不同儲藏溫度對超巴氏奶貨架期理化指標及風味的影響

依勝男,張書文,蘆 晶,逄曉陽,宋慧敏,梁佳祺,郝莉雨,胡 誠,許曉曦,*,呂加平,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

液態(tài)奶根據(jù)其殺菌方式的不同,一般包括巴氏殺菌奶、超巴氏殺菌奶以及超高溫瞬時滅菌奶(UHT)。目前常用巴氏殺菌奶熱處理條件為72～75 ℃、15～20 s或80～85 ℃、10～15 s[1]。UHT處理條件是超過135 ℃并高于1 s,我國通常使用的UHT的處理方式為137 ℃、4 s。巴氏殺菌乳在殺死所有致病菌的基礎上盡量減少了牛乳中營養(yǎng)物質(zhì)的損失,在冷藏條件下可以保存1～2周[2]。UHT破壞了其中生長的全部微生物以及芽孢,其保質(zhì)期可達常溫保存45～180 d。巴氏殺菌奶與原料奶風味相似,盡可能保留了奶中的營養(yǎng)物質(zhì),但存在貨架期較短的缺點。UHT雖保證了貨架期,但由于熱處理強度較大,奶中的活性營養(yǎng)物質(zhì)被破壞,蛋白變性以及生成多種副產(chǎn)物等[3-4]。超巴氏殺菌處理條件為120～125 ℃、4～20 s不等[5],存在營養(yǎng)物質(zhì)較超高溫瞬時滅菌奶破壞少、貨架期較巴氏殺菌奶長等優(yōu)點[6]。

除熱處理條件影響液態(tài)奶的品質(zhì)外,儲藏條件對于液態(tài)奶的品質(zhì)也有很大的影響。液態(tài)奶在貯存期中會出現(xiàn)脂肪分離,蛋白質(zhì)沉淀和膠凝以及風味變化等問題[6]。王欣[7]研究發(fā)現(xiàn),隨保藏時間的延長以及保藏溫度的提高,UHT乳中蛋白質(zhì)、乳脂肪等理化指標及感官品質(zhì)均降低。Malmgren等[8]評價UHT乳在5、22、30、40 ℃下儲藏六個月后的物理穩(wěn)定性,結果顯示所有溫度下UHT乳出現(xiàn)不同程度的顆粒聚集和蛋白質(zhì)下沉現(xiàn)象。Anne等[9]研究了儲藏在10、20、30、40以及50 ℃三個溫度下24周內(nèi)UHT奶品質(zhì)的變化,結果顯示儲藏溫度低于30 ℃時在第24周時色澤發(fā)生明顯變化,而在儲藏溫度高于40 ℃時,第六周色澤就發(fā)生明顯變化?？梢?國內(nèi)外對UHT乳的貨架期研究較深入,數(shù)據(jù)全面。但是,由于巴氏殺菌奶貨架期較短,無法準確探究其貨架期的品質(zhì)變化,研究數(shù)據(jù)較少。同樣,有關超巴氏奶貨架期的品質(zhì)變化數(shù)據(jù)較少,需要進一步全面深入的探討研究。

本實驗以生鮮奶為原料,超巴氏殺菌后的液態(tài)奶置于不同儲藏溫度下定期檢測,研究在儲藏過程中理化指標的變化以及儲藏溫度對各指標的影響。旨在分析超巴氏奶儲藏期間品質(zhì)的變化及初步探討變化的原因,為產(chǎn)品儲藏條件的選擇以及貨架期模型的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料乳 北京市三元綠荷牧場;偶氮酪蛋白、對硝基苯酚棕櫚酸酯、對硝基苯酚 Sigma公司;磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、Tris-HCl、DMSO 國藥集團。

APV均質(zhì)機、日本POWERPOINT殺菌機、沃迪無菌填充室的中式生產(chǎn)設備 上海沃迪科技有限公司;Zetasizer Nano ZS納米粒徑電位分析儀 英國馬爾文儀器公司;Minolta CR-400色差儀 日本柯尼卡美能達公司;Model 680酶標儀 American,Bio-Rad;PEN3.5電子鼻 德國AIRSENSE公司;AsrreeⅡ/LS16電子舌 法國Alpha MOS公司;DELTA 320精密pH計 瑞士梅特勒-托利多股份有限公司;3K15離心機 德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的準備 原料奶采用UHT中試設備對優(yōu)質(zhì)原料乳進行熱處理。首先將牛乳預熱到60～65 ℃,隨后進行二級均質(zhì)(20±2 MPa),再進入UHT中試設備進行120±1 ℃,15 s的熱處理,最后進行無菌灌裝。將樣品儲藏在4、25、37 ℃溫度下進行貨架期實驗(2019.10.10)。

1.2.2 pH的測定 取100 mL樣品,放入轉(zhuǎn)子后在磁力攪拌器上混合均勻,插入pH計進行測量,在數(shù)值穩(wěn)定后記錄pH。

1.2.3 細菌蛋白酶活性的測定

1.2.3.1 樣品蛋白酶活的測定 采用偶氮酪蛋白法[10],取1 mL牛乳與2 mL、0.5%的偶氮酪蛋白以及1 mL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液充分混合后在37 ℃下反應2 h。反應結束后加入4 mL、5%的三氯乙酸終止反應。室溫下靜置30 min后,9500 r/min離心5 min,過濾后于345 nm處測吸光值。依據(jù)發(fā)光生成物生成的濃度不同,在345 nm處測定其吸光度值來定量酶的活性。

1.2.3.2 蛋白酶活性的定義 在345 nm下,每小時增加0.01個吸光值為一個酶活力單位。

1.2.4 脂肪酶活性的測定

1.2.4.1 樣品脂肪酶活的測定 參照了Bendicho等[11]建立的方法,并做了適當?shù)男薷?具體的操作步驟如下:取100 μL超巴氏奶與500 μL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH9.0)混合,然后加入100 μL底物溶液(1 mmol/L 對硝基苯酚棕櫚酸酯的DMSO溶液);充分混合后,45 ℃下孵育20 min;取200 μL溶液加入96孔酶標板中,在405 nm波長下測量吸光值。

1.2.4.2 標準曲線的制作 以50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)作為溶劑,分別配制濃度為0、50、100、150、200、250、300 μmol/L對硝基苯酚溶液,取200 μL不同對硝基苯酚溶液于96孔酶標板中,測量405 nm波長下的吸光值A405。

1.2.4.3 脂肪酶活性的定義 單位時間內(nèi)水解對硝基苯酚棕櫚酸酯釋放1 μmol對硝基苯酚的酶活性定義為一個酶活單位U。

1.2.5 色差的測定 在穩(wěn)定的標準光源D65環(huán)境下來測定液態(tài)奶色澤的變化。取20 mL牛乳于一次性培養(yǎng)皿中,利用色差儀對表征牛乳樣品的色澤的L*、a*、b*值進行測定,每個樣品測定3次,取算術平均值。色差儀通過三個指標反映樣品的顏色差異,其中L*是指樣品的明度,即黑白度,0為黑,100為白;a*是紅綠值,>0為紅,<0為綠,=0為中性色;b*是黃藍值,>0為黃,<0為藍,=0為中性色。

1.2.6 酪蛋白膠體粒徑和Zeta電位的測定 室溫下將牛乳樣品與去離子水按照1∶1000稀釋,然后過0.45 μm微濾膜處理,利用Zetasizer Nano ZS納米粒徑電位分析儀對牛乳的酪蛋白膠體粒徑和Zeta電位進行測定,樣品池均選用DTS1060彎曲式毛細管樣品池。每個樣品平行測定3次,取算數(shù)平均值。

1.2.7 電子鼻的測定 取1 mL樣品放置于電子鼻專用的玻璃瓶中,封蓋后在室溫下平衡30 min,用電子鼻進行測定。電子鼻采用頂空進樣方式,每個樣品重復4次,篩選結果理想的3個作為平行。載氣為空氣,速度為300 mL/min。頂空獲取時間為60 s,延滯180 s,選取48～52 s較平穩(wěn)的階段進行信息采集,用儀器自帶軟件進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

1.2.8 電子舌的測定 樣品在4500 r/min下離心20 min后,除去脂肪,吸取1 mL脫脂乳,用80 mL超純水稀釋,放在專用燒杯中,待測。樣品與校準溶液(超純水)交替檢測,每個樣品測定7次,選取較穩(wěn)定的后4次測定數(shù)據(jù)進行分析。用儀器自帶軟件進行判別因子分析(discriminant function analysis,DFA)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各實驗均重復進行3次以上。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 8.5和Origin Pro 9.1軟件進行統(tǒng)計處理與作圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同儲藏時間超巴氏殺菌奶理化指標的變化

2.1.1 儲藏期間超巴氏奶pH的變化 超巴氏奶儲藏期間pH變化如圖1所示,由圖1可知,超巴氏奶pH在儲藏期間隨時間的延長呈下降的趨勢,并隨儲藏溫度的升高,變化趨勢逐漸增大。超巴氏奶在儲藏第25 d后,三個儲藏溫度下pH呈現(xiàn)不同的下降趨勢,差異極顯著(P<0.01)。在儲藏溫度為4 ℃時,超巴氏奶pH從6.65下降到6.58,變化幅度很小,而在儲藏溫度為37 ℃時,pH由6.65下降到6.38,變化程度明顯高于其他兩個儲藏溫度。這與Hussain[12]的研究結果趨勢一致,其研究發(fā)現(xiàn),半脫脂UHT在三個月的保藏期間,保藏溫度為4 ℃時pH幾乎維持不變,保藏溫度為25、45 ℃呈現(xiàn)不同趨勢的下降。此外,Gaucher等[13]研究發(fā)現(xiàn),保藏在40 ℃條件下儲藏6個月的UHT奶pH由6.69降至6.21。影響超巴氏奶儲藏期間pH的因素有很多,如磷酸鈣鹽的沉淀、乳糖的降解或蛋白質(zhì)以及脂肪的水解等。結合本文測得蛋白酶活以及脂肪酶活含量增加的結果,pH的降低可能由于蛋白質(zhì)和脂肪的降解生成游離氨基酸和有機酸導致的。

圖1 三個儲藏溫度下pH的變化Fig.1 Changes of pH at three storage temperatures

2.1.2 儲藏期間超巴氏奶蛋白酶活性的變化 圖2為測得不同儲藏溫度下細菌蛋白酶活隨時間的變化。由圖2可見,超巴氏奶儲藏在4、25 ℃溫度下,細菌蛋白酶活均呈現(xiàn)緩慢的上升,兩個儲藏溫度下,酶活力數(shù)值相差不大,差異不顯著(P>0.05)。但在儲藏溫度為37 ℃時,蛋白酶活力在第25 d后急劇上升,由最初的0.65 U/mL升至3.2 U/mL,與4和25 ℃蛋白酶活力差異極顯著(P<0.01)。Ziyaina等[14]研究發(fā)現(xiàn),巴氏奶儲藏過程中蛋白酶活性隨儲藏溫度的升高而增高,但是在7 ℃以下蛋白酶活性維持非常低的狀態(tài)。此外,同樣對于儲藏在37 ℃的液態(tài)奶,本文測得的超巴氏奶儲藏過程中酶活力達到的最高值低于Ziyaina測得的巴氏奶酶活力達到的最高值,但高于郭奇慧等[15]測得UHT儲藏過程中達到的最高值?？梢?熱處理強度越低以及儲藏溫度越高,細菌蛋白酶活性越高。

圖2 三個儲藏溫度下蛋白酶活性的變化Fig.2 Changes of protease activityat three storage temperatures

生鮮奶中測得的細菌蛋白酶酶活力值達到4.5 U/mL。細菌蛋白酶主要來自于熒光假單胞菌,超巴氏殺菌并不能使細菌蛋白酶全部失活,細菌蛋白酶可導致儲藏期間超巴氏奶的陳化凝膠以及蛋白質(zhì)水解[16-18]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),細菌蛋白酶也是導致液態(tài)奶在儲藏期間發(fā)生乳清析出、pH降低、風味改變等現(xiàn)象的原因之一[19-21]。結合本文蛋白酶活檢測,由于后期蛋白酶活力明顯升高,超巴氏奶不宜儲存在37 ℃溫度下。

表1 三個儲藏溫度不同時間色度L*、a*及b*值Table 1 L*,a* and b* value of different time at three storage temperatures

2.1.3 儲藏期間超巴氏奶脂肪酶活性的變化 圖3為測得不同儲藏溫度下脂肪酶活性隨時間的變化。由圖3可見,儲藏在4 ℃條件下超巴氏奶的脂肪酶活力在儲藏期間較為穩(wěn)定,僅略有增加。而儲藏在25、37 ℃條件下的超巴氏奶在儲藏第10 d脂肪酶活性大幅增加,在10～45 d 脂肪酶一直保持較高活力,三個儲藏溫度下脂肪酶活力差異顯著(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn),脂肪酶具有極高耐熱性,甚至在UHT處理后仍可殘存活性[22]。實驗測得生鮮奶中脂肪酶活性為12.8 U/mL。此外,劉晶等[23]研究發(fā)現(xiàn),嗜冷菌分泌的脂肪酶最適活性溫度為25～37 ℃。因此,儲藏在25和37 ℃的超巴氏奶可能由于其在最適活性溫度范圍內(nèi),造成第10 d后脂肪酶活性迅速升高。

圖3 三個儲藏溫度下脂肪酶活性的變化Fig.3 Changes of lipase activity at three storage temperatures

脂肪酶會導致超巴氏奶在儲藏過程中發(fā)生牛乳酸化、脂肪上浮、脂肪酸氧化產(chǎn)生不良風味[24-26]。此外,非常少量的脂肪酶就可導致產(chǎn)品在儲藏期間的感官缺陷。因此,盡量減少脂肪酶對超巴氏奶儲藏期間的影響,應將其儲藏在4 ℃的條件下。

2.1.4 儲藏期間超巴氏奶色澤的變化 表1分別是不同儲藏溫度不同時間色澤L*、a*和b*的值。由表1可以看出,4 ℃儲藏條件下L*值緩慢下降,不同儲藏時間a*值和b*值差異不顯著(P>0.05),只存在白度上的變化。當保藏溫度為25和37 ℃時,L*值均呈現(xiàn)下降的趨勢,a*值初始平緩后期緩慢上升,b*值在儲藏期間急劇上升。三個儲藏溫度下,L*值在不同儲藏時間差異顯著(P<0.05),a*值和b*值在儲藏第25 d三個儲藏溫度下差異極顯著(P<0.05)。顏色的變化主要由于奶在保藏過程中蛋白質(zhì)和乳糖會繼續(xù)發(fā)生美拉德反應,進而產(chǎn)生糠氨酸、羥甲基糠醛以及類黑精等其他褐色物質(zhì),影響樣品的色澤[27-28]。所以,L*值逐漸降低和b*值的逐漸加大與美拉德反應有關。L*值逐漸降低說明顏色越來越暗,b*值逐漸增高說明奶的顏色越來越偏向黃褐色。超巴氏奶分別儲藏在4、25、37 ℃時,L*值分別由59.57降低到57.78、56.58和55.21。儲藏在37 ℃條件下的超巴氏奶,b*值上升速度明顯高于25 ℃儲藏的超巴氏奶。說明隨著儲藏溫度的升高,美拉德反應的速率逐漸增加,色澤變化越大。這與O’Connell等[29]的研究一致,其發(fā)現(xiàn)UHT奶儲藏在任何溫度下都會發(fā)生美拉德反應,但在高儲藏溫度下會優(yōu)先發(fā)生?？梢?儲藏在4 ℃條件下的超巴氏奶顏色變化程度明顯低于25和37 ℃。

圖4 三個儲藏溫度下粒徑的變化趨勢Fig.4 Change trend of particle sizeat three storage temperatures

2.1.5 儲藏期間超巴氏奶粒徑以及Zeta電位的變化 圖4為保藏期內(nèi)粒徑隨時間的變化趨勢。初始測得超巴氏奶粒徑為180 nm,較Gaucher等[30]測得的UHT的粒徑270 nm小。由于隨著熱處理強度的增加,乳清蛋白發(fā)生變性及其與酪蛋白膠束的結合導致酪蛋白膠束的大小增加[31]。由圖4可知,三個儲藏溫度下前25 d粒徑變化不大,差異不顯著(P>0.05)。儲藏在25和37 ℃的超巴氏奶在第25 d后粒徑大幅度增加,在儲藏第45 d粒徑分別達到320和358 nm。儲藏在4 ℃的超巴氏奶粒徑在第35 d后稍微增加。第25 d后,三個儲藏溫度下粒徑差異極顯著(P<0.01)?？梢?隨著儲藏溫度的增加,粒徑增加幅度越大。保藏后期粒徑急劇增加可能由于細菌蛋白酶的作用導致超巴氏奶的凝膠化明顯,部分粒子聚集形成顆粒,導致超巴氏奶粒徑急劇增加。此外,可能由于儲藏期間pH的下降導致蛋白質(zhì)中磷酸鈣的溶解,并從酪蛋白中解離出來,解離出的鈣離子可與蛋白質(zhì)絡合形成“鈣橋”,促進酪蛋白隨后的聚集,導致粒徑的增加[32]。

Zeta電位的大小是衡量膠體粒子穩(wěn)定性的重要參數(shù),絕對值較高意味著穩(wěn)定性越高[33]。超巴氏奶儲藏期間Zeta電位變化如圖5所示,由圖5可知,樣品在4 ℃儲藏時,電位變化幅度較小,儲藏在25和37 ℃的樣品,粒子所帶負電荷量均先增加后減少。樣品在25 ℃儲藏35 d、37 ℃儲藏25 d時,粒子所帶負電荷分別最多。儲藏初期Zeta負電荷的增加可能存在兩個原因:第一在美拉德反應的第一階段,乳糖與帶正電荷的賴氨酸和精氨酸殘基反應,正電荷的減少導致負電荷的增多[34]。其次,結合脂肪酶活力在儲藏第10 d增加的現(xiàn)象推斷,脂肪被脂肪酶氧化生成小分子有機酸分布在粒子表面,是以COO-的形式存在于粒子表面,從而導致負電荷增加[35]。粒子負電荷在儲藏后期的減少可能由于粒子粒徑變大,電位絕對值降低,穩(wěn)定性降低的主要原因是由于酶的作用導致粒子大小發(fā)生變化,并且溶液的pH降低,從而導致體系電位的不穩(wěn)定。

圖5 三個儲藏溫度下Zeta電位的變化Fig.5 Change trend of zeta potentialat three storage temperatures

由粒徑和Zeta電位可以看出,儲藏在4 ℃條件下的超巴氏奶貨架期內(nèi)的品質(zhì)改變明顯低于儲藏在25和37 ℃條件下的超巴氏奶。

2.2 不同儲藏溫度超巴氏奶風味的變化

2.2.1 電子鼻分析超巴氏奶貨架期風味變化 使用電子鼻對3個不同儲藏溫度5個時間點檢測的風味參數(shù)進行主成分分析,結果如圖6所示。PC1和PC2貢獻率和為99.88%,大于90%,說明兩個主成分已經(jīng)代表了主要信息特征。并且,PC1的貢獻率高達98.12%。從圖6中可以看出,4 ℃保藏溫度下風味變化主要在第二主成分軸上,但主成分二貢獻率僅1.76%,可見在4 ℃保藏期間超巴氏奶風味變化并不大。而在25和37 ℃保藏溫度下風味變化主要在第一主成分軸上,可見在這兩個保藏溫度下風味變化差異明顯,隨著儲藏時間的增加,可見主成分一占比在逐漸增加。此外,不同保藏條件不同期間超巴氏奶均與未保藏超巴氏奶差異明顯。可見,儲藏在4 ℃條件下的超巴氏奶在儲藏期間風味變化小,而另外兩個儲藏溫度下的超巴氏奶儲藏期間風味變化較大。

圖6 4、25以及37 ℃三個儲藏溫度下不同時間電子鼻PCA分析圖Fig.6 PCA analysis of electronic nose at threestorage temperatures of 4,25 and 37 ℃注:每個樣品均以C-儲藏溫度-儲藏d數(shù)標注,其中C代表超巴氏奶。圖7同。

2.2.2 電子舌分析超巴氏奶貨架期風味變化 圖7為超巴氏滅菌乳在不同保藏溫度和時間條件下電子舌的分析結果,從圖7中可以看出樣品第一判別因子貢獻率為98.47%,能反映出樣品的整體特征信息。圖中所有樣品被分為兩部分,其中未保藏樣品、4 ℃保藏的全部樣品以及在25 ℃條件下保藏10 d的樣品分布于圖的左側(cè),而其余樣品分布于圖的右側(cè)。部分25 ℃和全部37 ℃保藏的樣品與未保藏樣品間距離較遠,即滋味差異較大,左側(cè)樣品與未保藏樣品間差異較小,雖然25 ℃保藏10 d的樣品也居于左側(cè),但保藏時間只有10 d,基于保質(zhì)期的考慮,也為了保證產(chǎn)品的風味,建議超巴氏滅菌乳在4 ℃環(huán)境下保藏。

圖7 4、25以及37 ℃三個儲藏溫度下不同時間電子舌DFA分析圖Fig.7 DFA analysis of electronic tongueat three storage temperatures of 4,25 and 37 ℃

3 結論

本文研究了超巴氏奶在不同溫度下儲藏45 d內(nèi)理化指標及風味的變化。實驗結果表明,4 ℃保藏條件下超巴氏奶細菌蛋白酶活以及脂肪酶活變化不明顯,蛋白酶活在保藏溫度37 ℃變化明顯,在保藏第25 d后急劇上升。25和37 ℃保藏溫度下的脂肪酶活性均在儲藏第10 d后急劇上升,并維持在較高活力。此外,在儲藏過程中,超巴氏奶pH下降、粒徑增加、Zeta電位先下降后上升,并隨儲藏溫度的增加,變化加快。對于色澤,4 ℃保藏下超巴氏奶只在L*值上有明顯變化,而在25以及37 ℃保藏溫度下L*、a*以及b*值均有明顯變化。電子鼻和電子舌結果表明,儲藏在4 ℃條件下的超巴氏奶氣味和滋味儲藏期間變化均不大,而儲藏在37 ℃條件下的超巴氏奶風味變化明顯。可見,超巴氏奶在4 ℃保藏條件下貨架期可達45 d,若較高溫度的保藏條件,儲藏時間適當降低。