輪狀病毒減毒活疫苗感染性滴度一步法RT-qPCR檢測方法的建立*

杜加亮，劉悅越，張 永，趙榮榮，趙一榮，韓 菲，劉 艷

(中國食品藥品檢定研究院腸道病毒疫苗室,北京 102629)

輪狀病毒是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致5歲以下兒童嚴(yán)重腹瀉的最主要病原體。自2001年輪狀病毒疫苗問世以來，全球已經(jīng)有100多個(gè)國家和地區(qū)在使用。在疫苗問世之前，輪狀病毒相關(guān)胃腸炎(RVGE)在5歲以下兒童中每年導(dǎo)致超過50萬死亡病例[1]。雖然疫苗的問世減少了死亡病例，但是在低收入國家，RVGE每年仍然導(dǎo)致超過20萬死亡病例[2]。輪狀病毒疫苗可有效降低RVGE的負(fù)擔(dān)，因此，對疫苗的評價(jià)顯得尤為重要，尤其是多價(jià)疫苗的鑒別和效力評價(jià)。常用的檢測方法為使用特異性抗體，通過熒光灶試驗(yàn)(FFA)、空斑試驗(yàn)或細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(CCID50)等來實(shí)現(xiàn)[3-5]，但是這些方法均涉及特異性抗體制備困難、操作復(fù)雜且要求高、耗時(shí)長、主觀性大、通量小等不足，不利于多價(jià)疫苗產(chǎn)品的精準(zhǔn)配制和生產(chǎn)全過程的質(zhì)量控制。相比之下，基于核酸的定量檢測方法具有試劑材料可及性強(qiáng)、可操作性強(qiáng)、一致性高、耗時(shí)短、通量大、結(jié)果更加客觀等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成功應(yīng)用于甲型肝炎、腮腺炎病毒疫苗的滴度檢測[6-7]。MSD RotaTeq使用的就是基于細(xì)胞感染的核酸定量檢測方法[8]，但由于疫苗毒株不同，基因序列不同，細(xì)胞感染特點(diǎn)也不同，該方法需要針對不同疫苗毒株進(jìn)行不同設(shè)計(jì)。輪狀病毒流行株因地區(qū)和年份而不同，G1、G2、G3、G4、G9型構(gòu)成了我國的主要流行株[9]。國內(nèi)某企業(yè)生產(chǎn)的五價(jià)人-牛重配輪狀病毒減毒活疫苗涵蓋了以上5種主要流行株。本研究針對該疫苗，參考現(xiàn)有方法[10]，設(shè)計(jì)一步法反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)，用于多價(jià)輪狀病毒疫苗的鑒別和效力評價(jià)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 單價(jià)輪狀病毒參考品由國內(nèi)某企業(yè)提供，病毒滴度分別為G1:1.04×107CCID50/mL，G2:1.05×107CCID50/mL，G3:1.76×107CCID50/mL，G4:3.96×107CCID50/mL，G9:3.45×107CCID50/mL。一步法熒光定量PCR試劑盒(RR064)和一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(RR057)購自TaKaRa公司，QIAamp Viral RNA Mini Kit購自QIAGEN公司。細(xì)胞培養(yǎng)液為Gibco RPMI Medium 1640(1×)+1%(v/v)谷氨酰胺+1%(v/v)雙抗+10%(v/v)胎牛血清。病毒稀釋液為Gibco RPMI Medium 1640(1×)+1%(v/v)谷氨酰胺+1%(v/v)雙抗+5 μg/mL胰酶。熒光定量PCR儀(7500)購自Thermofisher Scientific公司；恒河猴腎細(xì)胞MA104為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2引物探針設(shè)計(jì)和質(zhì)粒參考品制備 分別吸取200 μL G1、G2、G3、G4和G9型單價(jià)病毒原液，按照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說明書的步驟提取病毒RNA。利用通用型VP7引物VP7-F和VP7-R擴(kuò)增各型單價(jià)病毒原液的VP7基因，見表1。目的條帶經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收后，與pEASY-T3載體連接。轉(zhuǎn)化DH5a大腸埃希菌感受態(tài)后，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選、PCR鑒定、酶切鑒定和測序驗(yàn)證。測序結(jié)果經(jīng)序列比對后，選擇型別間差異明顯的區(qū)段進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)(表1)，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。質(zhì)粒純度符合要求(A260/A280為1.8～2.0)后作為備用參考品原液。質(zhì)粒拷貝數(shù)(copy/μL)按照以下公式計(jì)算：(6.02×1012)×(質(zhì)粒濃度ng/μL×10-9)/(質(zhì)粒長度bp×660)。本研究中使用稀釋至107、106、105、104、103、102copy/μL的質(zhì)粒作為參考品。

表1 本研究中使用的探針/引物信息

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和病毒接種 取生長密度合適的MA104細(xì)胞，消化制成濃度約為1.2×106個(gè)細(xì)胞的懸液，鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后使用。使用病毒稀釋液進(jìn)行待測病毒稀釋，置于37 ℃培養(yǎng)箱中活化60 min。取出預(yù)先鋪有MA104細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄掉細(xì)胞維持液。把活化后的病毒加到相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每孔40 μL，每個(gè)稀釋度4孔，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h。每孔中加入4.5% Triton X-100工作液10 μL，置于-70 ℃放置至少1 h。

1.4RT-qPCR 感染板室溫放置20 min直至解凍，1 000 r/min振蕩10 s，1 000 r/min離心1 min，從每孔中吸取15 μL溶液進(jìn)行40倍稀釋作為RT-qPCR的模板。RT-qPCR反應(yīng)體系為12.5 μL Buffer、0.5 μL反轉(zhuǎn)錄酶、0.5 μL Taq酶、上下游引物(10 μmol)各0.4 μL、探針(10 μmol)0.4 μL、5 μL模板、加水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s(收集熒光)，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果解釋：Ct值≤35且擴(kuò)增曲線呈S型為陽性，否則為陰性。

1.5特異性檢測 每個(gè)血清型毒株特異性引物/探針對每個(gè)重配株的單價(jià)培養(yǎng)物進(jìn)行RT-qPCR來確定方法的特異性。每對引物/探針都應(yīng)選擇性地使G1、G2、G3、G4和G9重配株的VP7基因片段序列擴(kuò)增。所有引物/探針只能對特異型擴(kuò)增，對其他型無擴(kuò)增或選擇性差異≥210倍。將滅活的其他腸道病毒[柯薩奇病毒A(CA16)、腸道病毒71型(EV71)和脊髓灰質(zhì)炎病毒]進(jìn)行RT-qPCR，Ct值≥35或無擴(kuò)增。

1.6線性和范圍檢測 將單價(jià)輪狀病毒參考品以1∶15的稀釋倍數(shù)首次稀釋，然后以2.5倍倍比稀釋4種稀釋度，以基于細(xì)胞感染的RT-qPCR進(jìn)行輪狀病毒體外感染效力測定。以Ct值對被測物濃度制圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)(r2)≥0.950 0。確定Ct值與被測物濃度呈線性關(guān)系的濃度范圍。

1.7重復(fù)性檢測 使用上述稀釋倍數(shù)的標(biāo)本，采用RT-qPCR分析病毒感染效力。使用5個(gè)型的輪狀病毒特異性引物探針對每個(gè)型進(jìn)行定量檢測，試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)型的每個(gè)稀釋度共得到12個(gè)Ct值，其變異系數(shù)(CV)不超過10%。

2 結(jié) 果

2.1特異性 每個(gè)血清型毒株特異性引物/探針對每個(gè)重配株的單價(jià)培養(yǎng)物進(jìn)行RT-qPCR來確定方法的特異性。每對引物/探針都應(yīng)選擇性地使G1、G2、G3、G4和G9重配株的VP7基因片段序列擴(kuò)增。所有引物/探針對其特異型擴(kuò)增的Ct值與其對其他型擴(kuò)增的Ct值比較，選擇性差異≥210倍。對其他型擴(kuò)增的Ct值≥35或無擴(kuò)增(圖1)。

圖1 特異性擴(kuò)增曲線

表2 不同稀釋倍數(shù)和Ct值的線性相關(guān)系數(shù)(r2)

檢測次數(shù)G1(6.93～0.44×105CCID50/mL)G2(7.00～0.45×105CCID50/mL)G3(11.70～0.75×105CCID50/mL)G4(26.40～1.69×105CCID50/mL)G9(23.00～1.47×105CCID50/mL)10.990 70.995 20.977 60.952 30.975 820.993 10.993 30.960 30.936 50.975 830.993 90.990 00.949 50.964 30.997 6均值0.992 60.992 80.962 50.951 00.983 1

檢測次數(shù)G1(2.77～0.18×105CCID50/mL)G2(2.80～0.18×105CCID50/mL)G3(4.69～0.30×105CCID50/mL)G4(10.56～0.68×105CCID50/mL)G9(9.20～0.59×105CCID50/mL)10.995 80.974 30.999 10.991 40.997 920.990 90.988 40.988 60.986 20.993 430.986 20.980 20.991 70.996 80.999 2均值0.991 00.981 00.993 10.991 50.996 8

2.2線性和范圍 當(dāng)使用全部5種稀釋度的檢測數(shù)值進(jìn)行計(jì)算時(shí)，G1、G2、G3、G4、G9型的稀釋倍數(shù)和Ct值的線性r2為0.957 6～0.993 5；當(dāng)使用前4種稀釋度的檢測數(shù)值進(jìn)行計(jì)算時(shí)，G1、G2、G3、G4、G9型的稀釋倍數(shù)和Ct值的線性r2為0.951 0～0.992 8；當(dāng)使用后4種稀釋度的檢測數(shù)值進(jìn)行計(jì)算時(shí)，G1、G2、G3、G4、G9型的稀釋倍數(shù)和Ct值的線性r2為0.981 0～0.996 8(表2)。

2.3重復(fù)性 如表3所示，G1、G2、G3、G4、G9型重配株第1、2、3天重復(fù)檢測結(jié)果的CV值為0.65%～6.71%、0.72%～10.10%、0.05%～8.10%，不同日間結(jié)果的CV值為2.05%～13.54%，一般認(rèn)為重復(fù)性尚好(CV<15%)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同一日重復(fù)檢測結(jié)果和日間結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.917、0.746)。不同稀釋度間的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，說明本研究中選擇的稀釋度可以有效反映不同感染劑量的病毒復(fù)制。不同血清型之間的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.345)，說明各個(gè)血清型的疫苗毒株感染MA104細(xì)胞后具有相似的復(fù)制特征。

表3 重復(fù)性檢測結(jié)果

3 討 論

對于經(jīng)黏膜途徑感染的病毒來說，與天然病毒具有相同感染和復(fù)制方式的減毒活疫苗仍然是最有效的激發(fā)機(jī)體免疫保護(hù)的方式[11]。對于其他可經(jīng)傳統(tǒng)方法制備的滅活病毒疫苗來說，生產(chǎn)工藝中也必然少不了存在活病毒的滅活前階段[12]。因此，開發(fā)快速、簡便的滴度檢測方法顯得尤為重要。本研究初步建立了一種快速、靈敏、特異的檢測多價(jià)輪狀病毒減毒活疫苗病毒滴度的技術(shù)，該方法對其他腸道病毒(CA16、EV71和脊髓灰質(zhì)炎病毒)無擴(kuò)增，特異性符合要求；當(dāng)使用前4種稀釋度的檢測數(shù)值進(jìn)行計(jì)算時(shí)，5種型別的稀釋倍數(shù)和Ct值的線性r最高，均在0.980 0以上，故選擇前4種稀釋度作為該方法的線性和范圍；重復(fù)性檢測結(jié)果顯示，該方法在同一工作日內(nèi)和不同工作日間均能得到差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，重復(fù)性符合要求；不同稀釋度和不同血清型之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果也顯示該方法在線性和范圍內(nèi)可有效反映不同病毒株的復(fù)制情況。因此，該方法具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

另外，輪狀病毒流行株因地區(qū)和年份而不同，G1、G2、G3、G4、G9型構(gòu)成了我國的主要流行株[11]，G8型也時(shí)有檢出[12]。我國多家企業(yè)都在進(jìn)行多價(jià)輪狀病毒疫苗的研發(fā)。多價(jià)輪狀病毒疫苗是以動(dòng)物來源的輪狀病毒為母本，是將其主要抗原成分VP7和/或VP4替換成人源輪狀病毒的相應(yīng)組分制備而成的。正是多價(jià)疫苗各個(gè)毒株之間的這種微小差異(主要抗原成分不同)，使多價(jià)疫苗的鑒別和效力檢測需要用到型別特異性單克隆抗體[4-6]。但是基于特異性單克隆抗體的檢測方法存在多種影響檢測結(jié)果和操作過程的因素，不利于多價(jià)疫苗產(chǎn)品的精準(zhǔn)配制和生產(chǎn)全過程的質(zhì)量控制。與基于特異性單克隆抗體的檢測方法相比，一步法熒光定量PCR不僅縮短了檢測時(shí)間，而且極大地減少了操作步驟，使檢測結(jié)果具有更好的一致性和客觀性。另外，該方法還具有以下2個(gè)方面的優(yōu)勢，一是該方法建立在細(xì)胞感染的基礎(chǔ)上，疫苗中的活病毒得以復(fù)制和擴(kuò)增，而死病毒無法復(fù)制，最終檢測結(jié)果能夠客觀反映病毒滴度；二是整個(gè)操作過程省去了核酸提取的步驟，避免了核酸提取步驟中存在的核酸損失情況造成的誤差。

本研究在進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證時(shí)，臨時(shí)使用了質(zhì)粒參考品，但是在正式使用過程中，需要制備一批性質(zhì)均一，且能長期穩(wěn)定保存的標(biāo)準(zhǔn)疫苗作為標(biāo)準(zhǔn)品對待測品進(jìn)行賦值[8-9]，從而可以在疫苗生產(chǎn)工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)(包括病毒液的收獲時(shí)間、半成品及成品的配制等)進(jìn)行生產(chǎn)指導(dǎo)和質(zhì)量控制。

4 結(jié) 論

對于病毒疫苗的質(zhì)量控制來說，滴度或者效價(jià)的檢測是最重要的指標(biāo)。RT-qPCR的建立和后續(xù)的適用性研究將為滴度或者效價(jià)檢測提供簡便、快速的方法，將更加有利于不同企業(yè)生產(chǎn)的相同品種的病毒疫苗之間結(jié)果的可比性研究。