PELP1在胃癌中的致瘤作用*

顏洪竹， 孫燕玲， 吳 喆， 孫元鵬， 劉于思， 韋先明， 馬 梓， 劉尚勤， 肖武漢， 寧志豐△， 劉復(fù)興△

1湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，十堰 442000 湖北科技學(xué)院 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 3臨床醫(yī)學(xué)院，咸寧 437100 武漢大學(xué)中南醫(yī)院 4中醫(yī)科 5血液科，武漢 430070 6中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所魚(yú)類(lèi)低氧生物學(xué)學(xué)科組，武漢 430072

胃癌是全球最常見(jiàn)的癌癥之一，也是癌癥致死的主要原因[1]。在中國(guó)，由于老齡化以及不健康的生活方式，如鹽的攝取過(guò)多、吸煙、酗酒、幽門(mén)螺桿菌感染率高等，導(dǎo)致胃癌的發(fā)病率位列腫瘤發(fā)生率第2位[2]。近年來(lái)，雖然胃癌的發(fā)病機(jī)制正在被逐步闡明，治療方法也得到進(jìn)一步改善，但進(jìn)展期胃癌患者的5年生存率和總生存時(shí)間依然徘徊在較低水平，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是胃癌患者死亡的主要原因。

脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-，glutamic acid-，and leucine-rich protein 1，PELP1)是雌激素受體非基因組作用的調(diào)節(jié)劑和雌激素受體的共調(diào)節(jié)劑，其基因定位于17號(hào)染色體的p13.2區(qū)域，編碼長(zhǎng)度為1130氨基酸的蛋白質(zhì)。編碼的蛋白質(zhì)氨基端為10個(gè)LXXLL基序(motif)(X為任意氨基酸殘基)組成的核受體結(jié)合區(qū)，羧基端為富含谷氨酸的結(jié)構(gòu)域，并含有2個(gè)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域。作為多種轉(zhuǎn)錄因子的共激活因子，PELP1參與許多生理[3-5]和病理過(guò)程[6]，生物學(xué)功能廣泛。研究表明，PELP1是激素依賴性腫瘤如乳腺癌[7-8]、卵巢癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10-11]和前列腺癌[12]的原癌基因，此外，在激素非依賴性腫瘤如腦腫瘤[13]、肺癌[14]和結(jié)直腸癌[15-16]中亦有作用。本研究探討了PELP1與胃癌的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和培養(yǎng)方法

人胃腺癌細(xì)胞(AGS細(xì)胞和NCI-N87細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(中國(guó)上海)典型培養(yǎng)物保藏中心，正常人胃上皮細(xì)胞(GES-1細(xì)胞)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA，美國(guó))。上述細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 PELP1通路信息預(yù)測(cè)及篩選

從Oncomine(http：//www.oncomine.org)和CCLE(Cancer Cell line Encyclopaedia)獲得PELP1在不同癌癥組織、不同類(lèi)型胃癌組織以及正常胃黏膜組織中mRNA表達(dá)情況。利用Biocarta數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)人類(lèi)細(xì)胞中的PELP1通路信息并篩選出Src-Erk通路，該通路是PELP1調(diào)節(jié)雌激素受體活性的重要通路(https：//cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta_Pathways)。

1.3 組織芯片及免疫組化技術(shù)檢測(cè)PELP1蛋白在胃癌及癌旁組織的表達(dá)

胃癌及癌旁組織芯片(tissue microarray，TMA)購(gòu)自谷歌生物公司。該芯片包括36組胃癌組織及其相應(yīng)正常癌旁胃黏膜組織標(biāo)本，并含有全部36例患者的臨床病理資料和隨訪資料。所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)組織脫水處理、石蠟包埋。采用手工組織芯片點(diǎn)樣儀制作組織芯片。制備好的芯片以PELP1多克隆抗體(稀釋度1∶100，ABclonal，貨號(hào)A13414)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。組織芯片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由病理醫(yī)師遵循雙盲原則進(jìn)行評(píng)判，在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。統(tǒng)計(jì)計(jì)分從兩個(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)，①染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：<5%為0分，5%～為1分，25%～為2分，>50%為3分；②染色強(qiáng)度：無(wú)細(xì)胞著色計(jì)0分，呈淡黃色著色計(jì)1分，棕黃色著色計(jì)2分，深褐色著色計(jì)3分。將每例兩項(xiàng)得分相加即為該腫瘤陽(yáng)性表達(dá)得分。最低得分為0分，最高得分為6分；≤2分為陰性或弱表達(dá)，3～4分為中度陽(yáng)性，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性表達(dá)包括中度陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性。同時(shí)每張切片取5個(gè)隨機(jī)視野，通過(guò)分析軟件(Image-pro plus 6.0)測(cè)定圖片的平均吸光度作為PELP1染色強(qiáng)度，以此半定量PELP1的組織表達(dá)水平。

1.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PELP1的蛋白表達(dá)水平

收集細(xì)胞，使用RIPA緩沖液[1%Triton X-100，50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，0.1%SDS和1 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，1%脫氧膽酸鈉]提取總蛋白，使用二辛可寧酸定量。每個(gè)蛋白樣品取20～25 μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以含有5%牛血清白蛋白的TBST緩沖液洗膜約1 h，與下列一抗在4℃下孵育過(guò)夜：兔抗-PELP1抗體(稀釋度1∶1000，ABclonal，貨號(hào)A3189)，抗c-Src抗體(稀釋度1∶1000，ABclonal，貨號(hào)A0324)，抗Phospho-Src-Y529抗體(稀釋度1∶500，ABclonal，貨號(hào)AP0185)和小鼠多克隆GAPDH抗體(稀釋度1∶1000，Santa Cruz，貨號(hào)SC-47724)。一抗孵育結(jié)束以TBST洗膜，室溫下將膜與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋度1∶5000，Proteintech)或山羊抗小鼠IgG二抗(稀釋度1∶20000，Proteintech)孵育，顯影。利用Fujifilm LAS4000微型發(fā)光圖像分析儀和Multi Gauge V3.0圖像分析軟件(FujiFilm公司，日本)分析顯影條帶，以GAPDH為內(nèi)參。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中PELP1 mRNA表達(dá)水平

按照文獻(xiàn)[16]的方法提取細(xì)胞RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)。收集細(xì)胞，用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，定量后利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。隨后以cDNA為模板，使用QuantiTectSYBR?GreenRT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。特定引物的序列見(jiàn)表1。

1.6 PELP1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

利用Ambion網(wǎng)站設(shè)計(jì)3對(duì)PELP1-siRNA(表2)，分別為PELP1-siRNA1、PELP1-siRNA2、PELP1-siRNA3，其陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照購(gòu)自GenePharma公司(中國(guó)上海)。通過(guò)鑒定，選擇干擾效果最好的PELP1-siRNA1進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將密度為1×106/孔的AGS細(xì)胞接種于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，直至細(xì)胞融合達(dá)到70%～90%，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，收集AGS胃癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，未作處理的AGS胃癌細(xì)胞為對(duì)照組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用的PELP1-siRNA序列見(jiàn)表2。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers for qRT-PCR

表2 PELP1-siRNA序列Table 2 PELP1-siRNA sequence

1.7 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞以1×103/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h，分組處理48 h后吸去培養(yǎng)上清，加入10 μL CCK-8(Dojindo，日本)，孵育4 h，分光光度儀(Molecular Devices，澳大利亞)測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A450 nm)。

1.8 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于6 cm平板(Costar)，調(diào)整密度分別為50、100、200個(gè)細(xì)胞/板，以完全培養(yǎng)液、37℃、5%CO2培養(yǎng)約7 d。PBS洗滌細(xì)胞2次，甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，在光學(xué)顯微鏡下(×100)計(jì)數(shù)直徑超過(guò)50 μm的細(xì)胞克隆數(shù)。以克隆形成率表示細(xì)胞的增殖能力，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 劃痕實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞植入6孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，以無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜。換完全培養(yǎng)液，以10 μL加樣槍頭于皿底部中間劃痕，分別于0、12、24 h在倒置相差顯微鏡下觀察劃痕區(qū)域并拍照，利用Image J軟件計(jì)算劃痕面積和傷口愈合百分比。

1.10 EdU細(xì)胞增殖活性測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中的蓋玻片上，分組處理后將細(xì)胞與完全培養(yǎng)液和50 μmol/L EdU在37℃下孵育2 h。孵育結(jié)束以預(yù)冷的PBS洗滌蓋玻片，并在室溫下以4%甲醛水溶液固定30 min。固定后的細(xì)胞用100 μL Apollo染色溶液處理30 min，隨后在0.4%Triton X-100中洗滌3次，以100 μL Hoechst33342孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞3次后在熒光顯微鏡(×200，×400)下采用圖像分析軟件Image-pro plus 6.0進(jìn)行拍照和熒光強(qiáng)度分析，每個(gè)樣本至少選取5個(gè)視野，取其平均值。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

將細(xì)胞在4℃的70%乙醇中固定30 min，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后，將細(xì)胞用0.1%Triton 100(Sigma)，20 μg/mL RNase A(Sigma)和10 μg/ mL碘化丙啶(Sigma)染色30 min，F(xiàn)ACScan流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.12 Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液以1×106/孔接種在Transwell小室(8 μm，BD Biosciences)上室[遷移實(shí)驗(yàn)不鋪基質(zhì)膠，侵襲實(shí)驗(yàn)用基質(zhì)膠(BD biosciences)填充上室的底部]，下室中加入含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液500 μL，培養(yǎng)16～24 h，用棉簽除去未遷移或侵入孔的細(xì)胞，固定膜下表面的遷移細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下取5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)膜底部的細(xì)胞，并計(jì)算平均值。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PELP1在人胃癌組織中顯著表達(dá)上調(diào)

首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估不同癌癥組織、不同類(lèi)型胃癌組織以及正常胃黏膜組織中PELP1 mRNA表達(dá)情況(圖1)，結(jié)果表明，相對(duì)于正常胃黏膜組織，PELP1 mRNA在胃癌組織中顯著表達(dá)上調(diào)。接著我們利用組織芯片對(duì)36例胃癌患者的胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中PELP1的表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及半定量分析，結(jié)果(圖2)表明，PELP1在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織[平均吸光度值(0.346±0.017)vs.(0.235±0.012)，P<0.05]。

A：PELP1 mRNA在不同癌組織中的表達(dá)；B1～B4：PELP1 mRNA在正常胃組織與不同類(lèi)型胃癌組織中的表達(dá)圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估不同癌癥組織、不同類(lèi)型胃癌組織以及正常胃黏膜組織中PELP1 mRNA表達(dá)Fig.1 Expression of PELP1 mRNA in different cancer tissues，different types of gastric cancer tissues and normal gastric mucosa tissues evaluated by Oncomine database

A：癌旁胃黏膜組織；B：胃癌組織圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織芯片中胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中PELP1的表達(dá)Fig.2 Detection of the expression of PELP1 in gastric cancer tissues and normal gastric mucosa tissues adjacent to cancer by immunohistochemical staining

2.2 PELP1表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

將組織芯片提供的患者臨床病理資料與其胃癌組織PELP1表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)分析(表3)，結(jié)果提示胃癌組織中PELP1的表達(dá)與腫瘤分期和分級(jí)正相關(guān)(均P<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤大小均無(wú)明顯相關(guān)。

為了明確PELP1表達(dá)與胃癌預(yù)后之間的關(guān)系，進(jìn)一步分析來(lái)自O(shè)ncomine的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)。生存分析結(jié)果表明，PELP1表達(dá)水平較低患者的總生存期(overall survival，OS)優(yōu)于PELP1表達(dá)水平較高的患者(圖3A)。Box圖數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示PELP1水平與胃癌患者的腫瘤分級(jí)密切相關(guān)(圖3B)。對(duì)組織芯片提供的36例胃癌患者的臨床隨訪資料進(jìn)行生存期分析，結(jié)果也提示PELP1表達(dá)較低的患者有更長(zhǎng)的總生存期(圖3C)。

A：利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)資料生成的生存曲線；B：利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)獲得胃癌等級(jí)箱形圖顯示PELP1的表達(dá)與腫瘤分級(jí)的關(guān)系；C：根據(jù)組織芯片提供的36例胃癌患者臨床隨訪資料繪制的生存曲線圖3 PELP1表達(dá)與胃癌患者生存預(yù)后的關(guān)系Fig.3 Correlation of PELP1 expression and prognosis of gastric cancer patients

2.3 PELP1在不同胃細(xì)胞系中的表達(dá)

通過(guò)CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)得到PELP1 mRNA在不同胃細(xì)胞系中的表達(dá)情況(圖4)。進(jìn)一步選擇胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、NCI-N87以及正常人胃上皮細(xì)胞GES-1，以Western blot和qRT-PCR分別檢測(cè)其中PELP1蛋白和mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明AGS細(xì)胞中PELP1的蛋白和mRNA表達(dá)均較正常胃上皮細(xì)胞GES-1顯著升高(圖5)。

表3 利用組織芯片資料分析PELP1表達(dá)與胃癌 患者臨床病理特征的關(guān)系(例)Table 3 The relationship between PELP1 expression and clinicopathological characteristics of gastric cancer patients using tissue microarray data(n)

圖4 CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中PELP1在不同胃細(xì)胞系的表達(dá)Fig.4 Expression of PELP1 mRNA in different gastric cell lines in CCLE database

A：Western blot檢測(cè)PELP1蛋白表達(dá)；B：qRT-PCR檢測(cè)PELP1 mRNA表達(dá)，**P<0.01圖5 PELP1在正常胃上皮細(xì)胞及不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.5 Detection of PELP1 expression in normal gastric epithelial cells and different gastric cancer cell lines

2.4 沉默PELP1在體外抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲

為確定PELP1的表達(dá)變化對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲等生物學(xué)特征的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了3個(gè)PELP1-siRNA干擾AGS細(xì)胞中PELP1的表達(dá)，其中PELP1-siRNA1干擾效率最高，Western blot和qRT-PCR結(jié)果均顯示PELP1-siRNA1轉(zhuǎn)染可顯著下調(diào)AGS細(xì)胞中PELP1的表達(dá)(圖6)。

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低PELP1表達(dá)的AGS細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組，PELP1-siRNA組)較未轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞(對(duì)照組，PELP1-control組)細(xì)胞增殖明顯減少(P<0.01，圖7)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞占比顯著高于對(duì)照組(P<0.05，圖8)，提示PELP1敲低可阻止細(xì)胞周期從S期進(jìn)展到M期；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組降低(P<0.05，圖9)，提示敲低PELP1表達(dá)后AGS細(xì)胞DNA復(fù)制減緩、增殖活性降低；平板克隆實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)敲低PELP1的表達(dá)抑制AGS細(xì)胞的增殖(圖10)。

A：Western blot檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后PELP1的蛋白表達(dá)；B：qRT-PCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后PELP1 mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組(PELP1-control)比較，**P<0.01圖6 PELP1-siRNA干擾AGS細(xì)胞中PELP1的表達(dá)Fig.6 Expression of PELP1 in AGS cells interfered by PELP1-siRNA

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示敲低PELP1表達(dá)抑制了AGS細(xì)胞的遷移(圖11)；Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)也證明敲低PELP1表達(dá)減弱了AGS細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖12)。

與對(duì)照組(PELP1-control)比較，**P<0.01圖7 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖Fig.7 Detection of cell proliferation by CCK-8

2.5 PELP1靶向Src、PI3K和Erk

利用Biocarta數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)人類(lèi)細(xì)胞中的PELP1通路信息并篩選出Src-Erk通路。通過(guò)siRNA敲降A(chǔ)GS細(xì)胞中PELP1表達(dá)后，采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)Src-Erk通路相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞c-Src和p-Src的蛋白表達(dá)水平降低(圖13A)，c-Src、PI3K和Erk的mRNA表達(dá)水平也較對(duì)照組明顯降低(均P<0.01，圖13B、C、D)。

A：PELP1-siRNA組流式代表圖；B：PELP1-control組流式代表圖；C：細(xì)胞周期各時(shí)期細(xì)胞占比直條圖，與對(duì)照組(PELP1-control)比較，*P<0.05圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期Fig.8 Cell cycle analysis by flow cytometry

A：熒光顯微鏡下代表圖；B：平均熒光強(qiáng)度直條圖，與對(duì)照組(PELP1-control)比較，*P<0.05圖9 EdU細(xì)胞增殖活性測(cè)定Fig.9 Detection of EdU cell proliferation

①接種50個(gè)細(xì)胞；②接種100個(gè)細(xì)胞；③接種200個(gè)細(xì)胞；A：不同接種密度的平板克隆形成情況；B：克隆形成率統(tǒng)計(jì)，與對(duì)照組(PELP1-control)比較，**P<0.01圖10 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)Fig.10 Colony formation assay

A：倒置相差顯微鏡下劃痕典型代表圖(×100)；B：劃痕面積統(tǒng)計(jì)；C：傷口愈合百分比統(tǒng)計(jì)圖11 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)Fig.11 Wound healing assay

與對(duì)照組(PELP1-control)比較，**P<0.01圖12 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲Fig.12 Detection of cell migration and invasion by Transwell assay

A：Western blot檢測(cè)PELP1、c-Src、p-Src-Y529的表達(dá)；B～D：qRT-PCR檢測(cè)c-Src(B)、PI3K(C)和Erk(D)的mRNA表達(dá)圖13 敲降A(chǔ)GS細(xì)胞中PELP1表達(dá)后其下游通路基因的表達(dá)變化Fig.13 Changes of downstream gene expression after knockdown of PELP1 in AGS cells

3 討論

胃癌是在全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[17]。雌激素受體(ERs)是類(lèi)固醇激素受體，研究證實(shí)其可調(diào)節(jié)胃癌的許多生理和病理過(guò)程[18-19]，但是ERs在胃癌進(jìn)展過(guò)程中的確切作用以及胃癌患者中雌激素受體失調(diào)的臨床相關(guān)性尚未完全闡明。在本研究中，我們探討了雌激素共調(diào)節(jié)因子PELP1在胃癌惡性生物學(xué)行為中的作用。我們發(fā)現(xiàn)PELP1在胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用。我們的研究結(jié)果為胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了獨(dú)特的視角[20-22]。

PELP1是一種原癌基因，可作為一種關(guān)鍵的ERα共調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[23-25]。早期研究證實(shí)PELP1在激素依賴性癌癥中過(guò)度表達(dá)，Cortez等[26]利用轉(zhuǎn)基因小鼠在其乳腺中過(guò)表達(dá)PELP1，發(fā)現(xiàn)可激發(fā)體內(nèi)致癌潛力及有助于乳腺癌的進(jìn)展。隨后的研究發(fā)現(xiàn)PELP1致癌信號(hào)傳導(dǎo)涉及多種癌癥的進(jìn)展，包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、唾液腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等[11，15-16，27-32]。新近研究表明，ERs存在于胃腫瘤中，尤其是ERβ[33]。此外，對(duì)1162名侵襲性乳腺癌患者的組織活檢結(jié)果證明PELP1表達(dá)是特異性乳腺癌生存不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，其表達(dá)可用于評(píng)估ESR1陽(yáng)性乳腺癌患者的預(yù)后[34]。PELP1表達(dá)也被證明對(duì)轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌(TNBC)具有診斷價(jià)值，腫瘤中PELP1/ Ki-67雙高表達(dá)是預(yù)測(cè)三陰性乳腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素[15，35]。對(duì)卵巢腫瘤組織陣列芯片的研究表明，PELP1在60%的卵巢腫瘤中過(guò)度表達(dá)2～3倍[29]。PELP1還被認(rèn)為可能在星形細(xì)胞腫瘤的進(jìn)展中起作用，其表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)預(yù)后的生物標(biāo)志物[13]。PELP1也被證實(shí)在非癌癥疾病如小兒哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用[36]。本研究從多個(gè)角度證明了PELP1在胃癌中的致癌作用。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程復(fù)雜，詳細(xì)的分子機(jī)制仍有待闡明[37]。在非基因組途徑中，新出現(xiàn)的證據(jù)表明ERs與幾種途徑中的一些其他信號(hào)分子相互作用，例如PI3K/Akt或絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。ERα和ERβ在基因組和非基因組途徑中發(fā)揮不同的作用，其中ERβ在亞飽和激素水平下作為ERα轉(zhuǎn)錄活性的反式顯性抑制劑/競(jìng)爭(zhēng)劑起作用[38]。此外，最新研究表明，乳腺癌細(xì)胞中的c-Src可作為ERα介導(dǎo)的雙相雌激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑和STAT5/EGFR途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)[39]。據(jù)報(bào)道ERα也可與Src/Shc/EGFR復(fù)合物相互作用[40-41]?？梢?jiàn)c-Src在乳腺癌中的作用方式與ERα陽(yáng)性胃癌相似。

本研究表明，在胃癌細(xì)胞系中沉默PELP1表達(dá)后，其遷移和侵襲性減弱，說(shuō)明PELP1在胃癌的遷移和侵襲中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默PELP1表達(dá)后Src-Erk通路相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)降低，推測(cè)PELP1在胃癌中的作用機(jī)制可能與Src-Erk通路有關(guān)，其具體的分子機(jī)制將是我們下一步的研究方向。