HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦miR-122 rs7227488基因多態(tài)性與HBV宮內(nèi)感染發(fā)生的相關(guān)性

林婧 夏霖 馮地路

孕婦HBsAg陽(yáng)性是HBV宮內(nèi)感染的影響因素之一，宮內(nèi)感染多發(fā)生于孕晚期[1,2]。但高危孕產(chǎn)婦所生嬰兒個(gè)體HBV感染差異較明顯，可能與病原特征、環(huán)境暴露因素及遺傳易感性有關(guān)。miR-122是肝臟特異性miRNA，在維護(hù)肝臟正常生理過程中發(fā)揮重要作用，且與HBV載量聯(lián)系密切[3,4]。因此miR-122表達(dá)水平可能與HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦HBV宮內(nèi)感染有關(guān)，miR-122啟動(dòng)子基因多態(tài)性可能影響miR-122表達(dá)。本研究探討miR-122基因啟動(dòng)子區(qū)rs7227488基因多態(tài)性與新生兒HBV感染的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

以2017年10月至2019年7月華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院西院分娩的141對(duì)HBsAg陽(yáng)性孕婦及其新生兒作為研究對(duì)象，所有新生兒出生24 h內(nèi)接種重組酵母乙型肝炎疫苗(深圳康泰生物制品股份有限公司)及肌內(nèi)注射乙肝免疫球蛋白(上海生物制品研究所有限責(zé)任公司)100 IU，出生后1、6個(gè)月分別接種乙肝疫苗各5 μg，根據(jù)新生兒出生3個(gè)月內(nèi)外周血HBsAg、HBV DNA表達(dá)情況分為HBV宮內(nèi)感染47例，無HBV宮內(nèi)感染94例。HBV宮內(nèi)感染新生兒男26例，女21例。無HBV宮內(nèi)感染新生兒男51例，女43例。

二、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①孕婦HBsAg陽(yáng)性；②孕產(chǎn)婦及其丈夫無家族遺傳病史，丈夫非HBV攜帶者；③孕產(chǎn)婦及其丈夫均為漢族；④單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕產(chǎn)婦合并妊娠期糖尿病、高血壓；②合并全身系統(tǒng)性疾??；③孕產(chǎn)婦孕期服用抗病毒及免疫調(diào)節(jié)類藥物。本研究符合醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)范；所有受試孕婦及其家屬均簽署知情同意書。

三、方法

(一)標(biāo)本采集與處理 抽取孕晚期或圍生期孕產(chǎn)婦肘靜脈血2 mL，采集新生兒出生3個(gè)月后頸靜脈血或頭皮靜脈血1 mL，于EDTA抗凝管中，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(二)基因組DNA提取及基因多態(tài)性檢測(cè) 采用基因提取試劑盒提取(北京天根生化科技有限公司)孕產(chǎn)婦全血中基因組DNA，嚴(yán)格參照操作說明書進(jìn)行。

(三)引物設(shè)計(jì)與PCR 利用Primer 5.0生物軟件設(shè)計(jì)miR-122基因啟動(dòng)子SNP rs7227488的引物，上游引物：5′-GTTAAACTGGTTGGAAG-TTGG-3′，下游引物：5′-ATTGGAAAGTCCATTCC-TCTG-3′(上海生工生物工程有限公司合成)。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物(25 mmol/L)各0.4 μL，10×TaP Buffer 2.5 μL，4×dDNTP(2.5 mmol/L)2 μL，二甲基亞砜(DMSO)1.25 μL，TaqDNA合成酶(大連寶生物工程公司)0.2 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 75 μL，單管反應(yīng)體積25 μL。熱循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變形30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次，72℃延伸7 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠( ethidium bromide，EB)染色分析，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為231 bp。

(四)酶切反應(yīng) 采用限制性內(nèi)切酶MsPI(美國(guó)Sigma公司)酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系：10×Buffer 1.5 μL，0.1×BSA 1.5 μL，MsP I 0.8 μL，PCR產(chǎn)物DNA 6 μL，ddH2O 5.2 μL。單管反應(yīng)體積15 μL。反應(yīng)條件：37℃下溫浴2 h，10×Buffer 1.5 μL后終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物以3.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色分析。產(chǎn)物委托北京諾禾致源科技股份有限公司代為測(cè)序。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般資料比較

無HBV宮內(nèi)感染組與HBV宮內(nèi)感染組的新生兒性別、孕產(chǎn)婦年齡、分娩時(shí)孕周、分娩方式、HBIG注射史等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與無HBV宮內(nèi)感染組相比，HBV宮內(nèi)感染組HBV DNA含量升高(P<0.05)。見表1。

二、Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)

根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律，無HBV宮內(nèi)感染組與HBV宮內(nèi)感染組G/A各基因型的期望值和觀察值符合Hardy-Weinberg平衡定律(均P>0.05)，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究具有代表性。見表2。

表1 兩組一般資料比較

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果

三、miR-122啟動(dòng)子rs7227488基因位點(diǎn)與基因分型

94例無HBV宮內(nèi)感染組miR-122啟動(dòng)子rs7227488位點(diǎn)3種基因型分別為：GG型64例(68.1%)，GA型27例(28.7%)，AA型3例(3.2%)。G等位基因頻率為155(82.4%)，A等位基因頻率為33(17.6%)。

47例HBV宮內(nèi)感染組miR-122啟動(dòng)子rs7227488位點(diǎn)3種基因型分別為：GG型21例(44.7%)，GA型17例(36.2%)，AA型9例(19.1%)。G等位基因頻率為59(62.7%)，A等位基因頻率為35(37.2%)。

與無HBV宮內(nèi)感染組44.6%相比，HBV宮內(nèi)感染組55.3%rs7227488位點(diǎn)G/A點(diǎn)突變率顯著升高(P<0.05)。

四、HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦發(fā)生HBV宮內(nèi)感染危險(xiǎn)因素分析

以HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦是否發(fā)生宮內(nèi)感染為自變量，HBV DNA含量、miR-122啟動(dòng)子rs7227488基因分型GG型、GA型、AA型為因變量進(jìn)行二元logistic回歸分析，結(jié)果顯示HBV DNA含量、miR-122啟動(dòng)子rs7227488位點(diǎn)AA型是HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦患者發(fā)生宮內(nèi)感染的危險(xiǎn)因素(OR：1.512、1.898，均P<0.05)。見表3。

討 論

MiR-122是一種肝臟特異性miRNA，在肝臟總miRNA中豐度最高，對(duì)肝功能具有重要調(diào)節(jié)作用，參與肝臟的發(fā)育分化，并維持肝臟正常功能[5,6]。研究顯示，miR-122可抑制肝癌細(xì)胞增殖[7]，肝癌組織中miR-122表達(dá)下降。HBV持續(xù)感染是引起肝癌的原因之一，有研究顯示，miR-122可下調(diào)HBV基因的表達(dá)[8]。荊曉晴等[9]研究顯示，HBV感染過程中，上調(diào)miR-122表達(dá)可抑制HBV復(fù)制，提示miR-122與HBV感染關(guān)系密切；其認(rèn)為影響miR-122表達(dá)水平的相關(guān)因素可能與HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦HBV宮內(nèi)感染個(gè)體易感性有關(guān)。miR-122啟動(dòng)子260 bp處(rs 7227488)存在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(A>G)，熊玉娟等[10]研究雙熒光素酶報(bào)告基因顯示，此位點(diǎn)不同等位基因型對(duì)miR-122活性有影響。本研究中無HBV宮內(nèi)感染組與HBV宮內(nèi)感染組HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦miR-122 rs 7227488 G/A各基因型的期望值和觀察檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究具有代表性。

表3 HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦發(fā)生HBV宮內(nèi)感染危險(xiǎn)因素分析

HBV宮內(nèi)感染組孕婦miR-122 rs7227488 G/A突變率顯著高于無HBV宮內(nèi)感染組孕婦，提示位點(diǎn)rs7227488 G/A突變可能與HBV宮內(nèi)感染有關(guān)。但HBV宮內(nèi)感染組與無HBV宮內(nèi)感染組miR-122 rs7227488 GA型差異較小，而AA型差異較大，提示miR-122 rs 7227488 AA型可能是增加發(fā)生HBV宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)的原因，而GG型在無HBV宮內(nèi)感染組比例高于HBV宮內(nèi)感染組，提示GG型可能更多發(fā)揮抗感染作用。Caviglia等[11]研究顯示，miR-122可通過與HBV 5端非翻譯區(qū)結(jié)合，維持HBV穩(wěn)定，促進(jìn)HBV復(fù)制。van der Ree等[12]研究顯示，miR-122與HBV載量密切相關(guān)。以上結(jié)果均提示miR-122 rs7227488基因多態(tài)性可能通過影響miR-122表達(dá)參與HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生，但本研究未對(duì)基因型與miR-122表達(dá)關(guān)系進(jìn)一步探討。經(jīng)logistic回歸分析顯示，HBV DNA含量、HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦miR-122 rs7227488 AA基因型是發(fā)生宮內(nèi)感染的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，HBsAg陽(yáng)性孕產(chǎn)婦miR-122 rs7227488 AA基因型與HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生密切相關(guān)，但由于新生兒樣本量較小，因此只能推測(cè)以上幾點(diǎn)可能與 HBV 母嬰傳播有關(guān)，今后需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量證實(shí)以上miR-122 rs7227488是否與HBV宮內(nèi)感染有確定關(guān)聯(lián)性。