ATP7B基因外顯率降低的機(jī)制及對(duì)Wilson病診斷的影響

梁晨 鄭素軍

Wilson病(Wilson’s disease，WD)是由于編碼銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的ATP7B基因發(fā)生變異、造成體內(nèi)銅代謝紊亂的常染色體隱性遺傳病。WD患者主要在5～35歲發(fā)病，臨床表現(xiàn)以進(jìn)行性肝損傷和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致急、慢性肝衰竭，甚至死亡。WD若能早診早治，則預(yù)后良好，故診斷后主張立即開始治療[1]。鑒于目前基因診斷在WD診斷中的重要性，了解ATP7B基因突變的外顯率問題，有助于正確理解目前WD的基因診斷中存在的不足和缺陷，從而制定恰當(dāng)?shù)脑\療、隨訪措施[2-5]。本文就導(dǎo)致ATP7B基因外顯率降低的相關(guān)機(jī)制，以及其對(duì)WD診斷的影響作一綜述。

一、WD基因診斷存在的爭(zhēng)議和挑戰(zhàn)

基因測(cè)序技術(shù)無創(chuàng)、精準(zhǔn)、特異性高。ATP7B基因突變檢測(cè)已成為患者診斷及親屬篩查的一線方法[6]。通過基因篩查，WD患者的確診時(shí)間平均可提前4年[3-4]。2012年歐洲肝病學(xué)會(huì)WD臨床實(shí)踐指南推薦的Leipzig評(píng)分系統(tǒng)[6]，是目前應(yīng)用最廣泛的診斷方法，該評(píng)分系統(tǒng)凸顯了基因診斷的重要地位：當(dāng)患者ATP7B基因存在2個(gè)致病性突變(復(fù)合雜合致病突變或純合致病突變)時(shí)，按照Leipzig評(píng)分可得4分，即可診斷為WD。然而，在臨床實(shí)踐中，考慮到WD常常需要終身藥物治療，而青霉胺等藥物常具有不同程度的毒副作用，對(duì)于無癥狀患者，是否僅憑借基因檢測(cè)就可以確診WD并立即啟動(dòng)臨床治療，尚存在不同聲音，甚至造成一定的臨床決策困惑，值得深入探討[7-8]。

早期研究顯示，世界范圍內(nèi)WD臨床患病率為1/30 000，ATP7B基因雜合突變攜帶率卻高達(dá)1/90。隨后的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，遺傳上計(jì)算的患病率的確高于臨床實(shí)際患病率。例如英國(guó)ATP7B雜合突變基因攜帶頻率為1/25，預(yù)計(jì)攜帶2個(gè)致病性復(fù)合雜合突變頻率為1∶7 026，其遺傳患病率遠(yuǎn)高于1/30 000[9]。某些近親結(jié)婚率低的國(guó)家，WD的臨床患病率較低，如法國(guó)WD臨床患病率為3/200 000，但ATP7B基因雜合突變攜帶率為1/31[10]。在世界范圍內(nèi)，東亞地區(qū)國(guó)家的WD臨床患病率最高，為3/10 000，但韓國(guó)的ATP7B基因雜合突變攜帶頻率卻高達(dá)1/53[11, 12]。另外，近期有研究在排除人群和統(tǒng)計(jì)方法導(dǎo)致的差異后，對(duì)既往報(bào)道的致病性ATP7B基因突變的基因頻率進(jìn)行薈萃分析，利用哈迪-溫伯格方程計(jì)算出全球WD的遺傳患病率為1/7 194，遠(yuǎn)高于臨床患病率7/50 000[11]。綜上可知，世界范圍內(nèi)WD的遺傳患病率遠(yuǎn)高于臨床患病率。

既往曾有病例報(bào)道，對(duì)存在ATP7B基因c.3207C>A(p.H1069Q)純合子突變的、具有嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的WD患者的親屬進(jìn)行基因篩查，發(fā)現(xiàn)患者同胞中有1例存在p.H1069Q純合突變，除KF環(huán)陽性外，雖然其未經(jīng)任何系統(tǒng)治療，直至84歲也未出現(xiàn)可能與WD相關(guān)的癥狀[8]。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)家族多個(gè)親屬存在相同基因突變而臨床表型不同。該家族的先證者(31歲，男性)存在c.2129G>C(p.G710A)純合突變，由于暴發(fā)性肝衰竭而接受了原位肝移植治療。對(duì)該家族進(jìn)行基因篩查后發(fā)現(xiàn)，其同胞(37歲，男性)存在相同突變，然而卻無任何與WD相關(guān)的癥狀及陽性檢查結(jié)果。15年后，先證者三代旁系親屬的下一代中出現(xiàn)1例存在c.2129G>C (p.G710A)/c.2128G>A(p.G710S)復(fù)合雜合突變的患者(16歲，女性)，因暴發(fā)性肝衰竭而進(jìn)行了肝移植。進(jìn)一步對(duì)該代其他成員進(jìn)行基因篩查，發(fā)現(xiàn)1例存在c.2129G>C (p.G710A)/c.1607T>C(p.V536A)復(fù)合雜合突變、卻無癥狀的同胞(16歲，男性)[5]。

由以上研究可知，在同一家族中無癥狀個(gè)體，即使其攜帶與WD先證者相同的純合或復(fù)合雜合致病突變，也不一定影響銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能而導(dǎo)致體內(nèi)銅代謝紊亂，也不一定會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀，故尚不能明確診斷為WD[5, 8]。實(shí)際上，其潛在原因是由于WD遺傳患病率與臨床患病率間存在明顯差異。ATP7B基因外顯率的降低目前被普遍認(rèn)為是造成WD遺傳患病率較臨床患病率高的一種原因[5, 10]。

二、ATP7B基因外顯率降低的機(jī)制

外顯率是指具有特定基因型的個(gè)體，在特定的環(huán)境中表現(xiàn)出相應(yīng)疾病臨床癥狀的比例，常用百分?jǐn)?shù)表示。如果這個(gè)比例等于100%，則該基因或基因型為完全外顯率。反之，則為不完全外顯率，即外顯率降低。其多見于常染色體顯性遺傳病，但也可見于常染色體隱性遺傳病。大型的人口/家庭流行病學(xué)及基因篩查被認(rèn)為是測(cè)量外顯率的必要手段。將1 000基因組項(xiàng)目(1 000 Genomes Project)測(cè)序結(jié)果(一般人群為主)與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Database, HGMD)進(jìn)行比較，結(jié)合美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(the American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)與分子病理學(xué)會(huì)(the Association for Molecular Pathology，AMP)共同修訂的《序列變異分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)指南》，發(fā)現(xiàn)健康的個(gè)體可以擁有大量的潛在致病變異，而不會(huì)表現(xiàn)出相應(yīng)的臨床癥狀。所以，外顯率降低是人類遺傳學(xué)中普遍存在的一種現(xiàn)象[5, 13-14]。總結(jié)造成ATP7B外顯率降低的可能機(jī)制如下(圖1)。

圖1 ATP7B基因外顯率降低的相關(guān)機(jī)制

(一)ATP7B突變位點(diǎn)及突變類型對(duì)外顯率的影響 WD屬于常染色體隱性遺傳病，最常見的突變類型是錯(cuò)義突變，其次是移碼突變、無義突變。錯(cuò)義突變分別占所有可能性致病變異的52%、突變等位基因頻率的85%，其對(duì)外顯率的影響往往小于移碼、無義突變[11]；但也有例外，如目前在ATP7B信號(hào)肽區(qū)域發(fā)現(xiàn)的唯一的致病性錯(cuò)義突變p.N41S，可導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的錯(cuò)誤定位，完全阻斷銅的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使個(gè)體發(fā)病年齡較早。銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性消失或降低，還受ATP7B基因突變位點(diǎn)的影響。歐洲WD患者中最常見的突變位點(diǎn)為p.H1069Q。p.H1069Q突變導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上高度保守的SEHPL結(jié)構(gòu)域內(nèi)、第1069位的氨基酸由組氨酸變成谷氨酰胺，從而影響銅在高爾基體上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。一項(xiàng)對(duì)荷蘭WD患者p.H1069Q與臨床表型間關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，p.H1069Q純合或雜合突變的患者，比非p.H1069Q突變的患者發(fā)病更晚(平均年齡依次為20.9歲、15.9歲、12.6歲)。而且薈萃分析發(fā)現(xiàn)，p.H1069Q突變與Wilson疾病遲發(fā)有關(guān),且純合突變比雜合突變的影響更大[15]，其原因可能是此突變導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低的程度小，對(duì)其功能影響小，導(dǎo)致體內(nèi)具有潛在毒性的金屬銅蓄積較慢。然而也有研究顯示，即使突變發(fā)生在銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相同的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其功能結(jié)果也有很大差異。如位于ATP結(jié)構(gòu)域的p.P840L與同一結(jié)構(gòu)域內(nèi)的p.I857T相比，前者對(duì)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的影響更大[15]。綜上，同一基因中突變位點(diǎn)不同，其外顯率可能不同；在同一基因區(qū)域，某些特定突變位點(diǎn)也會(huì)影響外顯率，且等位基因的數(shù)量也可影響外顯率[13]。

(二)ATP7B基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)外顯率的影響 單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指發(fā)生在一般人群基因組水平上的單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，變異頻率大于1%，通常被認(rèn)為是良性變異[13]。有研究報(bào)道，ATP7B基因中常見的SNPs位點(diǎn)，如p.K832和p.R952，并沒有從根本上影響銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，但可調(diào)節(jié)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的化學(xué)性質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的銅穩(wěn)態(tài)[16]。所以，在具有ATP7B致病突變的WD患者中，SNPs的存在可能會(huì)加劇致病突變的作用，從而影響WD的外顯率。另一方面，雖然ATP7B SNPs對(duì)體內(nèi)銅代謝過程的影響較小，但由于不同個(gè)體之間及環(huán)境差異等的影響，可能也會(huì)存在僅攜帶SNPs位點(diǎn)的WD患者[16-17]，即SNP表現(xiàn)出致病性。

(三)ATP7B基因調(diào)控因子、多種相關(guān)蛋白表達(dá)水平對(duì)外顯率的影響 銅在體內(nèi)的蓄積水平以及是否引起病理后果，也受ATP7B基因調(diào)控因子，和多種相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的影響[18]?；虮磉_(dá)受順式和反式調(diào)節(jié)因子的組合調(diào)控[13]。順式作用元件本質(zhì)上是一段DNA序列，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，存在于基因序列的上游或下游。反式調(diào)節(jié)因子是指能直接或間接地識(shí)別、結(jié)合順式作用元件序列，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。ATP7B基因表達(dá)的最終產(chǎn)物是銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[4]，因此順式作用元件或反式調(diào)節(jié)因子的多態(tài)性可通過調(diào)控ATP7B基因的表達(dá)，來介導(dǎo)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的高低，進(jìn)而影響ATP7B基因的外顯率。

另外，多種相關(guān)蛋白是否正常表達(dá)在調(diào)節(jié)ATP7B基因的外顯率中也發(fā)揮著重要作用。例如，在胞質(zhì)內(nèi)傳遞銅離子到銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所必須的HAH1伴侶蛋白，腸道內(nèi)可大量結(jié)合金屬離子的金屬硫蛋白，以及可以在細(xì)胞水平上對(duì)抗銅誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能力的谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和熱休克蛋白等[18-19]。

(四)修飾基因?qū)TP7B基因外顯率的影響 WD患者ATP7B基因型-臨床表型之間存在不完全一致現(xiàn)象，表明存在修飾基因。修飾基因是指本身具有或者不具有表型效應(yīng)，和另一突變基因同時(shí)存在時(shí)會(huì)影響另一基因的表達(dá)程度的基因。這些修飾基因可影響個(gè)體對(duì)銅的耐受力或體內(nèi)銅的儲(chǔ)存能力。目前一些研究開始探索除ATP7B以外的突變基因?qū)D表型表達(dá)的作用[14]。

載脂蛋白e(ApoE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇和脂類轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白,也是肝臟的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一。銅的細(xì)胞毒性作用是通過參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、產(chǎn)生自由基導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷來介導(dǎo)的。ApoE可以結(jié)合金屬離子起到抗氧化作用，不同ApoE亞型對(duì)金屬的親和力不同，其中ApoE3對(duì)銅的親和力最高。有研究發(fā)現(xiàn)，在相同的ATP7B基因遺傳背景(納入患者均為純合p.H1069Q)下，不同的ApoE基因型是神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟癥狀延遲發(fā)生的重要因素之一[20]。其中，攜帶ApoEε3/3基因型的患者較其他基因型(ApoEε3/2，ApoEε3/4，ApoEε4/2)患者，出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟癥狀的時(shí)間明顯晚、癥狀輕。故ApoE基因可通過抗氧化和保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，延緩WD發(fā)生，且ApoEε3/3比其余基因型更有效。另外，ApoE4也被發(fā)現(xiàn)是阿爾茨海默癥的危險(xiǎn)因素，并可影響創(chuàng)傷性腦損傷造成的神經(jīng)系統(tǒng)障礙的預(yù)后[20-22]。印度一項(xiàng)研究顯示，與健康對(duì)照組相比，WD患者中ApoE4等位基因的比例明顯升高，考慮ApoE4可能是WD發(fā)病的潛在風(fēng)險(xiǎn)因子，但該結(jié)果需要在更大的隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證[23]。

當(dāng)ATP7B基因突變導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能受損時(shí)，除上述ApoE基因外，由于一些其他調(diào)節(jié)銅代謝過程的基因(如MTHFR、COMMD1、ATOX1、HAH1等)的干預(yù)，可能會(huì)使WD患者的銅代謝參數(shù)正常，但目前它們?cè)赪D中的重要作用尚未完全明確[22, 24]。另外，Patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域蛋白3(PNPLA3)主要參與甘油三酯代謝過程，PNPLA3突變最常見于非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者中，也被發(fā)現(xiàn)與WD患者中肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞中甘油三酯蓄積有關(guān)，故PNPLA3可能通過調(diào)節(jié)肝臟脂肪變性的嚴(yán)重程度，來影響ATP7B基因的外顯率[4]。

(五)年齡、性別對(duì)ATP7B基因外顯率的影響 既往報(bào)道顯示多種遺傳性疾病的外顯率與患者年齡相關(guān)，WD也不例外[7]。一項(xiàng)迄今為止，納入了最大WD患者隊(duì)列的研究表明，年齡可有效地影響WD的臨床表型[25]。通常，年齡<10歲的WD患者以肝臟癥狀為首發(fā)表現(xiàn)，而青春期和成年發(fā)病的WD患者多以神經(jīng)系統(tǒng)障礙為首發(fā)癥狀。

遺傳突變外顯率與性別相關(guān)，可能是由于男女之間受差異基因的調(diào)控，特別是與性激素相關(guān)的基因[7]。雌激素可作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子參與神經(jīng)再生過程。另外，雌激素在慢性肝炎、肝纖維化、NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的保護(hù)作用也在臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中得到了證明[21]。在切除卵巢的WD大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，性激素對(duì)WD大鼠的發(fā)病率無影響，但可影響其病程進(jìn)展；另外，外源性睪酮可提高爆發(fā)型肝衰竭WD大鼠的存活率，外源性雌二醇可延遲WD大鼠的發(fā)病[26]。攜帶p. H1069Q純合突變的荷蘭WD患者中女性較多，其發(fā)病較晚，原因可能是由于雌激素的保護(hù)作用；但進(jìn)一步對(duì)p. H1069Q基因型與性別間關(guān)系進(jìn)行薈萃分析，未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，排除了暴發(fā)性WD和溶血性貧血的病例后，不同性別WD患者間肝臟表型無差異，但對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是雌激素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用[25]。

(六)環(huán)境、表觀遺傳修飾及其他因素對(duì)ATP7B基因外顯率影響 除了上述因素外，環(huán)境、表觀遺傳修飾和多種代謝物等因素，似乎也在影響ATP7B基因外顯率方面起著關(guān)鍵作用。日常飲食中銅和鋅、酒精、感染、某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物(如大腸桿菌等)、可促進(jìn)飲食中金屬離子吸收的食品添加劑(如姜黃素等)等環(huán)境因素，可直接調(diào)節(jié)膳食銅的吸收，進(jìn)而影響ATP7B基因外顯率[5, 15, 25]。

對(duì)于遺傳和環(huán)境背景相同的同卵雙胞胎，其臨床表型通常不完全相同，說明突變的不完全外顯率是經(jīng)常發(fā)生的，應(yīng)該考慮表觀遺傳修飾(如DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑)的影響[19, 27]。排除后天的環(huán)境及表觀遺傳修飾的影響，同卵雙胞胎突變外顯率降低的原因還有多種不同的遺傳學(xué)解釋，如受精卵分裂后的突變、代償性突變和體細(xì)胞拷貝數(shù)變異等。

三、總結(jié)與展望

目前，ATP7B基因檢測(cè)是協(xié)助WD診斷的重要手段[1]。然而，研究顯示，ATP7B基因外顯率并不是100%。部分人群即使攜帶ATP7B純合或復(fù)合雜合致病突變，體內(nèi)也不一定存在銅代謝障礙，不見得發(fā)病。許多基因突變可能只是條件致病性的，只有當(dāng)遺傳和外部環(huán)境等上述因素間相互作用，使患者體內(nèi)銅蓄積到某種概念上的閾值時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生病理狀態(tài)。因此，對(duì)于無癥狀WD患者，分子診斷仍具有挑戰(zhàn)性，僅憑基因檢測(cè)有時(shí)并不足以做出臨床和治療決策，尚需結(jié)合其他檢查(如銅藍(lán)蛋白、24小時(shí)尿銅定量、眼睛KF環(huán)、肝功能、肝組織銅定量、肝臟及頭顱影像學(xué)等)來綜合判斷[5, 7]。部分僅檢出存在純合或復(fù)合雜合致病性突變、而無任何癥狀及體征的人群，經(jīng)過全面評(píng)估，可以在患者充分知情同意的情況下，可暫不進(jìn)行治療，但應(yīng)定期進(jìn)行隨訪監(jiān)測(cè)。

總之，目前ATP7B基因外顯率降低的機(jī)制仍未完全闡明，仍需進(jìn)一步研究。這也對(duì)目前常用Leipzig評(píng)分中、單憑基因檢測(cè)(復(fù)合雜合突變或純合突變4分)就做出WD診斷的可靠性，提出了新的挑戰(zhàn)，有必要進(jìn)一步完善這一診斷標(biāo)準(zhǔn)，相應(yīng)的無癥狀WD患者的臨床治療及隨訪管理方案也需要進(jìn)一步研究和制定。