套索肽替代抗生素應(yīng)用的研究進(jìn)展

陳鵬，李守勇

（北京英惠爾生物技術(shù)有限公司，北京100081）

肽類抗生素根據(jù)來(lái)源分為兩類。非核糖體肽抗生素，如短桿菌肽、多粘菌素，桿菌肽和糖肽等，主要由細(xì)菌產(chǎn)生，需經(jīng)過(guò)修飾，經(jīng)過(guò)肽-合成酶的多酶復(fù)合體修飾。但由核糖體合成翻譯后修飾的肽（RiPPs）了解較少[1]。所有生命體（包括細(xì)菌）都可以產(chǎn)生RiPPs，如哺乳動(dòng)物源肽、兩棲動(dòng)物肽、昆蟲源肽、植物源肽和微生物源肽等。RiPPs是宿主天然防御分子的主要組成部分，化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能多樣化，既可抗菌又可鎮(zhèn)痛。目前商業(yè)應(yīng)用包括乳食品防腐劑鏈菌肽（Nisin），獸藥抗菌劑硫代鏈霉菌素（Thiostrepton），ω-芋螺毒素MVIIA（Omega-conotoxin MVIIA，一種合成鎮(zhèn)痛藥）[2-5]。本文重點(diǎn)綜述微生物RiPPs中具有套索結(jié)構(gòu)的套索肽，在天然宿主防御系統(tǒng)（作為天然抗生素）中的作用以及臨床應(yīng)用潛力。

1 結(jié)構(gòu)和分類

1.1 套索肽結(jié)構(gòu)

套索肽是RiPPs中的一個(gè)大家族，化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣。1991年，首次發(fā)現(xiàn)該家族中的第一個(gè)肽anantin[6]。2008年之前，所有套索肽都是在分離活性化合物過(guò)程中發(fā)現(xiàn)。因此，很大程度上具有偶然性[7]。2008年基因組挖掘技術(shù)開始興起，通過(guò)該技術(shù)發(fā)現(xiàn)的套索肽數(shù)量穩(wěn)步增加，capistruin成為第1個(gè)通過(guò)基因組挖掘技術(shù)分離的套索肽[8]。

套索肽通常有14～24個(gè)氨基酸殘基，在N末端胺與7、8或9位置的谷氨酸或天冬氨酸殘基的羧基之間具有特征性的異肽鍵，形成一個(gè)N末端大環(huán)（大內(nèi)酰胺環(huán)）[9]。C末端尾部通過(guò)N端大環(huán)，產(chǎn)生類似套索的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。在某些套索肽中，C末端尾巴大分子量的氨基酸充當(dāng)“立體塞”，被困在環(huán)中，以防止C末端肽脫線。這種套索拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高，對(duì)蛋白酶水解和化學(xué)降解具有抗性。套索肽對(duì)95～120℃高溫也具有抗性[10-11]。熱穩(wěn)定性取決于C末端尾巴的靈活性，大內(nèi)酰胺環(huán)大小以及“立體塞”氨基酸大小和位置[12-13]。

1.2 套索肽分類

套索肽根據(jù)分子內(nèi)二硫鍵的數(shù)量和位置，分為四類。Ⅰ類套索肽包含兩個(gè)二硫鍵，將大環(huán)與穿環(huán)而過(guò)的尾部相連，Ⅱ類沒(méi)有二硫鍵，Ⅲ類和Ⅳ類在不同的結(jié)構(gòu)位置含有一個(gè)二硫鍵。Ⅲ類肽中，二硫鍵連接N端環(huán)和C端尾巴，而Ⅳ類肽，二硫鍵連接C端尾上。截至2017年，根據(jù)現(xiàn)有基因組序列，預(yù)計(jì)96%的套索肽屬于Ⅱ類[14]。套索肽（尤其是Ⅱ類）可以在異源宿主大腸桿菌中表達(dá)。目前還不清楚大腸桿菌異源系統(tǒng)為何有效產(chǎn)生Ⅱ類套索肽。關(guān)于套索肽生產(chǎn)菌株的調(diào)控也了解較少。

1.3 套索肽結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系

近年來(lái)，通過(guò)套索肽的氨基酸組成研究抗菌機(jī)理和其他活性成為熱點(diǎn)[15]，研究capistruin[16]、MccJ25[17-18]、astexins[19]，caulosegnins[20]和xanthomonins[21]幾種套索肽結(jié)構(gòu)與活性間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)幾乎所有套索肽大環(huán)的氨基酸殘基數(shù)量都是8或9個(gè)。因此有人認(rèn)為，帶螺紋的內(nèi)酰胺環(huán)不能由其他數(shù)量構(gòu)成。10個(gè)殘基的環(huán)太大而難以維持空間穩(wěn)定，而7個(gè)殘基的環(huán)太小無(wú)法穿環(huán)。然而xanthomonins I-III在Gly1和Glu7之間形成環(huán)[21]。huascopeptin也是7個(gè)氨基酸殘基環(huán)。

MccJ25是套索肽的典型結(jié)構(gòu)研究模型[22]，不僅是最早發(fā)現(xiàn)的套索肽之一，且是最早鑒定出其生物合成基因簇的肽[23]。MccJ25有21個(gè)氨基酸殘基，殘基Gly1和Glu8形成內(nèi)酰胺鍵，構(gòu)成一個(gè)小圓環(huán)，第9-21個(gè)氨基酸構(gòu)成線性C末端尾巴。β-發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的C末端尾部穿過(guò)環(huán)，形成交錯(cuò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。替換MccJ25的一些氨基酸可以改變其結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的變化直接影響活性。理論上，只有3個(gè)氨基酸，Gly1，Gly2和Glu8不能被取代[24]。MccJ25最強(qiáng)大的活性是抗菌[25]。一種抗菌機(jī)制是MccJ25的Ala3和His5與負(fù)責(zé)細(xì)菌吸收鐵的外膜鐵載體受體FhuA結(jié)合，MccJ25進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，隨后通過(guò)Gly4，Pro7，Tyr9，Phe10，Phe19和Gly21抑制RNA聚合酶[26]。另一個(gè)抗菌機(jī)制是MccJ25參與抑制微生物的膜呼吸鏈[27]，Tyr9被認(rèn)為是關(guān)鍵的功能殘基[28-29]。MccJ25尾部G12，I13或T15的取代將增強(qiáng)其抗菌活性[30]。

套索肽capistruin具有由Gly1和Asp9連接形成的典型內(nèi)酰胺環(huán)[16]。雙重位置突變的變體R15A/F16A和F16A/F18A仍可以形成具有套索結(jié)構(gòu)的成熟captrustrin。用Leu替代Val12和Ile13后，capistruin生成不會(huì)受到影響[16]。但是，用Ala替換Val12和Ile13中任何一個(gè)將不能生成capistruin。這表明形成套索肽可能與氨基酸之間的空間結(jié)構(gòu)和分子間力（氫鍵和范德華力）有關(guān)。當(dāng)Propeptin-2缺少尾巴的最后2個(gè)氨基酸時(shí)，其抗菌活性降低甚至完全喪失[31]。天然套索肽的結(jié)構(gòu)具有很高的特異性和穩(wěn)定性，盡管修飾的套索肽比天然肽具有更脆弱的結(jié)構(gòu)，但提供多功能骨架，可用于許多領(lǐng)域。

套索結(jié)構(gòu)賦予肽對(duì)蛋白酶的耐受性[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，盡管MccJ25的大環(huán)區(qū)域通?？杀坏鞍酌福ㄈ缡葻峋鞍酌福┙佑|，但其環(huán)和尾緊密結(jié)合。即使不再共價(jià)連接，仍保持互鎖，可在液相和氣相中觀察到[32]。還有研究表明，高壓滅菌后，MccJ25仍具有抗菌活性[10]。由于套索肽都具有共同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，因此可預(yù)期套索肽都具有這種特性。但LCMS分析表明，對(duì)花椰菜素Ⅰ和Ⅲ（caulosegnins）熱處理后，在不同的保留時(shí)間出現(xiàn)新的峰，但質(zhì)量不變[20]。這表明一定發(fā)生非化學(xué)轉(zhuǎn)化，從套索到分支環(huán)的解鏈。幾種新的套索肽熱敏感性研究也表明，即使某些肽具有抗高溫變性的能力，但并非適用于每個(gè)套索肽[19,33]。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌紅球菌（Rhodococcus jostii）K01-B0171產(chǎn)生的套索肽lariatins，只能依靠Lys17和Pro18之間的鹽橋結(jié)構(gòu)與靶分子結(jié)合來(lái)防御分枝桿菌[34]。核磁共振和分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，lariatin A的Lys17與MccJ25的His5位于相似的位置，這對(duì)于抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)也是必不可少。

2 套索肽的生物活性

套索肽具有多種生物學(xué)活性，可以作為受體頡頏劑，酶抑制劑，抗腫瘤轉(zhuǎn)移酶和抗菌劑[6,14]。所有已知的套索肽均來(lái)源于變形桿菌或放線菌[35]，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)產(chǎn)生，套索肽作為抗菌分子，讓宿主具有對(duì)抗競(jìng)爭(zhēng)者的優(yōu)勢(shì)。至少14種套索肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性病原體有抗菌活性。通常放線菌（Actinobacteria）和變形桿菌（Proteobacteria）產(chǎn)生的套索肽可以分別抵抗革蘭氏陽(yáng)性菌及其同源菌株[36]。特別是Microbispora sp產(chǎn)生的套索肽propeptin對(duì)革蘭氏陽(yáng)性分枝桿菌（Mycobacterium phlei），革蘭氏陽(yáng)性分枝桿菌（Xan thomonas oryzae）米克氏黃單胞菌和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）均具有抗菌活性。前肽素（propeptin）和阿波霉素（aborycin）對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出抑制作用[37]。在這些抗菌劑中，其生物活性范圍很廣，因?yàn)槟承┨姿麟模ㄈ鏻assomycin和lariatin A/B）僅具有針對(duì)分枝桿菌屬的生物活性，而其他諸如siamycin-I和LP2006則對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌起作用。在質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)MccJ25的基因簇（mcjABCD），通過(guò)異源表達(dá)可以生產(chǎn)，但是MccJ25的抗菌功能僅對(duì)其原產(chǎn)菌株的相關(guān)菌屬（腸桿菌科，例如埃希氏菌，沙門氏菌和志賀氏菌）有效[38]。從伯克霍爾德菌（Burkholderia）共分離出3種套索肽，capistruin[8]來(lái)自B.thailandensis，burhizin來(lái)自B.rhizoxinica，ubonodin[39]來(lái)自B.ubonensis。capistruin對(duì)包括大腸桿菌的一些革蘭氏陰性菌有弱到中等的抑菌活性，ubonodin對(duì)多種致病伯克霍爾德菌有強(qiáng)效的抑菌作用。大多數(shù)套索肽沒(méi)有表現(xiàn)出任何抑菌能力[11,20,40]，套索肽活性總結(jié)見附表。

附表套索肽的抗菌活性

續(xù)表

3 抗菌肽的靶點(diǎn)

部分套索肽的分子靶標(biāo)已經(jīng)確定[41]。MccJ25和capistruin的分子靶點(diǎn)是革蘭氏陰性RNA聚合酶（RNAP）[42]，lassomycin的靶點(diǎn)是結(jié)核分枝桿菌的hsp100家族伴侶ClpC1[43]。其他靶點(diǎn)包括與多種癌癥（如乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和前列腺癌）相關(guān)的內(nèi)皮素B受體和與糖尿病相關(guān)的胰高血糖素受體。另外，套索肽可抑制癌細(xì)胞侵襲人肺細(xì)胞。

3.1 抑制肽聚糖合成

抗生素在細(xì)菌中主要的靶點(diǎn)是其細(xì)胞膜，尤其是肽聚糖。肽聚糖是高度交聯(lián)的聚合物，對(duì)于維持細(xì)胞形狀，細(xì)胞大小和調(diào)節(jié)滲透壓至關(guān)重要。到目前為止，有兩種套索肽抑制肽聚糖的合成：siamycin-I和streptomonomicin。

3.2 抑制RNA合成

目前，已知的套索肽中有50%以上可以抑制細(xì)菌RNA聚合酶（RNAP）。研究最深入的模型套索肽是MccJ25，它是首次發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌RNAP的肽型抑制劑。后來(lái)發(fā)現(xiàn)capistruin、acinetodin、klebsidin和citrocin[44]也可以抑制細(xì)菌RNAP。

3.3 抑制ClpC1P1P2蛋白酶

套索肽的最后一個(gè)靶點(diǎn)是結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）的ATP依賴性蛋白酶復(fù)合物ClpC1P1P2。Lassomycin是一個(gè)16氨基酸殘基的多肽，對(duì)各種結(jié)核分枝桿菌菌株，MIC測(cè)定范圍為0.8～3μg·mL-1。

4 替抗應(yīng)用

關(guān)于套索肽在動(dòng)物上應(yīng)用的報(bào)道不多，很重要的一個(gè)原因是工業(yè)化表達(dá)量都比較低，在動(dòng)物上的應(yīng)用成本高。在所有套索肽中，MccJ25的應(yīng)用研究相對(duì)比較系統(tǒng)。日糧添加MccJ25可提高斷奶仔豬和肉雞的生長(zhǎng)性能，減緩腹瀉和系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生，提高腸道屏障功能，改善糞便微生態(tài)組成[45-46]。通過(guò)小鼠模型在MccJ25添加量的研究中，發(fā)現(xiàn)中劑量添加有正向的效果，高劑量添加有毒性風(fēng)險(xiǎn)[47]。重組MccJ25可能作為農(nóng)業(yè)，動(dòng)物生產(chǎn)和食品業(yè)消減和預(yù)防大腸桿菌和沙門氏菌的有效辦法。

5 展望

套索肽由于其獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和新穎的抑菌機(jī)制而成為一類有前景的抗菌物質(zhì)。各類細(xì)菌都可以產(chǎn)生套索肽，即使研究多年的細(xì)菌中也還有很多未被識(shí)別的套索肽生物合成基因。盡管僅確認(rèn)了部分少量的套索肽，但拓寬了抑菌靶點(diǎn)的多樣性。對(duì)套索肽種類的進(jìn)一步的探索必將增加抑菌靶點(diǎn)的多樣性，為規(guī)避抗菌素耐藥性提供新的方法。最后，套索肽的蛋白原性讓套索肽比其他任何抗生素適合生物工程改造。當(dāng)前，重新設(shè)計(jì)套索肽及其核心序列的生物合成工作有助于理解殘基在生物活性和生物合成中的重要性。對(duì)這些化合物的進(jìn)一步研究有可能解決產(chǎn)量問(wèn)題，并增加多樣性。