底圩茶多糖的超聲波輔助提取及其抗氧化活性

陳紅惠,牛念拉姆

(文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院,云南文山 663099)

底圩茶是云南省特有的歷史名茶之一,其茶味絕美,種植歷史悠久,因其產(chǎn)于廣南底圩鄉(xiāng)而得名。優(yōu)良的茶樹品種和得天獨(dú)厚的氣候環(huán)境使底圩茶形成了獨(dú)特的品質(zhì),底圩茶用于制作綠茶,其茶湯色澤鮮綠,味鮮回甘,此外還有紅茶、白茶、黃茶等多個(gè)品種,市場(chǎng)知名度高,同時(shí)底圩茶也是制取普洱茶的主要原料[1]。深入開發(fā)底圩茶產(chǎn)品,對(duì)于提高產(chǎn)品附加值具有重要意義。

底圩茶除了含有常見的茶多酚、咖啡堿等成分外,還含有大量的多糖活性物質(zhì)[2]?，F(xiàn)代研究表明,多糖能顯著降低血糖,防治糖尿病,還具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等功效[3]。近年來(lái),植物源性生物活性化合物及其提取物作為促進(jìn)人體健康的營(yíng)養(yǎng)保健品的需求和應(yīng)用日益增加[4],因此,從植物中提取多糖越來(lái)越受到人們的重視。由于多糖具有良好水溶性,其提取方法多采用熱水提取,但該方法存在耗時(shí)、能耗大、得率低等缺點(diǎn)。近年來(lái),具有提取時(shí)間短、溶劑環(huán)保、產(chǎn)品回收率高、成本低的綠色提取技術(shù)已成為提取研究熱點(diǎn)和方向。超聲波提取法以聲波產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)、空穴效應(yīng)破壞植物原料,可有效提高溶劑萃取率,已被廣泛應(yīng)用,但超聲波法在底圩茶多糖提取及抗氧化性研究未見報(bào)道[5]。本研究以廣南底圩茶為對(duì)象,探討超聲波輔助技術(shù)提取底圩茶的相關(guān)因素與得率的關(guān)系,利用正交試驗(yàn)確定底圩茶多糖超聲波輔助提取的最優(yōu)條件,并研究了底圩茶多糖抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

底圩茶 產(chǎn)于云南省廣南縣底圩鄉(xiāng);葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%) 北京中科儀友化工技術(shù)研究院;2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(純度>98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(純度>98%)、Tris、蒽酮、硫酸、鹽酸、無(wú)水乙醇、抗壞血酸、水楊酸、鄰苯三酚、過(guò)氧化氫、過(guò)硫酸鉀、三氯甲烷(分析純) 南京化學(xué)試劑有限公司。

FRQ-1008HT型超聲波清洗器 杭州法蘭特超聲波科技有限公司;RE-2000E(2L)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 南通普瑞科技儀器有限公司;FC-18A真空冷凍干燥機(jī) 河北國(guó)輝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LB-721可見分光光度計(jì) 青島路博偉業(yè)環(huán)保科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 底圩茶樣品預(yù)處理與多糖提取 將底圩茶在55 ℃下烘至恒重,粉碎過(guò)篩,置于棕色瓶?jī)?nèi)保存。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量底圩茶粉末,用無(wú)水乙醚進(jìn)行脫脂處理,在合適的溫度、料液比、超聲功率、時(shí)間條件下超聲提取,提取兩次,結(jié)束后進(jìn)行減壓過(guò)濾,收集濾液并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,往濃縮液中加入無(wú)水乙醇,于-4 ℃靜置過(guò)夜,將醇沉物質(zhì)進(jìn)行離心,收集沉淀并進(jìn)行真空冷凍干燥處理,得底圩茶粗多糖樣品[6]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 原料顆粒度的確定 稱取不同粒度(20、40、60、80、100目)的底圩茶粉2.0 g于三角瓶中,固定60 ℃的提取溫度,600 W的超聲波功率,1∶30 g/mL的料液比,90 min的超聲時(shí)間條件,考察原料顆粒度與底圩茶多糖得率的關(guān)系。

1.2.2.2 料液比的確定 稱取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,加入料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)蒸餾水,設(shè)置超聲水浴溫度60 ℃,超聲波功率600 W,超聲提取90 min,考察料液比與底圩茶多糖得率的關(guān)系。

1.2.2.3 超聲時(shí)間的確定 稱取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,固定600 W的超聲波功率,60 ℃的提取溫度,1∶30 g/mL的料液比條件,分別提取30、50、70、90、110 min,考察超聲時(shí)間與底圩茶多糖得率的關(guān)系。

1.2.2.4 提取溫度的確定 稱取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,加入料液比1∶30 g/mL蒸餾水,設(shè)置超聲功率600 W,改變超聲水浴溫度為20、30、40、50、60 ℃,在超聲波提取器中提取90 min,考察提取溫度與底圩茶多糖得率的關(guān)系。

1.2.2.5 超聲功率的確定 稱取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,加入料液比1∶30 g/mL蒸餾水,設(shè)置超聲水浴溫度為60 ℃,改變超聲功率為450、525、600、675、750 W,在超聲波提取器中提取90 min,考察提取溫度與底圩茶多糖得率的關(guān)系[7-9]。

1.2.3 底圩茶多糖超聲提取的正交優(yōu)化試驗(yàn) 分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,明確各因素間相互影響對(duì)底圩茶多糖得率的影響,多糖得率隨原料粒度變化增加不明顯,選擇對(duì)多糖得率有顯著影響的料液比、超聲時(shí)間、提取溫度三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)[10-11],其因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 底圩茶多糖得率的測(cè)定 底圩茶多糖含量采用蒽酮-硫酸法測(cè)定[12]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為葡萄糖,于620 nm測(cè)定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程中橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度(mg/mL),縱坐標(biāo)為吸光值,得到方程為y=0.5033x+0.0062,決定系數(shù)R2=0.9993。根據(jù)式(1)計(jì)算底圩茶多糖得率:

式(1)

式中:c:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的多糖質(zhì)量濃度,mg/mL;v:底圩茶多糖提取液總體積,mL;m:稱取的底圩茶質(zhì)量,g。

1.2.5 底圩茶粗多糖的純化 在正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下提取底圩茶粗多糖溶液,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后往其中加入30% H2O2至糖液體積的15%,于50 ℃水浴下保溫1 h,除去提取液中色素。取脫色后的底圩茶多糖粗提液,加入等體積Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1,V/V),劇烈振搖,棄去下層蛋白,重復(fù)操作5次。取脫蛋白后的水相進(jìn)行流水透析48 h,將透析液進(jìn)行濃縮,濃縮液中加入無(wú)水乙醇,置于-4 ℃靜置過(guò)夜,離心取沉淀,用無(wú)水乙醚、丙酮反復(fù)洗滌后進(jìn)行冷凍干燥,得到底圩茶多糖。稱取一定質(zhì)量純化后的底圩茶多糖,用蒸餾水溶解,配制不同濃度(0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)的底圩茶多糖待測(cè)液,用于抗氧化活性測(cè)定。

1.2.6 底圩茶多糖抗氧化活性測(cè)試

式(2)

1.2.6.2 羥基自由基(·OH)清除作用 參考丁世環(huán)等[15-19]方法略作修改進(jìn)行測(cè)定。分別取2.0 mL硫酸亞鐵(9 mmol/L)、1.0 mL鄰二氮菲溶液(0.75 mmol/L)于7支試管中,1號(hào)試管加入2.0 mL蒸餾水,從2號(hào)到7號(hào)試管依次加入0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的底圩茶多糖待測(cè)液各2.0 mL,最后每個(gè)試管再加入2.0 mL H2O2溶液(6 mmol/L),設(shè)置水浴鍋溫度37 ℃,放入試管保溫30 min,510 nm時(shí)測(cè)定各試管的吸光值。其中,第1支試管的吸光值計(jì)為A0,第2～7支試管的吸光值計(jì)為Ax,采用同樣方法,第2～7支試管中加入的過(guò)氧化氫用蒸餾水代替,測(cè)得的吸光值計(jì)為Ay,羥基自由基清除率計(jì)算公式為式(3)。

式(3)

1.2.6.3 DPPH自由基(DPPH·)清除作用 參考王麗波等[20-23]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改。取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的底圩茶多糖待測(cè)液2.0 mL于2～7號(hào)試管中,1號(hào)試管加入2.0 mL蒸餾水,在每個(gè)試管中加入2.0 mL DPPH溶液(甲醇配制,0.1 mmol/L),混合均勻后,避光30 min后測(cè)定各試管的吸光值(515 nm)。其中,第1支試管的吸光值計(jì)為A0,第2～7支試管的吸光值計(jì)為Aa,采用同樣方法,第2～7支試管中加入的DPPH用甲醇代替,測(cè)得的吸光值計(jì)為Ab,DPPH自由基清除率計(jì)算公式為式(4)。

式(4)

1.2.6.4 ABTS自由基(ABTS+·)清除作用 參考閆亞美等[24-29]方法進(jìn)行適當(dāng)修改。取2.0 mL ABTS工作液于7支試管內(nèi),第1支加入0.5 mL蒸餾水,從2號(hào)管依次加入0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的底圩茶多糖待測(cè)液,混合均勻,10 min后測(cè)定各試管的吸光值(734 nm)。其中,第1支試管的吸光值計(jì)為A0,第2～7支試管的吸光值計(jì)為Aa,采用同樣方法,第2～7支試管中加入的ABTS用甲醇代替,測(cè)得的吸光值計(jì)為Ab,ABTS自由基清除率計(jì)算公式為式(5)。

式(5)

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上每個(gè)試驗(yàn)均在相同水平條件下進(jìn)行3次,運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析,圖形繪制采用GraphPad Prism 8.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 底圩茶多糖超聲波輔助提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 原料粒度對(duì)底圩茶多糖得率的影響 原料粒度大小影響提取溶劑與物料接觸面積,顆粒過(guò)大,得率低,但顆粒過(guò)小,原料容易堆積結(jié)塊,反而不利于溶劑滲透,提取不完全,同時(shí)也造成多糖過(guò)濾分離困難。如圖1所示,40目的原料提取的多糖得率最高,為7.33%±0.19%;原料粒度增加,底圩茶多糖的得率卻有所下降。因此控制原料粒度在40目左右較適宜。

圖1 原料粒度對(duì)底圩茶多糖得率的影響Fig.1 Effects of granularity on yield ofpolysaccharide from Dixu tea注:不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05),圖2～圖5同。

2.1.2 料液比對(duì)底圩茶多糖得率的影響 在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用中,料液比也是一個(gè)非常重要的因素。溶劑體積充足可確保樣品充分浸沒(méi),有利于在提取過(guò)程中溶質(zhì)的溶出。因此,本實(shí)驗(yàn)考慮了料液比對(duì)目標(biāo)化合物多糖得率的影響。如圖2所示,在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的料液比范圍內(nèi)時(shí),底圩茶多糖得率出現(xiàn)顯著增加(P<0.05),但料液比大于1∶30 g/mL時(shí),溶劑過(guò)多,會(huì)增加萃取過(guò)程的復(fù)雜性,造成不必要的浪費(fèi),此外溶劑增加對(duì)于后期多糖分離純化效率也有較大影響,因此,從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度看,原料與溶劑的比例為1∶30 g/mL比較適宜。

圖2 不同料液比對(duì)底圩茶多糖得率的影響Fig.2 Effects of material-liquid ratioon yield of polysaccharide from Dixu tea

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)底圩茶多糖得率的影響 一般來(lái)說(shuō),植物中有效成分的提取與時(shí)間有密切關(guān)系,時(shí)間短,有效成分未能充分溶解釋放,時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)造成化合物分解,降低其活性。充分的超聲時(shí)間可促進(jìn)多糖較好地溶解釋放。如圖3所示,初始時(shí)間從30 min開始,底圩茶多糖的得率明顯上升,而進(jìn)一步增加時(shí)間得率并未提高,反而下降,這表明90 min的超聲可為原料細(xì)胞壁破裂提供充分分解時(shí)間。因此90 min為適宜的超聲時(shí)間。

圖3 不同超聲時(shí)間對(duì)底圩茶多糖得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time onyield of polysaccharide from Dixu tea

2.1.4 提取溫度對(duì)底圩茶多糖得率的影響 由圖4所示,當(dāng)提取溫度在20～50 ℃變化時(shí),隨著溫度增加,多糖分子運(yùn)動(dòng)加快,原料在超聲條件下的空化效應(yīng)越明顯,有利于多糖從細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)部溶解析出,得率呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)(P<0.05),當(dāng)溫度為50 ℃時(shí),底圩茶粗多糖得率最高,為10.24%±0.12%。當(dāng)溫度過(guò)高,會(huì)破壞多糖的糖苷結(jié)構(gòu),引起部分多糖分解,得率會(huì)有所下降。因此,基于能耗和得率的考慮,提取底圩茶多糖的溫度在50 ℃較適宜。

圖4 不同提取溫度對(duì)底圩茶多糖得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic temperatureon yield of polysaccharide from Dixu tea

2.1.5 超聲功率對(duì)底圩茶多糖得率的影響 超聲過(guò)程要形成較強(qiáng)的空化效應(yīng),需要溶劑產(chǎn)生合適的剪切力和進(jìn)行湍流流動(dòng),這與超聲功率有密切關(guān)系。如圖5所示,超聲功率在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi),底圩茶多糖得率水平出現(xiàn)顯著提高(P<0.05),從7.64%±0.20%增至10.24%±0.14%。由于在超聲波清洗器的最大功率750 W下,底圩茶多糖得率最高,故對(duì)其工藝優(yōu)化時(shí)固定超聲功率為750 W,后續(xù)不再進(jìn)行考察。

圖5 不同超聲功率對(duì)茶多糖得率的比較Fig.5 Effects of ultrasonic poweron yield of polysaccharide from Dixu tea

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2所示,通過(guò)對(duì)底圩茶多糖得率的極差分析,影響底圩茶多糖的因素中影響最重要的因素是料液比。在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍,底圩茶多糖超聲波輔助提取的最佳因素水平為:A3B3C3,選擇料液比為1∶40 g/mL,在提取溫度60 ℃下提取110 min,可得到最高多糖得率。由表3所示,因素A(料液比)對(duì)底圩茶多糖提取影響顯著(P<0.05),因素B(超聲時(shí)間)、因素C(提取溫度)沒(méi)有顯著性影響(P>0.05),在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平范圍內(nèi),超聲時(shí)間和提取溫度對(duì)底圩茶多糖提取影響不大。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 ANOVA analysis of orthogonal results

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取40目底圩茶粉2.00 g,根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果得到的底圩茶多糖的最優(yōu)提取條件,即加入料液比1∶40 g/mL的蒸餾水,超聲波功率設(shè)定為750 W,在60 ℃下進(jìn)行超聲提取110 min。試驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù),得到多糖平均得率為11.28%±0.49%,表明該優(yōu)化工藝條件穩(wěn)定,準(zhǔn)確性高。

2.4 底圩茶多糖抗氧化活性研究

圖6 底圩茶多糖對(duì)和ABTS+·的清除作用Fig.6 The scavenging effect of Diwei tea polysaccharides on 和ABTS+·

2.4.2 底圩茶多糖對(duì)·OH清除作用 羥基自由基是使生物體損傷最嚴(yán)重的活性氧自由基,具有穿透生物膜能力,能夠嚴(yán)重破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物分子,引起機(jī)體發(fā)生衰老、癌癥及其他疾病?！H氧化能力極強(qiáng),通過(guò)多糖對(duì)Fe2+進(jìn)行螯合,可以減少·OH的產(chǎn)生。如圖6b所示,多糖濃度由0.2 mg/mL提高至1.6 mg/mL,底圩茶多糖對(duì)·OH的清除效果增強(qiáng),濃度為1.6 mg/mL時(shí),其對(duì)·OH清除率迅速上升至83.30%±1.74%,多糖濃度高于1.6 mg/mL時(shí),清除率增幅變小,濃度為2.0 mg/mL時(shí),底圩茶多糖對(duì)·OH清除率為85.17%±1.70%,擬合曲線計(jì)算得到底圩茶多糖對(duì)·OH的IC50值為0.16 mg/mL,而VC的IC50值為0.03 mg/mL,說(shuō)明底圩茶多糖對(duì)·OH清除能力不及VC。

2.4.3 底圩茶多糖對(duì)DPPH·清除作用 由于抗氧化物質(zhì)能將紫紅色的DPPH自由基還原為黃色的二苯肼。DPPH·被清除主要與抗氧化劑的供氫能力有關(guān),常用作評(píng)價(jià)體外抗氧化試驗(yàn)研究的主要方法。如圖6c所示,在測(cè)試的濃度范圍內(nèi),底圩茶多糖均對(duì)DPPH·有明顯且穩(wěn)定的清除作用,底圩茶多糖濃度對(duì)DPPH·清除效果有正相關(guān)量效關(guān)系,清除率從36.99%±2.15%提高至66.48%±2.99%,擬合曲線計(jì)算得到底圩茶多糖和VC對(duì)DPPH·的IC50值分別為0.614和0.023 mg/mL。盡管底圩茶多糖與VC相比,在相同濃度下,多糖對(duì)DPPH·清除能力低于VC,但仍表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。

2.4.4 底圩茶多糖對(duì)ABTS+·清除試驗(yàn) ABTS形成的水溶性自由基很穩(wěn)定,一般用于抗氧化物質(zhì)總抗氧化能力測(cè)定的常用指標(biāo)。如圖6d所示,對(duì)ABTS+·的清除試驗(yàn)中底圩茶多糖效果明顯,在試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度范圍,底圩茶多糖濃度增加,ABTS+·清除能力也隨之增強(qiáng),當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL時(shí),其對(duì)ABTS+·清除率最高達(dá)82.37%±1.00%。清除率與底圩茶多糖質(zhì)量濃度符合正相關(guān)關(guān)系,擬合曲線計(jì)算得到底圩茶多糖和VC對(duì)ABTS+·的IC50值分別為0.046和0.024 mg/mL,表明底圩茶多糖清除ABTS+·能力較強(qiáng),清除效果與VC相近。

3 結(jié)論