大蒜提取物抑制飼料霉菌的應(yīng)用研究

◆作者：董小英 林冰錦 周鵬 陳少珍 唐勝球

◆單位：韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院

飼料霉變是困擾飼料業(yè)和畜牧業(yè)的一個(gè)難題。為增強(qiáng)畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類飲食的安全性，在飼料中添加天然無(wú)毒、高效抗菌、無(wú)抗藥性、加強(qiáng)免疫和經(jīng)濟(jì)實(shí)用型的飼料防霉劑已然成為飼料防霉的研究熱點(diǎn)。研究表明，大蒜中含有抗菌成分，不僅能殺滅病原真菌，還能有效地抑制曲霉菌屬的某些食物競(jìng)爭(zhēng)性雜菌的生長(zhǎng)繁殖。本研究通過研究大蒜提取物的最低抑菌濃度，高溫高濕條件下大蒜提取物在飼料中的最佳添加量及最適pH值條件下大蒜提取物抑制霉菌的效果，探究飼料中添加大蒜提取物對(duì)飼料防霉的作用。通過上述研究，以期為大蒜提取物在飼料防霉中的應(yīng)用，以及安全無(wú)毒、高效抑菌的天然防霉劑的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮大蒜（購(gòu)于本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)）；試驗(yàn)飼料（主要含玉米粉、豆粕、花生餅、葡萄糖、魚粉、碳酸鈣、磷酸氫鈣、蛋氨酸、賴氨酸、預(yù)混料等）；無(wú)水乙醇；察氏培養(yǎng)基；滅菌生理鹽水；乳酸-乳酸鈉緩沖液。

1.2 主要器材

恒溫水浴鍋、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、玻璃三角瓶、移液管、若干培養(yǎng)皿、燒杯、試管與試管架、洗耳球等。

1.3 乙醇萃取法制取大蒜提取物

選取新鮮無(wú)破損的大蒜→剝皮洗凈→準(zhǔn)確稱取100 g→搗成糊狀→按照1∶1 的比例加入95%乙醇100 mL→室溫萃取2h →3500 r/min 離 心 分 離20 min→取上清液→用微孔濾膜過濾→大蒜提取物。注意密封避光保存，建議放在冰箱內(nèi)冷藏保存。

1.4 大蒜提取物的最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

稱取25 g 霉變飼料，溶解于250 mL 滅菌生理鹽水，振蕩加速溶解。取10-1稀釋液10 mL 于一滅菌試管中，用洗耳球及移液管反復(fù)吹吸50 次，使霉菌孢子分散均勻。再用移液管吸取1 mL稀釋液與9 mL 生理鹽水混合均勻，重復(fù)以上稀釋步驟，直到稀釋倍數(shù)達(dá)到10-8，使霉菌量在顯微鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果108個(gè)/mL 為宜，即1×108cfu/mL。

取6 支已滅菌的試管編號(hào)，采用試管二倍稀釋法（韓文瑜等，1992）。依次在編號(hào)的試管中加入1.8 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL 的滅菌生理鹽水，再用移液管吸取0.2 mL 的大蒜提取物加入到第1 支試管中，用洗耳球和移液管反復(fù)吹吸，使大蒜提取物與肉湯培養(yǎng)基充分混勻。再用移液管吸取1 mL 混合液至第2 支試管中，依次類推至第6 支試管，棄去最后吸取的1 mL 混合液。最后制成濃度分別為10%、5%、2.5%、1.25%、0.6%、0.3%的大蒜提取物。

用移液槍吸取濃度稀釋至1×108cfu/mL 的帶菌液0.2 mL分別加入到上述6 支試管中，充分混勻后，各取1 mL 混合液注入提前經(jīng)過滅菌處理的培養(yǎng)皿。然后在各培養(yǎng)皿中倒入溶化并冷卻至50 ℃的察氏培養(yǎng)基15 mL。另吸取1 mL 95%乙醇和0.2 mL 稀釋帶菌液加入到空白培養(yǎng)基，作為對(duì)照。待各培養(yǎng)基冷卻凝固后，倒置放入30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，一周后進(jìn)行霉菌總數(shù)的測(cè)定（GB 13092-91）。為減小誤差，每個(gè)添加濃度重復(fù)3次，且每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 飼料強(qiáng)化防霉（破壞性試驗(yàn)）

首先取6 個(gè)提前經(jīng)過干熱滅菌的鋁盒，分別加入1 kg 試驗(yàn)飼料。接著分別添加0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的大蒜提取物，混合均勻后，在第1～6 組中各添加水分為19%、18.5%、18%、17.5%、17%、16.5%，使飼料中的總水分量達(dá)到19%。半開蓋，移至試驗(yàn)箱中（控制溫度為30±2℃、濕度為90%±2%），培養(yǎng)觀察15 d。為減小誤差，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。每周數(shù)次取出試驗(yàn)飼料進(jìn)行感官檢驗(yàn)，參照表1 判斷各組飼料的霉變情況，做好記錄。觀察過程中應(yīng)盡量避免污染樣品。

1.6 pH 對(duì)大蒜提取物防霉效果的影響

制備含菌平板：各取經(jīng)過滅菌處理并冷卻至50 ℃的察氏培養(yǎng)基15 mL 加入到滅菌培養(yǎng)皿，再用移液槍分別添加上述制備的霉菌孢子懸液1 mL，輕輕晃動(dòng)使其混合均勻，待平面冷卻凝固后倒置存放備用。嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止雜菌污染。

使用乳酸- 乳酸鈉緩沖液將大蒜提取物的pH 值分別調(diào)節(jié)至4.0，5.0，6.0，7.0，8.0。然后分別取不同pH 值的大蒜提取物3 mL 加入到5 個(gè)無(wú)菌試管中，依次做好標(biāo)記后靜置平衡10 h，再開始大蒜提取物的抑菌試驗(yàn)。用無(wú)菌鑷子夾取提前經(jīng)過滅菌處理的牛津杯，輕輕均勻垂直地放在上述制備的含菌平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿中等間隔放入兩個(gè)牛津杯。用移液管吸取0.15 mL pH 值相同的大蒜提取物加入到同一培養(yǎng)皿的牛津杯內(nèi)，并做好標(biāo)記。將各培養(yǎng)皿小心移至35 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。上述試驗(yàn)，每個(gè)pH 水平設(shè)置平行試驗(yàn)3 皿，重復(fù)試驗(yàn)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1大蒜提取物最低抑菌濃度

由表2 可知，大蒜提取物的添加濃度與飼料霉菌的生長(zhǎng)繁殖存在著關(guān)聯(lián)性。當(dāng)大蒜提取物濃度＜5%時(shí)，培養(yǎng)皿內(nèi)仍可見霉菌。而當(dāng)大蒜提取物濃度≥5%時(shí)，培養(yǎng)皿內(nèi)肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)，呈透明狀。由此可知，大蒜提取物對(duì)飼料霉菌的最低抑菌濃度為5%。

表1 飼料感官檢驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

表2 大蒜提取物的最低抑菌濃度測(cè)定

2.2 飼料破壞性試驗(yàn)結(jié)果

在飼料中添加0.5%～2.5%大蒜提取物，進(jìn)行為期15d 的觀察。結(jié)果顯示，飼料中添加0.5%～1.5%大蒜提取物時(shí)，隨著添加比例的遞增，大蒜提取物的防霉效果逐漸加強(qiáng)。1.5%～2.5%大蒜提取物對(duì)飼料霉菌的抑制作用明顯，但無(wú)明顯差異(表3)。

此外，為了能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)出大蒜提取物的最適宜添加比例，基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將大蒜提取物的添加比例細(xì)分為0、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%共6 組，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，在同等的試驗(yàn)條件下培養(yǎng)15d。分別在儲(chǔ)存培養(yǎng)9d 和15d后進(jìn)行取樣，檢測(cè)各處理組飼料中霉菌總數(shù)。由表4 可知，當(dāng)大蒜提取物在飼料中的添加濃度為1.3%時(shí)，其防霉抑菌效果尤為顯著。

表3 添加不同比例大蒜提取物的飼料的霉變情況

表4 各試驗(yàn)組霉菌總數(shù)和抑菌效果統(tǒng)計(jì)（X±SD，n=3）

圖1 不同pH 條件下大蒜提取物的抑菌效果（cm）

2.3 pH 對(duì)大蒜提取物防霉效果的影響

由圖1 可知，pH 在4.0～7.0之間的抑菌圈直徑較大，明顯大于pH=8.0 時(shí)的抑菌圈，說明在酸性條件下，大蒜提取物的抑菌效果較為顯著。其中，當(dāng)大蒜提取物的pH 值為6.0 時(shí)，試驗(yàn)組的抑菌效果明顯優(yōu)于其他pH 條件下的試驗(yàn)組。由此可知，大蒜提取物抑制飼料霉菌的最適宜pH 值為6.0。

3 討論

大蒜提取物內(nèi)含有多種硫醚，可通過與半胱氨酸結(jié)合反應(yīng)、抑制巰基酶活性或脂類等物質(zhì)的合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原真菌以及食物病原性雜菌的抑制殺滅。研究表明，大蒜提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有明顯的抗菌作用，大蒜提取液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 值分別為50 mg/mL 和25 mg/mL（郭永剛等，2008）。另一研究也證實(shí)，大蒜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌有明顯的抗菌效果，但對(duì)綠膿桿菌無(wú)抑制作用（何玉林等，2008）。大蒜的乙醇提取物的抑菌效果好過水提取物, 酸性的水溶液提取物效果最好, 可以較好地控制蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)。K-B 法進(jìn)行體外抑菌活性的研究（穆可云等，2011）。在本試驗(yàn)中，大蒜提取物的防霉抑菌效果得到了有效證實(shí)，其抑制飼料霉菌的最低抑菌濃度為5%。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)可知，在高溫高濕環(huán)境下儲(chǔ)存的飼料易發(fā)生霉變。飼料被霉菌污染后，可引起多方面的危害如降低飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，降低飼料適口性，影響動(dòng)物繁殖性能，干擾動(dòng)物免疫系統(tǒng)，并間接影響人的健康。有報(bào)道，飼料中添加0.95%～1.32%的大蒜汁可延長(zhǎng)飼料霉變的時(shí)間。本試驗(yàn)參考其他學(xué)者的試驗(yàn)方法，采用95%乙醇浸提大蒜研磨液并濃縮制得大蒜提取物。通過對(duì)各試驗(yàn)組飼料的防霉效果進(jìn)行比較，得到以下結(jié)果：當(dāng)大蒜提取物的添加量在0.5%～1.5%時(shí)，其防霉效果與添加量呈正相關(guān)。采用飼料強(qiáng)化防霉（破壞性試驗(yàn)）法發(fā)現(xiàn)，惡化飼料儲(chǔ)存環(huán)境（高溫、高濕），加速飼料霉變，通過感官檢驗(yàn)和霉菌總數(shù)的測(cè)定并證實(shí)，大蒜提取物在飼料中的最適宜添加水平是1.3%。

據(jù)了解，大多數(shù)防霉劑是以弱酸分子的形式穿過霉菌細(xì)胞膜而發(fā)揮作用的。所以隨著基質(zhì)（飼料）pH 值的遞減，未解離的弱酸分子含量越多，防霉劑的作用效果逐漸增強(qiáng)。因此，促使飼料pH 值向酸性范圍內(nèi)轉(zhuǎn)移，可有效提高防霉劑的防霉保鮮效果。本研究也證實(shí)，大蒜提取物在不同的pH 條件下的防霉效果有所區(qū)別，如pH 值趨于酸性范圍時(shí)，大蒜提取物的防霉抑菌效果較顯著；其中pH 值為6.0 時(shí)，大蒜提取物的防霉效果最佳。