β桐酸對人絨毛膜上皮癌JEG-3細胞凋亡的影響

趙婉茹,謝煜萍,王際輝,王 晗,*(.大連工業(yè)大學生物工程學院,遼寧大連 604;.大連工業(yè)大學食品學院,遼寧大連 604;.東莞理工學院化學工程與能源技術(shù)學院,廣東東莞 5808)

共軛脂肪酸(conjugated fatty acids,CFA)是一類具有共軛雙鍵的脂肪酸異構(gòu)體,常見的共軛脂肪酸有共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)和共軛亞麻酸(conjugated linoleinc acid,CLnA),具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂代謝、提高免疫力等功效[1-6]。CLnA是一類共軛十八碳三烯酸的異構(gòu)體,與CLA相比具有更強的生物活性[7-8]。β-桐酸即反9、反11、反13-十八碳三烯酸(t9、t11、t13-18∶3)主要存在于桐油中,少量存在于梓樹籽油和苦瓜籽油中。其具有全反式共軛雙鍵,比非全反式的α-桐酸具有更強的細胞毒性[7,9]。有研究發(fā)現(xiàn),β-桐酸對結(jié)腸癌Caco-2細胞、膀胱癌T24細胞具有凋亡誘導作用[9-10]。但是,目前β-桐酸對人絨毛膜上皮癌細胞的作用尚不明確。

人絨毛膜上皮癌是一種來源于胚胎滋養(yǎng)層細胞的惡性腫瘤,病發(fā)人群主要是處于生育年齡期的婦女,發(fā)病快,轉(zhuǎn)移范圍廣,死亡率高[11-15]。目前的治療方法以化療為主,手術(shù)為輔,雖然能夠使病情得到改善,致死率降低,然而化療副作用大,且患者容易對化療藥產(chǎn)生耐藥性[16]。而食品來源的活性物質(zhì)具有毒副作用小等特點,因此,研究苦瓜籽油等來源的β-桐酸對絨癌細胞凋亡的影響,可以為絨癌的輔助治療提供實驗依據(jù)。

ROS的產(chǎn)生在誘導癌細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[17-21]。ROS水平的降低,會促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤生長[22-23]。多數(shù)源自天然產(chǎn)物的抗腫瘤化合物可通過升高ROS水平誘導腫瘤細胞凋亡[24-25]。因此,ROS可以作為抗癌輔助研究的重要突破口[26]。因此,本實驗以體外培養(yǎng)的絨癌JEG-3細胞為實驗對象,分析了β-桐酸處理對JEG-3細胞凋亡的影響,并初步探討了β-桐酸誘導JEG-3細胞凋亡與ROS產(chǎn)生的關(guān)系,為β-桐酸作為功能性食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-桐酸(純度≥98%) 瑞典Larodan Fine Chemicals股份有限公司;人絨毛膜上皮癌JEG-3細胞 中國科學院上海細胞所;DMEM高糖細胞培養(yǎng)基 賽默飛世爾生物化學制品公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) 英國Gibco公司;胰蛋白酶 美國Invitrogen公司;四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、α-亞麻酸 美國Sigma公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;抗β-actin、抗Bcl-2、抗Bax鼠單克隆抗體、抗Caspase-3兔多克隆抗體 美國Santa Cruz生物技術(shù)公司;辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG 北京中衫生物公司;2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,H2DCFDA)活性氧標記、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine,NAC)、Annexin V/PI凋亡試劑盒 江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

CO2恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋電機株式會社;酶標儀 芬蘭Thermo Fisher公司;流式細胞儀 美國貝克曼公司;電泳儀 大連競邁生物科技有限公司;倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司;熒光分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將絨癌JEG-3細胞從-80 ℃冰箱取出,迅速放入37 ℃水中解凍,待全部融化后補加培養(yǎng)基并混勻,將細胞懸浮液以1500 r/min離心4 min,棄上清并重懸于含有10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)于37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱。細胞密度達到80%～90%進行傳代培養(yǎng)。吸出培養(yǎng)基,PBS洗滌細胞兩次并在37 ℃下用0.25%的胰蛋白酶消化,觀察到細胞微微皺縮立即加入培養(yǎng)基終止消化,反復吹打使細胞完全脫落。1500 r/min離心4 min,棄上清加入新培養(yǎng)基混勻放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2 d換液,3～4 d傳代。細胞傳代三次后用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞相對活力測定 分別將α-亞麻酸和β-桐酸溶解在乙醇中,將JEG-3細胞(1×103cell/孔)接種在96孔板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基并分別加入不同濃度梯度的α-亞麻酸和β-桐酸,使其最終濃度達到20、40、60 μmol/L,以僅添加相同體積的溶劑乙醇組為空白組,以α-亞麻酸為陽性對照,培養(yǎng)24 h;此外,β-桐酸實驗組更換培養(yǎng)基后分別加入β-桐酸使其終濃度為20、40、60 μmol/L,同時按前文設(shè)立空白組,分別培養(yǎng)24、36、48 h。培養(yǎng)結(jié)束后除去培養(yǎng)液,每孔加入MTT溶液(0.5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h。棄上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),室溫下振蕩10 min,在570 nm處測量吸光度。

細胞相對活力(%)=實驗組OD值×100/空白對照組OD值

1.2.3 通過LDH測定分析細胞的細胞毒性 將JEG-3細胞(1×103cell/孔)接種到96孔板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使終濃度達到20、40、60 μmol/L,同時按1.2.2設(shè)立空白組,在培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)24 h。吸取細胞培養(yǎng)上清,按照說明書操作,配置空白孔、標準孔、測定孔、對照孔,混勻后室溫下放置5 min,待反應結(jié)束后,在450 nm處測量吸光度值。當細胞凋亡時,細胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞,細胞內(nèi)LDH釋放到細胞培養(yǎng)液中,乳酸在LDH作用下生成丙酮酸,丙酮酸和2,4-二硝基苯肼生成紅棕色的丙酮酸二硝基苯腙。通過檢測LDH活性,實現(xiàn)對細胞毒性的定量分析。

LDH活力(U/L)=(測定OD-對照OD)/(標準OD-空白OD)×標準品濃度(0.2 mmol/L)×1000

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)測定凋亡率 將對數(shù)期的JEG-3細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使終濃度為20、40、60 μmol/L,同時按1.2.2設(shè)立空白組,培養(yǎng)24 h,收集細胞,PBS洗滌兩次后將細胞以5×105cell/mL的濃度重懸于500 μL 的Annexin V結(jié)合緩沖液中,并添加5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶溶液(PI),充分混勻后,室溫下避光孵育10 min。利用流式細胞儀檢測,用Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析,每次計數(shù)10000個細胞,計算并分析凋亡率。

凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)×100/總細胞數(shù)

1.2.5 蛋白免疫印跡分析 取生長對數(shù)期的細胞接種于6孔(2×105cell/孔)細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使終濃度為20、40 μmol/L,同時按1.2.2設(shè)立空白組,培養(yǎng)細胞24 h。冰上提取細胞蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,室溫下封閉1 h。PBST與封閉液(5%脫脂奶粉)1∶1混合為一抗稀釋液,按1∶500比例分別稀釋β-actin、Bcl-2以及Bax的抗鼠單克隆抗體和Caspase-3的抗兔多克隆抗體,與膜上蛋白在4 ℃過夜孵育。按照1∶5000的比例用PBST稀釋辣根酶標記的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG,室溫孵育1 h。ECL顯影液顯色,凝膠成像儀拍照并記錄實驗結(jié)果進行分析。

1.2.6 細胞內(nèi)ROS的檢測 取對數(shù)期的JEG-3細胞,調(diào)整濃度(1×104cell/mL)并接種2 mL于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使其終濃度為20、40 μmol/L,同時按1.2.2設(shè)立空白組,培養(yǎng)24 h后,除去細胞培養(yǎng)液與終濃度10 μmol/L的DCFH-DA在培養(yǎng)箱中共同孵育30 min。細胞用PBS洗兩次后,通過熒光顯微鏡,觀察細胞內(nèi)ROS水平的變化。此外,利用熒光分光光度計,在激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm下對各實驗組的DCF發(fā)射的熒光強度進行測定。

1.2.7 NAC拮抗β-桐酸抑制JEG-3細胞活力 將JEG-3細胞(1×103cell/孔)接種在96孔板過夜培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使其終濃度為20、40 μmol/L,同時按1.2.2設(shè)立空白組、NAC組(僅添加5 mmol/L NAC)、β-桐酸+NAC組(20、40 μmol/Lβ-桐酸處理同時分別添加5 mmol/L NAC)培養(yǎng)24 h后測定吸光度。

細胞相對活力(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 β-桐酸對JEG-3細胞相對活力的影響

應用MTT實驗測定不同劑量的β-桐酸和α-亞麻酸(0～60 μmol/L)處理JEG-3細胞24 h后細胞相對活力的變化。結(jié)果如圖1a所示,與空白組相比,β-桐酸處理組細胞相對活力顯著降低(P<0.05),隨著作用濃度增加,β-桐酸對JEG-3細胞活力的抑制作用逐漸加強。不同劑量的β-桐酸(0～60 μmol/L)處理JEG-3細胞不同時間,細胞相對活力變化的結(jié)果見圖1b,隨著β-桐酸作用時間和濃度的增加,細胞相對活力顯著降低(P<0.05),β-桐酸對JEG-3細胞活力的抑制作用逐漸加強,表明β-桐酸對JEG-3細胞活力的抑制作用呈明顯的時間和劑量依賴性。β-桐酸在濃度 20 μmol/L、處理時間24 h的條件下,即可顯著降低JEG-3細胞的相對細胞活力,更高的作用濃度和更長的作用時間可使細胞的相對活力下降更為明顯(60 μmol/L,處理48 h細胞相對活力約為空白組的1/5),初步證實了植物來源的β-桐酸對人絨毛膜上皮癌JEG-3細胞活力的抑制作用。

圖1 β-桐酸對JEG-3細胞活力的影響Fig.1 Effect of β-eleostearic acid on the cell vialility of JEG-3 cells注:a:β-桐酸和α-亞麻酸處理后JEG-3細胞的細胞相對活力比較,b:β-桐酸處理JEG-3細胞不同時間后的細胞相對活力變化;*表示與空白組相比差異顯著(P<0.05);圖2、圖4、圖7同。

2.2 β-桐酸促進JEG-3細胞LDH的釋放

為了進一步分析β-桐酸對JEG-3細胞的毒性作用,對細胞培養(yǎng)基上清中LDH的酶活性進行了檢測。結(jié)果如圖2所示,與空白組相比,β-桐酸處理24 h后的JEG-3細胞,LDH活力顯著上升(P<0.05),β-桐酸的濃度由20 μmol/L增加到60 μmol/L時,酶活力從191.8 U/L上升至283.3 U/L,說明β-桐酸促進LDH的釋放,對JEG-3細胞具有明顯的細胞毒性。由于LDH釋放到培養(yǎng)液中說明細胞損傷導致細胞膜通透性變化,因此,結(jié)果提示β-桐酸對JEG-3細胞相對細胞活力的抑制與細胞損傷有關(guān)。

圖2 β-桐酸對JEG-3細胞LDH釋放的影響Fig.2 Effect of β-eleostearic acid on LDH release of JEG-3 cells

2.3 流式細胞術(shù)分析β-桐酸對JEG-3細胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染法,并利用流式細胞術(shù)檢測β-桐酸對JEG-3細胞凋亡的影響。Annexin V-FITC染色呈陽性且PI染色呈陰性,即右下象限為凋亡早期細胞,Annexin V-FITC染色和PI染色呈雙陽性,即右上象限為凋亡晚期細胞。如圖3所示,β-桐酸處理JEG-3細胞24 h后,隨著β-桐酸濃度的增加,凋亡的JEG-3細胞明顯增多。對凋亡率做出統(tǒng)計得到圖4,結(jié)果表明隨著β-桐酸濃度的增加,JEG-3細胞的凋亡率隨之顯著增加(P<0.05)。當β-桐酸的濃度為20 μmol/L時,凋亡率為34.4%,與空白組相比具有顯著性差異;濃度為40 μmol/L時,細胞凋亡率達到55.4%,濃度達到60 μmol/L時,凋亡率則高達73.93%,提示β-桐酸能夠誘導JEG-3細胞凋亡。結(jié)合β-桐酸對JEG-3細胞相對活力及LDH釋放的影響,推測β-桐酸可能通過對細胞凋亡的誘導作用,引起細胞損傷。

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測JEG-3細胞凋亡Fig.3 JEG-3 cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining method注:A:control組;B:20 μmol/L β-桐酸組;C:40 μmol/L β-桐酸組;D:60 μmol/L β-桐酸組。

圖4 β-桐酸對JEG-3細胞凋亡率的影響Fig.4 The effect of β-eleostearic acid on the apoptosis rate of JEG-3 cells

2.4 蛋白免疫印跡檢測β-桐酸對JEG-3細胞調(diào)亡相關(guān)蛋白表達的影響

為了進一步分析β-桐酸誘導JEG-3細胞凋亡的作用機制,采用蛋白免疫印跡法,檢測β-桐酸處理JEG-3細胞后,凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、Bax、Bcl-2)在細胞中的表達。由于高濃度和長時間處理有可能導致更多的體外培養(yǎng)細胞在誘導凋亡后出現(xiàn)細胞死亡、碎裂,干擾相關(guān)機制的研究[27-29],而低、中濃度β-桐酸(20和40 μmol/L)處理JEG-3細胞24 h后,細胞凋亡率與空白組相比即具有顯著性差異,因此選擇此條件進行以下相關(guān)機制的研究。結(jié)果如圖5所示,經(jīng)過20和40 μmol/Lβ-桐酸處理后,JEG-3細胞Caspase-3的表達水平與空白組相比明顯上調(diào),同時,促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的比值(Bax/Bcl-2)也隨之增加。證實β-桐酸能夠促進JEG-3細胞的凋亡過程。在細胞凋亡的內(nèi)源途徑中,線粒體膜通透性的改變主要受到Bcl-2蛋白家族的調(diào)控。β-桐酸處理后JEG-3細胞Bax/Bcl-2比值的增加提示β-桐酸誘導JEG-3細胞凋亡的作用可能與其通過內(nèi)源途徑影響線粒體膜通道的開啟有關(guān)。

圖5 β-桐酸對JEG-3細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2表達的影響Fig.5 Effects of β-eleostearic acid on the expression of Caspase-3,Bax and Bcl-2 of JEG-3 cells

2.5 β-桐酸對JEG-3細胞ROS產(chǎn)生的影響

應用活性氧標記熒光染料H2DCFDA,利用熒光顯微鏡和熒光分光光度計檢測細胞內(nèi)ROS的水平,分析β-桐酸對JEG-3細胞產(chǎn)生ROS的影響。圖6結(jié)果顯示,與空白組相比,β-桐酸處理組JEG-3細胞內(nèi)ROS水平明顯增強。熒光分光光度分析結(jié)果如圖7所示,經(jīng)β-桐酸處理后的JEG-3細胞內(nèi)ROS水平明顯上升,證實β-桐酸可以誘導JEG-3細胞產(chǎn)生ROS,提示ROS的產(chǎn)生可能與β-桐酸對JEG-3的誘導凋亡作用有關(guān)。

圖6 熒光顯微鏡觀察β-桐酸對JEG-3細胞的ROS水平的影響Fig.6 Effect of β-eleostearic acid on ROS level in JEG-3 cells by fluorescence microscopy注:A:control組;B:20 μmol/L β-桐酸組;C:40 μmol/L β-桐酸組。

圖7 熒光分光光度法檢測β-桐酸對JEG-3細胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.7 Effect of β-eleostearic acid on ROS level of JEG-3 cells by fluorescence spectrophotometry

2.6 NAC拮抗β-桐酸對JEG-3細胞活力的抑制作用

為了進一步驗證ROS在β-桐酸抑制JEG-3細胞活力中的作用,聯(lián)合應用ROS抑制劑NAC和MTT實驗,分析ROS在β-桐酸抑制JEG-3細胞活力過程中的作用。結(jié)果如圖8所示,20和40 μmol/Lβ-桐酸對JEG-3細胞進行處理后,細胞相對活力顯著下降(P<0.05)。單獨NAC作用后,與空白組相比細胞相對活力沒有顯著差異。但是,與β-桐酸相比，在β-桐酸和NAC共同作用下,細胞相對活力顯著上升,提示β-桐酸對JEG-3細胞活力抑制作用可能與ROS的產(chǎn)生有關(guān)。有研究表明,β-桐酸能夠通過影響ROS的產(chǎn)生誘導膀胱癌T24細胞的凋亡[27]。α-金盞花酸和β-金盞花酸(植物來源的兩種共軛亞麻酸異構(gòu)體)影響JEG-3細胞凋亡的作用也與ROS的產(chǎn)生有關(guān)[28]。本實驗的結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,進一步提示了植物來源共軛亞麻酸通過調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生誘導腫瘤細胞凋亡的可能機制。

圖8 NAC拮抗β-桐酸誘導的JEG-3細胞活力抑制作用Fig.8 NAC antagonizes the cell vialility inhibition of JEG-3 cells induced by β-eleostearic acid注:*表示與空白組相比有顯著差異(P<0.05);#表示與β-桐酸組比較有顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

本文研究發(fā)現(xiàn),β-桐酸對體外培養(yǎng)的人絨毛膜上皮癌JEG-3細胞的活力有明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)明顯的劑量、時間依賴性。β-桐酸能夠明顯促進JEG-3細胞LDH的釋放,對細胞有明顯的毒性作用,進一步證實β-桐酸對JEG-3細胞的損傷。流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示β桐酸顯著促進JEG-3細胞凋亡,蛋白免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn),β桐酸能夠上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達水平,增加Bax/Bcl-2的表達比例,證實β-桐酸具有誘導JEG-3細胞凋亡的作用。β-桐酸可以促進JEG-3細胞ROS的產(chǎn)生,ROS抑制劑NAC拮抗β-桐酸對JEG-3細胞活力的抑制作用,提示β-桐酸對人絨毛膜上皮癌JEG-3細胞的影響可能與其調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生有關(guān)。本實驗為人絨毛膜上皮癌的輔助治療研究及拓展β-桐酸的應用范圍奠定了實驗基礎(chǔ)。但是,本研究僅對β-桐酸抑制JEG-3細胞及誘導細胞凋亡的作用機制進行了初步探討,其相關(guān)的分子機制仍有待在今后的實驗中進行深入的研究。此外,雖然本研究在體外細胞實驗中證明了β-桐酸對JEG-3細胞的凋亡誘導作用,但β-桐酸在體內(nèi)環(huán)境下對人絨毛膜癌細胞的作用仍需進一步的實驗動物模型來證實。