噻蟲嗪對鯽魚的急性毒性和抗氧化酶及乙酰膽堿酯酶活性的影響

王 召，彭 舒，孟立霞

( 1.凱里學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011； 2.貴州大學(xué) 昆蟲研究所，貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025 )

現(xiàn)代化工業(yè)技術(shù)發(fā)展的一個重要標(biāo)志是大量化學(xué)合成物質(zhì)的使用，但這些化學(xué)物質(zhì)在給人類社會生活帶來進步和好處的同時也給環(huán)境造成了嚴(yán)重的負(fù)面壓力。目前我國使用的農(nóng)藥中70%是殺蟲劑，年使用量達(dá)1.015×106t，僅有約1/3能被作物吸收，其余一部分通過地表徑流、降雨等途徑進入河流及海岸河口區(qū)域水體，成為水體中常規(guī)理化監(jiān)測手段難以檢測到的痕量有毒有機污染物[1-2]。水體的農(nóng)藥污染不僅危及水生生物安全，導(dǎo)致生態(tài)平衡被破壞，還可在生物體內(nèi)富集積累[3]。目前，關(guān)于農(nóng)藥對水生生物如魚類的研究主要集中在急性毒性及對不同組織酶活性的影響。如三唑酮對斑馬魚(Daniorerio)和稀有鯽(Gobiocyprisrarus)不同發(fā)育階段的毒性效應(yīng)大小不一致，表現(xiàn)為成魚個體對三唑酮更為敏感[4]。王召等[5]測定了7種稻田常用殺蟲劑對鯽魚幼魚的急性毒性，其中溴氰菊酯對其毒性最大。于振海等[6]研究了4種常用漁藥對大鱗鲃(Barbuscapito)的急性毒性，其中毒性最大的為敵百蟲。陳家長等[7]以不同質(zhì)量濃度阿維菌素長期暴露鯉魚(Cyprinuscarpio)后，5.6、7.5 μg/L質(zhì)量濃度組的超氧化物歧化酶活性先升后降，而10、18 μg/L質(zhì)量濃度組的超氧化物歧化酶活性逐漸下降。以氯蟲苯甲酰胺(1/20半致死質(zhì)量濃度)暴露南亞野鯪(Labeorohita)，其鰓、肝臟、腎臟和肌肉4種組織中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性均顯著被誘導(dǎo)[8]；甲基對硫磷和毒死蜱(1/4、1/8、1/10半致死質(zhì)量濃度)處理孔雀魚(Poeciliareticulata)，其腦、鰓和肝臟中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性均上升[9]。

噻蟲嗪是第2代新煙堿類高效、低毒殺蟲劑，不僅具有獨特的作用機制，而且具有觸殺、胃毒、內(nèi)吸活性，對防治刺吸式口器的害蟲效果甚佳[10-11]。稻田養(yǎng)魚作為一種傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)耕作模式，它既可以提高水稻栽培產(chǎn)量，又可以獲得最大的農(nóng)田生態(tài)經(jīng)濟效益。然而，在水稻種植期，常會遭受如白背飛虱(Sogatellafurcifera)、褐飛虱(Nilaparvatalugens)、稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)等多種害蟲的危害，噴施化學(xué)殺蟲劑仍然作為防治水稻害蟲的首選。此時，稻田內(nèi)共養(yǎng)魚類也必然因化學(xué)農(nóng)藥施用而受到影響，但目前關(guān)于噻蟲嗪對魚類影響的研究相對滯后，而噻蟲嗪對魚類生理生化方面的研究更是鮮見報道[12-14]。筆者以鯽魚(Carassiusauratus)幼魚為試驗對象，先測定噻蟲嗪對其的急性毒性，確定半致死質(zhì)量濃度，然后以亞致死質(zhì)量濃度噻蟲嗪暴露鯽魚幼魚，研究噻蟲嗪對其鰓、肝臟和腦中抗氧化酶及乙酰膽堿酯酶活性的影響，以期從生理生化方面探究噻蟲嗪對魚體的影響，為評價噻蟲嗪的生態(tài)安全性提供參考資料，同時為該農(nóng)藥的合理使用提供一些借鑒依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗魚類

試驗用鯽魚幼魚，購自貴州大學(xué)農(nóng)場水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，平均體長為(11.48±0.79) cm，平均體質(zhì)量為(19.81±2.40) g。試驗前將購置的試驗用魚在實驗室內(nèi)馴養(yǎng)7 d以上，自然死亡率低于2%，馴養(yǎng)期間定時投放餌料。試驗用水為充分曝氣7 d的自來水，pH 7.0±0.5，馴養(yǎng)及試驗期間不斷充氧，溶解氧保持在(5±1) mg/L，試驗水溫(24±1) ℃。試驗時，選取大小一致、健康、表皮無損傷的個體進行試驗。

1.1.2 試驗試劑及來源

96%噻蟲嗪原藥(南京盼豐化工有限公司)；超氧化物歧化酶試劑盒、過氧化氫酶試劑盒、乙酰膽堿酯酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)總蛋白試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)蛋白均購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 噻蟲嗪對鯽魚幼魚的急性毒性試驗

參照文獻(xiàn)[15]報道的半靜態(tài)急性毒性試驗方法。用丙酮將噻蟲嗪稀釋成一定質(zhì)量濃度的母液，再根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，稀釋成5個試驗質(zhì)量濃度：24.35、28.73、33.90、40.00、47.20 mg/L；以丙酮作為對照。在預(yù)處理過的水族箱中分別配制上述質(zhì)量濃度藥液10 L，并隨機投放試驗魚10尾，每個質(zhì)量濃度5個平行。為確保藥液質(zhì)量濃度基本一致，試驗每隔12 h換取藥液1次，其他條件與馴養(yǎng)期間相同。處理24、48、72、96 h后統(tǒng)計各處理組試驗魚的死亡數(shù)，以玻璃棒輕輕觸碰魚體，無任何反應(yīng)即視為死亡，并立即取出。

1.2.2 噻蟲嗪對鯽魚幼魚組織酶活性影響試驗

魚類的染毒處理：根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，采用1/2 96 h半致死質(zhì)量濃度以下質(zhì)量濃度為試驗質(zhì)量濃度(1、10 mg/L)；以丙酮作為對照。在處理過的塑料方盆中分別配置上述質(zhì)量濃度藥液10 L，并隨機投放魚苗15尾，每處理設(shè)3個平行。試驗條件同上。

組織樣的處理：分別在染毒12、24、48、72、96 h后，從各處理組隨機取樣，每個平行取2尾。將取出的魚用蒸餾水沖洗后，放入冰盤內(nèi)解剖，分別取出鰓、腦和肝臟，用預(yù)冷的0.86%生理鹽水清洗血液，再用濾紙拭干后稱量質(zhì)量，放入玻璃勻漿器中，按1∶9(g/mL)的比例加入生理鹽水，在冰水浴條件下充分研磨，制備成10%的組織勻漿，4 ℃，3000 r/min離心10 min，取上清液進行酶活性測定。

超氧化物歧化酶活性單位定義：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的超氧化物歧化酶量為1個酶活性單位；過氧化氫酶活性單位定義：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的過氧化氫的量為1個酶活性單位；乙酰膽堿酯酶活性單位定義：每毫克組織蛋白在37 ℃保溫6 min，水解反應(yīng)體系中1 μmol/L基質(zhì)為1個酶活性單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，擬合毒力回歸方程，并計算相關(guān)系數(shù)、半致死質(zhì)量濃度及其95%置信區(qū)間。采用單因素方差分析進行差異性顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噻蟲嗪對鯽魚幼魚的急性毒性

噻蟲嗪對鯽魚幼魚的急性毒性測定結(jié)果見表1。由表1可知，鯽魚幼魚對噻蟲嗪敏感，隨著處理時間的延長，半致死質(zhì)量濃度值呈減小趨勢。噻蟲嗪處理96 h時，半致死質(zhì)量濃度值趨于平緩，為28.95 mg/L。根據(jù)我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》的判定標(biāo)準(zhǔn)，噻蟲嗪對鯽魚幼魚的毒性為低毒。

2.2 噻蟲嗪脅迫對鯽魚幼魚肝臟和鰓超氧化物歧化酶活性的影響

低質(zhì)量濃度(1 mg/L)和高質(zhì)量濃度(10 mg/L)噻蟲嗪處理鯽魚幼魚后，肝臟超氧化物歧化酶活性在12～96 h內(nèi)呈先升后降的趨勢(圖1a)。當(dāng)噻蟲嗪質(zhì)量濃度為1 mg/L時，在染毒12 h后，酶活性不斷上升，24 h達(dá)到最大值[(54.96±0.92) U/mg](P<0.05)；隨著處理時間的延長，酶活性呈下降趨勢，但總體上均高于對照，表明低質(zhì)量濃度的噻蟲嗪對肝臟超氧化物歧化酶活性具有一定的誘導(dǎo)作用。而10 mg/L質(zhì)量濃度組在染毒12 h時，酶活性稍有升高，與對照組無顯著性差異(P>0.05)；隨著暴露時間的延長，酶活性逐漸受到抑制，72 h活性值達(dá)到最低值，僅為對照組的54.73%(P<0.05)。

表1 噻蟲嗪對鯽魚幼魚的急性毒性Tab.1 Acute toxicity of thiamethoxam to juvenile crucian carp C. auratus

不同質(zhì)量濃度噻蟲嗪處理鯽魚幼魚后，鰓組織中超氧化物歧化酶活性變化趨勢與肝臟組織相似(圖1b)。低質(zhì)量濃度組(1 mg/L)處理后，酶活性逐漸升高，表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)作用，48 h達(dá)到最高值[(31.73±0.54) U/mg](P<0.05)，此后，超氧化物歧化酶活性緩慢下降，96 h時基本恢復(fù)到正常水平，與對照組無顯著性差異(P>0.05)。高質(zhì)量濃度組(10 mg/L)在暴露24 h時鰓組織超氧化物歧化酶活性達(dá)到最高值，與對照組相比上升幅度為30.42%(P<0.05)，隨后逐漸下降。

圖1 噻蟲嗪脅迫對鯽魚幼魚不同組織超氧化物歧化酶活性的影響Fig.1 Effects of thiamethoxam on the superoxide dismutase activity in different tissues of juvenile crucian carp C. auratus a.肝臟； b.鰓;不同字母表示各處理組同一時間段上差異顯著(P<0.05)；下同.a.liver; b.gill; different letters indicate significant difference at the same time period at P<0.05; et sequentia.

2.3 噻蟲嗪脅迫對鯽魚幼魚肝臟和鰓過氧化氫酶活性的影響

不同質(zhì)量濃度噻蟲嗪處理鯽魚幼魚后，在96 h內(nèi)肝臟組織中過氧化氫酶活性均表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制(圖2a)。其中，低質(zhì)量濃度組(1 mg/L)在受試的12～48 h，酶活性呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，分別比對照組高出14.20%、26.98%和27.66%(P<0.05)；此后酶活性呈降低趨勢，96 h活性值顯著低于對照組(P<0.05)。而高質(zhì)量濃度組(10 mg/L)自受試后迅速升高，12 h酶活性顯著上升，與對照組相比上升了28.07%(P<0.05)；隨著暴露時間的增加，酶活性逐漸下降，在48 h活力值明顯低于對照組(P<0.05)。

在不同質(zhì)量濃度噻蟲嗪作用下，鯽魚幼魚鰓組織過氧化氫酶活性變化趨勢與肝臟相似(圖2b)。其中，低質(zhì)量濃度組(1 mg/L)過氧化氫酶活性首先表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)，在處理12 h和24 h時分別較對照組升高24.75%和34.00%(P<0.05)；隨著處理時間的延長，酶活性受到不同程度的抑制。而高質(zhì)量濃度組(10 mg/L)暴露12 h時，酶活性表現(xiàn)出略微的誘導(dǎo)作用，隨著脅迫時間的延長酶活性顯著被抑制(P<0.05)。

2.4 噻蟲嗪脅迫對鯽魚幼魚腦組織乙酰膽堿酯酶活性的影響

噻蟲嗪脅迫對鯽魚幼魚腦乙酰膽堿酯酶活性的影響見圖3。不同質(zhì)量濃度噻蟲嗪脅迫對乙酰膽堿酯酶活性的影響在不同處理時間的表現(xiàn)各不相同，但變化的總體趨勢均表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制。其中，低質(zhì)量濃度組(1 mg/L)在處理24 h和48 h時，酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)作用；隨著處理時間的增加，在處理72 h和96 h時，酶活性明顯降低，表現(xiàn)出抑制作用(P<0.05)。高質(zhì)量濃度組(10 mg/L)在處理12 h時，酶活性即明顯升高，與對照組差異顯著(P<0.05)；隨后逐漸降低，72 h時酶活性即被顯著抑制(P<0.05)。

圖2 噻蟲嗪脅迫對鯽魚幼魚不同組織過氧化氫酶活性的影響Fig.2 Effects of thiamethoxam on the catalase activity in different tissues of juvenile crucian carp C. auratus

圖3 噻蟲嗪脅迫對鯽魚幼魚腦組織乙酰膽堿酯酶活性的影響Fig.3 Effects of thiamethoxam on acetylcholinesterase activity in brain of juvenile crucian carp C. auratus

3 討 論

3.1 噻蟲嗪對鯽魚幼魚的毒力

急性毒性試驗即單次給藥毒性試驗，指機體(人或試驗動物)一次(或24 h內(nèi)多次)接觸外來化合物之后所引起的中毒效應(yīng)，甚至死亡[16-18]。急性毒性試驗是推測新農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物的毒性強弱的重要手段。因此，急性毒性試驗對了解農(nóng)藥的安全性非常必要。噻蟲嗪對鯽魚幼魚的急性毒性試驗結(jié)果表明，鯽魚幼魚對噻蟲嗪敏感，隨著處理時間的延長，半致死質(zhì)量濃度值呈減小趨勢。噻蟲嗪處理96 h時，半致死質(zhì)量濃度值趨于平緩，為28.95 mg/L。根據(jù)國家質(zhì)量監(jiān)督及檢驗檢疫總局發(fā)布的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[19]中農(nóng)藥對魚類的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，噻蟲嗪對鯽魚幼魚的毒性為低毒。

3.2 噻蟲嗪對鯽魚幼魚抗氧化能力指標(biāo)的影響

在正常情況下，生物體內(nèi)各種生理活動能夠有序進行。然而，當(dāng)生物體受到外源性污染物脅迫時，會導(dǎo)致大量活性氧的產(chǎn)生，這些活性氧可能引起細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化、引起超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等抗氧化酶活性的改變，從而使生物體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[20-21]。超氧化物歧化酶是水生生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，其基本功能是催化超氧離子與氫離子生成過氧化氫，從而清除體內(nèi)過高含量的超氧離子。已有研究表明，當(dāng)魚體處于輕度污染的環(huán)境中時，超氧化物歧化酶活性通常被誘導(dǎo)；而處于重度污染條件下，超氧化物歧化酶活性則被抑制，致使魚體內(nèi)活性氧大量積累，從而引起機體受到損傷[22]。本試驗結(jié)果表明，在低質(zhì)量濃度(1 mg/L)處理時，肝臟和鰓組織超氧化物歧化酶活性在測試初期即顯著上升(P<0.05)，說明超氧化物歧化酶在抵御低質(zhì)量濃度噻蟲嗪脅迫時發(fā)揮了重要作用，而隨著暴露時間的延長和藥劑質(zhì)量濃度的增加，其活性逐漸被抑制。張景飛等[23]在研究20號柴油低質(zhì)量濃度暴露對鯽魚肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響時發(fā)現(xiàn)，0.005 mg/L油污暴露能顯著誘導(dǎo)超氧化物歧化酶活性，但隨著污染暴露質(zhì)量濃度的增加，超氧化物歧化酶活性又被抑制；此外，在2-硝基-4-羥基二苯胺脅迫對鯽魚[24]肝臟抗氧化指標(biāo)的影響及氨氮對異育銀鯽(C.auratusgibelio)[25]“中科3號”幼魚肝臟抗氧化酶系統(tǒng)的影響研究中，也均證實了上述觀點。

過氧化氫酶也是水生生物體內(nèi)參與活性氧代謝的一種非常重要的抗氧化防御酶，它能夠催化超氧化物歧化酶歧化超氧離子產(chǎn)生的過氧化氫，生成水和氧氣，從而減輕活性氧自由基對生物體的損傷[26-27]。本試驗結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度噻蟲嗪對鯽魚幼魚組織過氧化氫酶活性均產(chǎn)生顯著影響，兩個質(zhì)量濃度組鯽魚幼魚肝臟和鰓組織過氧化氫酶活性在暴露初期即顯著上升(P<0.05)，推測其原因可能是由于噻蟲嗪暴露引起魚體內(nèi)活性氧自由基大量產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)過氧化氫酶活性增強以清除魚體中過量的活性氧自由基。但隨著暴露時間的延長和藥劑質(zhì)量濃度的增加，過氧化氫酶活性呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，這表明過氧化氫酶作為機體中抗氧化防御酶，其功能的有效性只局限于一定的范圍內(nèi)，一旦超出“毒物興奮效應(yīng)”期后，其功能也勢必受到影響，這與用除草劑阿特拉津暴露鯽魚時其肝臟、腎臟和肌肉組織過氧化氫酶活性先升后降的變化趨勢相同[28]。

3.3 對魚類腦組織乙酰膽堿酯酶的影響

乙酰膽堿酯酶廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物體內(nèi)，它是保證生物神經(jīng)信號正常傳遞的一種關(guān)鍵酶，主要存在于膽堿能神經(jīng)末梢突觸間隙，可快速降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，終止其對乙酰膽堿受體的興奮作用，以保持神經(jīng)傳導(dǎo)的正常進行[29]。目前，乙酰膽堿酯酶已被公認(rèn)為是檢測有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑污染的理想生物標(biāo)志物[30-31]，然而，亦有研究報道其他一些無機或有機污染物也可引起乙酰膽堿酯酶活性的變化。王學(xué)峰等[20]研究表明，汞離子質(zhì)量濃度為0.005、0.025 mg/L時，暴露12 h，紅鰭笛鯛(Lutjanuserythropterus)腦組織乙酰膽堿酯酶活性顯著增加，隨著暴露時間的延長(24～96 h)，其活性受到不同程度的抑制。王麗等[21]研究高效氯氰菊酯對斑馬魚不同組織乙酰膽堿酯酶活性的影響時發(fā)現(xiàn)，一定質(zhì)量濃度的高效氯氰菊酯會誘導(dǎo)乙酰膽堿酯酶活性，而高質(zhì)量濃度即表現(xiàn)出抑制作用。本試驗結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度(1 mg/L)的噻嗪酮暴露24 h后即可誘導(dǎo)腦乙酰膽堿酯酶活性顯著升高，而高質(zhì)量濃度(10 mg/L)暴露12 h后即表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)作用，隨著暴露時間的延長，誘導(dǎo)作用逐漸被抑制作用所取代，這種作用勢必會干擾乙酰膽堿的降解速度，使乙酰膽堿與其受體的作用無法正常終止，從而導(dǎo)致鯽魚幼魚長期保持興奮狀態(tài)[32]。

4 結(jié) 論

(1)本試驗結(jié)果表明，噻蟲嗪對鯽魚幼魚的96 h半致死質(zhì)量濃度為28.95 mg/L。根據(jù)農(nóng)藥對魚類的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，噻蟲嗪對鯽魚幼魚的毒性為低毒。

(2)在噻蟲嗪脅迫下，魚體超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶活性發(fā)生了較低變化，表明噻蟲嗪脅迫可引起鯽魚幼魚抗氧化防御系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂，從而影響魚類的正常生長發(fā)育。