[30]研究發(fā)現(xiàn)20 μmol/L的ICA雖然不能刺激BMCs的增殖，但是可刺激它向成骨分化，并認(rèn)為這是ICA可刺激成骨相關(guān)細(xì)胞因子導(dǎo)致的結(jié)果。為進(jìn)一步研究MAPK級(jí)聯(lián)在ICA誘導(dǎo)成骨分化中的作用，他們對(duì)ICA刺激下ERK、p38和JNK的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，并運(yùn)用相關(guān)抑制劑做對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ERK、p38和JNK表達(dá)水平與對(duì)照組比在培養(yǎng)15～120 min后都有所上升，這證實(shí)了MAPK參與ICA誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的過程，但筆者認(rèn)為在今后仍需做更多實(shí)驗(yàn)去佐證。具體機(jī)制見圖5。

圖5 ICA通過MAPK通路誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化機(jī)制Fig.5 Mechanism of icariin inducing BMSCs osteogenic differentiation through MAPK pathway

6 總結(jié)與展望

目前淫羊藿在治療股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松癥以及骨性關(guān)節(jié)炎等方面具有良好的臨床療效，已被廣大臨床工作者逐漸接受。ICA作為淫羊藿的主要藥效成分，對(duì)于上述疾病的有效治療作用已通過實(shí)驗(yàn)研究得到充分證實(shí)。通過對(duì)ICA治療ONFH的分子機(jī)制進(jìn)行綜述后，筆者認(rèn)為ICA主要可通過以下幾種途徑促進(jìn)ONFH修復(fù)：①通過經(jīng)典Wnt/β-catenin促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化；②介導(dǎo)RANK/RANKL信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化；③刺激DEC1與PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝；④抑制Notch信號(hào)促進(jìn)成骨分化；⑤刺激MAPK通路誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化。這些都有助于成骨細(xì)胞在股骨頭壞死早期的增殖分化，抑制破骨細(xì)胞分化從而增加股骨頭骨量以及骨強(qiáng)度。另有研究發(fā)現(xiàn) HIF-1α信號(hào)通路可作為PI3K/AKT信號(hào)通路下游基因靶點(diǎn)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加一氧化氮的分泌從而提高血管通透性，可有效改善股骨頭周圍血運(yùn)狀態(tài)[31-32]。目前仍缺乏針對(duì)HIF-1α、TGF-β、FoxO 等自身信號(hào)通路的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，筆者認(rèn)為這些尚未發(fā)現(xiàn)的信號(hào)通路作用方式可能存在于上述相關(guān)通路的下游，需要進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。