乳腺癌術(shù)后輔助化療對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞影響的觀察研究

孫曉瑩 馬飛 田朋飛 李曉爽 朱愛華 王津京

【摘要】 目的：本研究旨在觀察乳腺癌術(shù)后輔助化療后外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率及含量的變化，評(píng)價(jià)術(shù)后輔助化療的有效性。方法：選取2015年11月-2016年8月本院收治的10例擬行術(shù)后輔助化療的乳腺癌患者，分別于輔助化療前后采集外周靜脈血3～5 ml，通過免疫磁珠法及免疫熒光顯色法檢測(cè)樣品中循環(huán)腫瘤細(xì)胞，對(duì)比分析化療前后CTCs的檢出率、含量及變化趨勢(shì)。結(jié)果：術(shù)后輔助化療前后CTCs的檢出率分別為80%（8/10）、60%（6/10），平均CTCs含量分別為2.1（1.5，3.25）ml和0.7（0.0，1.0）ml，輔助化療后外周靜脈血中CTCs的含量較化療前有減少趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）。結(jié)論：乳腺癌術(shù)后輔助化療可減少患者外周血CTCs的含量。乳腺癌患者術(shù)后輔助化療前后外周血CTCs含量檢測(cè)結(jié)果對(duì)預(yù)測(cè)、評(píng)估近期治療療效重要指導(dǎo)價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌 循環(huán)腫瘤細(xì)胞 輔助化療

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.26.005 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2020）26-00-04

The Value of Adjuvant Chemotherapy for Postoperative Breast Cancer on Circulating Tumor Cells/SUN Xiaoying， MA Fei， TIAN Pengfei， LI Xiaoshuang， ZHU Aihua， WANG Jinjing. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（26）： -17

[Abstract] Objective： To analyse the changes in the content of circulating tumor cells in peripheral blood after adjuvant chemotherapy for postoperative breast cancer and to evaluate the effectiveness of chemotherapy. Method： Ten cases of postoperative breast cancer patients accepted adjuvant chemotherapy was collected from November 2015 to August 2016 in our hospital. Peripheral venous blood was taken before and after adjuvant chemotherapy. Contents of circulating tumor cells in the sample was detected by immunofluorescent staining. The detection rate and change trend of CTCs before and after chemotherapy were compared and analyzed. Result： Rates of CTCs detection before and after adjuvant chemotherapy were 80% （8/10） and 60% （6/10）， and the average numbers of CTCs were 2.1 （1.5， 3.25） ml and 0.7 （0.0， 1.0） ml respectively. The contents of CTCs detected in peripheral venous blood after adjuvant chemotherapy decreased compared with that before chemotherapy， and the difference was statistically significant （P=0.026）. Conclusion： Adjuvant chemotherapy can reduce the number of CTCs in peripheral blood of patients with postoperative breast cancer. Meanwhile content numbers of peripheral blood CTCs before and after adjuvant chemotherapy in breast cancer patients are valuable in predicting and evaluating adjuvant therapeutic efficacy.

[Key words] Breast cancer Circulating tumor cells Adjuvant chemotherapy

First-authors address： Beijing Chaoyang District Huanxing Cancer Hospital， Beijing 100021， China

乳腺癌是發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤，隨著手術(shù)、化療、放療等治療手段的綜合應(yīng)用，其治愈率有了很大的提高，但仍有20%～30%乳腺癌會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致患者死亡[1-2]。腫瘤細(xì)胞可直接或經(jīng)淋巴途徑間接進(jìn)入血液系統(tǒng)，進(jìn)而在遠(yuǎn)處組織器官定植形成轉(zhuǎn)移灶，這部分來自腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶播散進(jìn)入血液的腫瘤細(xì)胞被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）。CTCs的出現(xiàn)被認(rèn)為可能是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一種標(biāo)志，與乳腺癌臨床預(yù)后有密切關(guān)系[3-6]。而且，CTCs的檢測(cè)作為液體活檢的一種重要方式，具有創(chuàng)傷小、可連續(xù)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展。目前諸多關(guān)于CTCs的研究更著重于癌癥的早診早篩、評(píng)估預(yù)后、早期發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移及指導(dǎo)晚期腫瘤個(gè)體化治療等。但對(duì)于早期手術(shù)及輔助治療的乳腺癌患者，缺乏評(píng)價(jià)輔助治療效果的腫瘤標(biāo)記物。本研究通過對(duì)乳腺癌患者術(shù)后輔助化療前后血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞含量的檢測(cè)，探討CTCs動(dòng)態(tài)變化與輔助化療效果的關(guān)系及對(duì)乳腺癌患者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年11月-2016年8月中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院桓興病區(qū)腫瘤內(nèi)科收治的乳腺癌患者10例，均已接受手術(shù)治療，擬行術(shù)后輔助化療。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次行手術(shù)切除治療，經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為浸潤(rùn)性乳腺癌;（2）臨床病理資料完整;（3）未接受任何輔助治療;（4）HER2基因均為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;（2）妊娠期;（3）合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤;（4）合并嚴(yán)重心肺疾病;（5）依從性差，不能按方案輔助化療。患者年齡33～52歲，平均41.1歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

本研究患者接受表柔比星+環(huán)磷酰胺，序貫紫杉醇的密集化療方案（1例多西他賽+卡鉑化療方案化療）。術(shù)后腫瘤組織雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及Ki-67的表達(dá)情況采用免疫組化SP法檢測(cè);人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）采用免疫組織化學(xué)法（IHC）及原位熒光雜交技術(shù)（FISH）檢測(cè)。根據(jù)美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)和美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)公布的乳腺癌指南評(píng)估ER/PR/HER2表達(dá)狀況。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Commission on Cancer，AJCC）2018年第8版乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。

使用EDTA抗凝采血管分別于輔助化療前后采集患者3～5 ml外周血，留取2 ml有效血液樣本。本檢測(cè)針對(duì)外周血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）測(cè)試流程如下：將特異性識(shí)別CTC表面的上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）的多肽修飾的磁性納米顆粒與血液樣品混合，利用磁力捕獲血液中的CTC，用4%的多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞，然后通過免疫熒光染色方法對(duì)捕獲的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。免疫熒光染色為三色標(biāo)記法，分別為細(xì)胞核染色劑（DAPI）、上皮細(xì)胞標(biāo)記物細(xì)胞角蛋白（CK）的抗體，以及白細(xì)胞抗原（CD45）的抗體。

DAPI可透過細(xì)胞膜對(duì)DNA染色，它在嵌入雙鏈DNA后發(fā)出藍(lán)色熒光;異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的CK抗體與上皮來源的腫瘤細(xì)胞表面的CK抗原結(jié)合，發(fā)出525 nm波長(zhǎng)的綠色熒光;藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的人CD45抗體與血液中白細(xì)胞表面的CD45抗原結(jié)合，發(fā)出578 nm波長(zhǎng)的紅色熒光。于多肽修飾的磁性納米顆粒富集到的所有細(xì)胞進(jìn)行三色染色，其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞指認(rèn)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞，見圖1。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)輔助化療前后兩組患者CTCs的陽性率（以不同CTCs組相應(yīng)CTCs≥1個(gè)為陽性）及各組患者輔助化療前后CTCs（DAPI+/CK+/CD45-）陽性值，來表示外周血腫瘤細(xì)胞含量。通過檢測(cè)患者外周血CTCs，分別比較化療前后CTCs陽性率與腫瘤大小、脈管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、激素受體的差異，分析CTCs陽性與臨床病理特征的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。應(yīng)用偏度和峰度檢驗(yàn)對(duì)化療前后外周血CTCs含量進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，在α=0.05的檢驗(yàn)水平下，本研究數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，以M（P25，P75）表示，采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用字2檢驗(yàn)，在適當(dāng)?shù)那闆r下采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行研究。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后輔助化療前后CTCs陽性的單因素分析

乳腺癌患者輔助化療前后外周血CTCs與其病理特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），乳腺癌輔助化療前后外周血CTCs含量與病理特征無明確相關(guān)性，見表1。

2.2 輔助化療前后患者CTCs含量比較

近些年有關(guān)CTCs研究納入的病例數(shù)從十幾例到幾百例不等[7-9]。本研究輔助化療前循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率（CTCs≥1個(gè)）為80%（8/10），平均循環(huán)腫瘤細(xì)胞含量為2.1（1.5，3.25）ml;輔助化療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率為60%（6/10），平均循環(huán)腫瘤細(xì)胞含量為0.7（0.0，1.0）ml，明顯低于化療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

乳腺癌是一種全身性疾病，30%～40%的初治乳腺癌患者骨髓、靜脈血和常規(guī)病理檢查區(qū)域淋巴結(jié)存在著微轉(zhuǎn)移，提示微轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因[10]。經(jīng)手術(shù)切除后的乳腺癌患者血液中仍可檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，可能手術(shù)會(huì)增加腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血液的風(fēng)險(xiǎn)[9，11-12]，本研究中80%患者手術(shù)切除腫瘤后輔助化療前檢測(cè)血液循環(huán)中檢測(cè)到CTCs，輔助化療后CTCs的檢出率降低至60%。比較患者術(shù)后輔助化療前后血中CTCs數(shù)目，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）。

血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞一般是指進(jìn)入機(jī)體循環(huán)血液中的實(shí)體腫瘤細(xì)胞，能夠真實(shí)反映腫瘤負(fù)荷和具有發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶的潛力。CTCs在確定診斷、治療決策和監(jiān)測(cè)治療效果中有很重要的作用。研究表明，CTCs的存在對(duì)于乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存都是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)[13-15]。CTCs實(shí)時(shí)檢測(cè)已被廣泛用于評(píng)價(jià)乳腺癌的新輔助化療、放療、維持化療等治療手段的有效性，除乳腺癌外，其應(yīng)用價(jià)值同樣在結(jié)直腸癌、前列腺癌及非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中被證實(shí)[16-18]。本研究中觀察到術(shù)后輔助化療可減少外周血CTCs檢出率和含量，提示了化療的有效性。

與此同時(shí)，有研究認(rèn)為CTCs作為對(duì)化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)，其表型也常隨藥物治療、疾病進(jìn)程等變化[19-20]。CTCs是一類異質(zhì)性很強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞，其中一些為腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs），另一些被認(rèn)為是上皮間變細(xì)胞（epithelial-mesenchymal transition，EMT），但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞不具有上述特征，相關(guān)研究認(rèn)為CSCs和EMT狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療具有抵抗性，是腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的原因[21-22]。因此，CTCs的檢測(cè)需要根據(jù)腫瘤細(xì)胞生物特性進(jìn)行分類，從而更精準(zhǔn)高效的預(yù)測(cè)、評(píng)估腫瘤治療療效及預(yù)后。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示通過術(shù)后輔助化療，患者外周血CTCs檢出率和單位體積的含量減少，初步提示CTCs狀態(tài)的變化與化療效果有一定的關(guān)系。限于本研究納入研究對(duì)象少，因此CTCs在術(shù)后輔助化療效果評(píng)估中的作用價(jià)值仍需大樣本、多中心臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。作為一種新的實(shí)時(shí)便捷、創(chuàng)傷小的檢測(cè)手段，CTCs檢測(cè)具有很大的潛力來改變目前癌癥檢測(cè)的現(xiàn)狀。然而，CTCs的臨床應(yīng)用還處于起步階段，存在著諸多問題亟待解決。通過對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞生物特性進(jìn)一步的分類研究和完善CTCs檢測(cè)方法，最終使腫瘤患者獲益。

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（收稿日期：2020-06-08） （本文編輯：何玉勤）