響應(yīng)面法優(yōu)化面包果淀粉的酶法提取工藝

鐘雪瑤,王少曼,+,張彥軍,*,徐 飛,譚樂和,*,于寒松,吳 剛

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所,海南萬寧 571533; 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130000)

面包果(Artocarpusaltilis)屬?？茻釒颈炯Z食作物,原產(chǎn)于太平洋群島及印度、菲律賓[1],目前主要在我國(guó)海南、廣東等引種栽培[2]。面包果樹每株每季度果實(shí)產(chǎn)量可達(dá)50～200個(gè)[3],是一些熱帶發(fā)展中國(guó)家的重要糧食作物資源[4],富含淀粉(12.76%)、膳食纖維(5.19%)、蛋白質(zhì)(0.95%)和多種人體必需礦物質(zhì)[5]。面包果鮮果采收1～3 d內(nèi)會(huì)迅速軟化,儲(chǔ)存性能差[6],而將面包果加工成淀粉可便于存儲(chǔ)和增加通用性。

目前淀粉提取的主要方法有濕磨法、堿法、酶法和超聲波法[7]。Estrada-León等[8]采用濕磨法提取象耳豆淀粉但其提取率較低;陳子月等[9]表明與酶法相比,堿法制備大米淀粉的溶解度對(duì)溫度更敏感,而堿法提取會(huì)產(chǎn)生大量堿液造成環(huán)境污染;Wang等[10]表明酶法和超聲波法相結(jié)合能顯著提高大米淀粉的提取率,但提取的淀粉易破損,導(dǎo)致淀粉性質(zhì)發(fā)生改變。與其他提取方法相比,酶法提取具有溫和、破損率低、污染小、效率高等優(yōu)點(diǎn)[11]。目前對(duì)面包果的研究主要集中在面包果淀粉的加工利用方面[12-13],Nwabueze等[14]采用響應(yīng)面法優(yōu)化面包果加工膨化食品的工藝條件;Betiku等[15]通過響應(yīng)面法優(yōu)化面包果淀粉水解產(chǎn)物以生產(chǎn)乙醇的工藝參數(shù),而關(guān)于面包果淀粉酶法制備工藝的優(yōu)化尚未見報(bào)道。

本課題前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用中性蛋白酶法提取面包果淀粉提取率高且破損率低,因此采用單因素實(shí)驗(yàn)探究中性蛋白酶法提取面包果淀粉的工藝條件,并通過響應(yīng)面法優(yōu)化確定淀粉提取的最佳工藝參數(shù),為建立科學(xué)高效的面包果淀粉提取工藝提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

面包果 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供;中性蛋白酶Protex-7L(酶活200000 U/g) Novozyme公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

AL104型電子天平 美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司;HX-PB908多功能料理機(jī) 奧克斯集團(tuán)有限公司;Master-s-plus UVF型全自動(dòng)超純水系統(tǒng) 上海和泰;Avanti JXN-26型高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司;JDG-0.2真空冷凍干燥機(jī) 蘭州科技真空凍干技術(shù)有限公司;RH-600A高速多功能粉碎機(jī) 榮浩五金廠;盛藍(lán)HZ-2010 K多層恒溫?fù)u床 常州市三盛儀器制造有限公司;MB45型快速水分測(cè)定儀 美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司;NDA701杜馬斯定氮儀 意大利VELP;DHG-9625 A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;DLSB-5 L/10低溫冷卻循環(huán)泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 面包果淀粉的提取 新鮮面包果→去皮→切塊→清洗→研磨→酶解→過濾→水洗→離心→凍干→成品。

將新鮮的面包果去皮切塊之后清洗干凈,按一定的料液比例加入蒸餾水,置于多功能料理機(jī)中磨漿20 s,將面包果磨漿液與一定量的中性蛋白酶液混合,分裝于錐形瓶中,置于設(shè)定到一定溫度的搖床上進(jìn)行酶解,反應(yīng)結(jié)束后用100目網(wǎng)篩過濾,濾渣再水洗過濾三次,收集合并濾漿,室溫靜置2 h,棄去上清液,絮狀物經(jīng)蒸餾水洗滌表面后離心(8000 r/min,15 min),輕輕刮去沉淀物上層淡黃色物質(zhì),沉淀物反復(fù)水洗離心兩次,收集沉淀物在冰箱(-20 ℃)中冷凍12 h,再真空干燥(55 ℃)12 h[16]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 料液比對(duì)面包果淀粉提取率的影響 在酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間6 h、加酶量0.125%(占原料和水總質(zhì)量百分比)的條件下,考察料液比(原料質(zhì)量與蒸餾水體積比)分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 g/mL時(shí)對(duì)面包果淀粉提取率的影響,從而確定最佳的料液比。

1.2.2.2 酶解溫度對(duì)面包果淀粉提取率的影響 在料液比1∶4 g/mL、酶解時(shí)間6 h、加酶量0.125%的條件下,分別取酶解溫度40、50、60、70、80 ℃,探究不同酶解溫度對(duì)面包果淀粉提取率的影響,從而確定最佳的酶解溫度。

1.2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)面包果淀粉提取率的影響 在料液比1∶4 g/mL、酶解溫度60 ℃、加酶量0.125%的條件下,分別取酶解時(shí)間2、4、6、8、10 h,探究不同酶解時(shí)間對(duì)面包果淀粉提取率的影響,從而確定最佳的酶解時(shí)間。

1.2.2.4 加酶量對(duì)面包果淀粉提取率的影響 在料液比1∶4 g/mL、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間6 h的條件下,考察加酶量分別為0.05%、0.075%、0.1%、0.125%、0.15%、0.175%對(duì)面包果淀粉提取率的影響,從而確定最佳的酶添加量。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間和加酶量作為研究因素,并以面包果淀粉提取率為響應(yīng)值,進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析,試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.4 面包果中淀粉含量的測(cè)定 依據(jù)GB 5009.9-2016采用第二法測(cè)定[17]。鮮面包果中淀粉含量為0.1259 g/g。

1.2.5 面包果淀粉提取率的測(cè)定

式中:W1表示每克面包果提取得到的淀粉質(zhì)量(干基),g;W2表示每克面包果中淀粉含量(干基),g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析,其中P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著;采用Origin 2018軟件繪圖,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”顯示;采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。所有數(shù)據(jù)均為三次實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)面包果淀粉提取率的影響 料液比對(duì)面包果淀粉提取率的影響如圖1所示。由圖1可見,隨著料液比中蒸餾水量的增加,面包果淀粉提取率先呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)(P<0.05),在料液比1∶4時(shí)達(dá)到最高(62.21%),繼續(xù)增加水量,提取率則呈下降趨勢(shì)。料液比為1∶2時(shí),淀粉溶液較黏稠,流動(dòng)性差,酶與底物蛋白接觸不充分,不利于酶促反應(yīng)的發(fā)生,而降低了面包果淀粉分子的釋放[18]。隨著料液比的增加,有更多的溶劑滲透到物料中,增大了面包果淀粉與水的接觸面積,進(jìn)而中性蛋白酶與底物蛋白充分接觸反應(yīng),使面包果淀粉分子最大限度游離出來。當(dāng)料液比大于1∶4時(shí),面包果淀粉提取率下降,可能是由于料液中酶濃度被稀釋,酶促反應(yīng)不徹底[19]。綜上所述,選擇料液比1∶3、1∶4、1∶5進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 料液比對(duì)面包果淀粉提取率的影響Fig.1 Effects of solid/liquid ratio on theextraction rate of breadfruit starch注:不同字母表示不同提取條件間差異顯著(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 酶解溫度對(duì)面包果淀粉提取率的影響 不同酶解溫度對(duì)面包果淀粉提取率的影響見圖2。由圖2可見,隨著酶解溫度的升高,面包果淀粉提取率先增加后減小,在酶解溫度為60 ℃時(shí),面包果提取率呈現(xiàn)最大值,為61.18%。導(dǎo)致這種趨勢(shì)的原因主要是在一定的溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,活化分子數(shù)增加,分子間的碰撞機(jī)率增加,從而增強(qiáng)中性蛋白酶酶促反應(yīng)速率[20]。當(dāng)酶解溫度超過中性蛋白酶的活性承受范圍,會(huì)引起中性蛋白酶變性甚至失活,結(jié)果導(dǎo)致酶促反應(yīng)的減緩甚至停止,從而降低面包果淀粉的提取率。此外,過高的溫度引起淀粉糊化,溶液粘稠度增加而進(jìn)一步影響蛋白酶作用效果[21]。故選用50、60、70 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的水平。

圖2 酶解溫度對(duì)面包果淀粉提取率的影響Fig.2 Effects of enzymolysis temperatureon the extraction rate of breadfruit starch

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)面包果淀粉提取率的影響 面包果淀粉提取率隨酶解時(shí)間變化結(jié)果如圖3所示。由圖3可見,酶解時(shí)間2～6 h,時(shí)間不斷延長(zhǎng),面包果淀粉提取率也不斷提高至61.32%,6 h時(shí)提取效果最佳,6 h后淀粉提取率趨于穩(wěn)定。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),包裹在淀粉分子外的蛋白質(zhì)被中性蛋白酶不斷水解,面包果淀粉分子不斷與蛋白質(zhì)分離并釋放,從而提高面包果淀粉提取率[22]。當(dāng)達(dá)到一定酶解時(shí)間后,與中性蛋白酶親和力強(qiáng)的底物蛋白質(zhì)基本被酶解,進(jìn)而被此類底物蛋白包裹的淀粉最大程度被釋放,而一部分與中性蛋白酶無作用的底物蛋白依舊與淀粉分子牢牢結(jié)合,提取過程中隨水分流失,因而提取率趨于平穩(wěn)[23]。故選取4、6、8 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)面包果淀粉提取率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis timeon the extraction rate of breadfruit starch

圖4 加酶量對(duì)面包果淀粉提取率的影響Fig.4 Effects of enzyme dosageon the extraction rate of breadfruit starch

2.1.4 加酶量對(duì)面包果淀粉提取率的影響 加酶量對(duì)面包果淀粉提取率的影響如圖4所示。由圖4可見,在加酶量0.05%～0.125%范圍內(nèi),面包果淀粉提取率從58.83%增加至64.94%,然而加酶量在0.125%～0.175%范圍內(nèi)時(shí),提取率則下降至59.57%。故得出加酶量為0.125%時(shí),酶解提取效果最好。由酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可知,加酶量是限制酶促反應(yīng)速率的主要因素,當(dāng)反應(yīng)體系中酶濃度較低時(shí),中性蛋白酶濃度與酶促反應(yīng)速率呈正比[24]。當(dāng)酶濃度達(dá)到飽和后,面包果淀粉提取率出現(xiàn)下降趨勢(shì),這是由于酶發(fā)生彼此黏附,導(dǎo)致酶解率降低,提取率下降。故選取加酶量0.1%、0.125%、0.15%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 面包果淀粉提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 模型建立與方差分析 根據(jù)表1選定的響應(yīng)面考察因素和水平,通過Box-Behnken方法設(shè)計(jì)得到29組試驗(yàn),具體設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The design and results ofBox-Behnken cenral composite test

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到面包果淀粉提取率與各因素之間的二次多元回歸擬合方程為:

Y=69.20+0.99A+2.02B+0.37C+2.18D+0.51AB+0.07AC-1.18AD+0.30BC+1.81BD+0.89CD-5.15A2-5.35B2-5.31C2-7.78D2

由表3可知,料液比、酶解溫度和加酶量對(duì)面包果淀粉提取率影響均極顯著(P<0.01),且各因素對(duì)提取率影響程度為:D>B>A>C,即加酶量>酶解溫度>料液比>酶解時(shí)間。料液比和加酶量、酶解溫度和加酶量交互作用的影響極顯著(P<0.01),酶解時(shí)間和加酶量交互作用的影響顯著(P<0.05),料液比和酶解溫度、料液比和酶解時(shí)間以及酶解溫度和酶解時(shí)間交互作用對(duì)提取率的影響不顯著(P<0.05)。對(duì)于模型的二次項(xiàng)來說均影響極顯著(P<0.01)。

2.2.2 各因素交互作用影響 響應(yīng)面圖可以更加直觀形象地反映出各單因素以及各單因素之間交互影響的強(qiáng)弱關(guān)系[25]。響應(yīng)面中,固定某個(gè)因素,改變另一個(gè)因素引起響應(yīng)值變化,如果響應(yīng)面走勢(shì)較陡,說明該因素對(duì)響應(yīng)值影響顯著,反之則不顯著[26]。響應(yīng)面優(yōu)化模型因素(料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間和加酶量)兩兩交互作用對(duì)面包果淀粉提取率影響的響應(yīng)面曲面圖如圖5所示。

由圖5a分析可知,料液比和加酶量交互作用對(duì)面包果淀粉提取率影響的等高線為橢圓形,說明料液比和加酶量交互作用對(duì)面包果淀粉提取率的影響顯著。當(dāng)加酶量不變時(shí),隨著料液比的增加,提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);當(dāng)料液比不變時(shí),隨著加酶量增加,提取率也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶4.1,加酶量為0.13%,提取率達(dá)到最大值。圖5b、圖5c和圖5d反映了料液比和酶解溫度、料液比和酶解時(shí)間以及酶解溫度和酶解時(shí)間交互作用對(duì)提取率的影響,對(duì)提取率影響的等高線都近似圓形,說明此因素對(duì)結(jié)果影響不顯著。當(dāng)固定一個(gè)變量,提取率會(huì)隨另一個(gè)變量的增大先上升后下降,但隨著因素值的改變,提取率變化不明顯。當(dāng)料液比為1∶4.1,溫度為62 ℃,時(shí)間為6 h,提取率達(dá)到最大值。從圖5e可以看出酶解溫度和加酶量交互作用對(duì)提取率影響的等高線為橢圓形,且由曲面圖可以看出,結(jié)果隨因素改變的變化明顯,說明此因素交互作用對(duì)結(jié)果影響顯著,在溫度為62 ℃,加酶量為0.13%,提取率最高。圖5f為酶解時(shí)間和加酶量交互作用對(duì)提取率的影響,等高線圖為較扁的橢圓形,說明對(duì)提取率的影響較為顯著,隨著因素的增加,提取率先增加,在時(shí)間6 h,加酶量0.13%時(shí)達(dá)到最大值,然后提取率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

圖5 各因素交互作用對(duì)面包果淀粉提取率的影響Fig.5 Effect of interaction between various factors on the extraction rate of breadfruit starch

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析優(yōu)化,得出中性蛋白酶法提取面包果淀粉的最佳工藝條件為料液比1∶4.09 g/mL、酶解溫度62.22 ℃、酶解時(shí)間6.11 h、加酶量0.13%,此條件下面包果淀粉提取率的預(yù)測(cè)值為69.66%。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的可行性,選擇優(yōu)化后的條件進(jìn)行酶法提取面包果淀粉的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?？紤]到操作的可行性,將上述最佳條件調(diào)整為料液比1∶4 g/mL、酶解溫度62 ℃、酶解時(shí)間6 h、加酶量0.13%,在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),得到的提取率為69.97%±0.14%,與回歸方程理論面包果淀粉提取率69.66%相吻合,說明響應(yīng)面法優(yōu)化后得到的最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,該回歸模型具有較好的預(yù)測(cè)效果。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化面包果淀粉的中性蛋白酶法提取工藝,以面包果淀粉的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到以下結(jié)論:各因素對(duì)面包果淀粉提取率的影響程度為:加酶量>酶解溫度>料液比>酶解時(shí)間。料液比和加酶量、酶解溫度和加酶量交互作用的影響極顯著(P<0.01),酶解時(shí)間和加酶量交互作用的影響顯著(P<0.05)。中性蛋白酶法提取面包果淀粉的最佳工藝參數(shù)為:料液比1∶4 g/mL、酶解溫度62 ℃、酶解時(shí)間6 h、加酶量0.13%。在最佳條件下得到的面包果淀粉實(shí)際提取率為69.97%,與理論值69.66%相吻合。