黃山貢菊抗氧化活性成分提取工藝優(yōu)化與HPLCMS分析

劉德明,朱詩(shī)敏,楊昊坤,周 軍,董新榮,*(.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 408;.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 408)

菊花為菊科菊屬植物菊(DendranthemamorifoliumRamat.)的干燥頭狀花序,始載于《神農(nóng)本草》,列為上品,認(rèn)為具有“久服利血?dú)?輕身,耐老延年”之功效?！吨袊?guó)藥典》收載了亳菊、滁菊、貢菊、杭菊等品種[1]。菊花還是2009年衛(wèi)生部首批批準(zhǔn)的藥食同源的植物,也是僅次于茶葉和咖啡的第三大飲品[2]。菊花中主要含有綠原酸類和黃酮類、三萜類、揮發(fā)油等有效成分[3-6],具有防治冠心病、降低血壓、預(yù)防高血脂、抗菌、抗病毒、抗炎、抗衰老等多種藥理活性[2-3,7]。黃山貢菊(DendranthemaMorifolium(Ramat)Tzvel. Gongju),俗稱“徽菊”,既有觀賞價(jià)值,又有藥用功能,為藥食兩用之佳品[8]。隨著藥學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,針對(duì)貢菊的研究工作也逐漸展開,已經(jīng)證實(shí)了其具備抗炎作用[9],抗氧化作用[10-11],抗腫瘤作用[12]等廣泛的藥理作用。

現(xiàn)代研究表明,自由基及活性氧是引起多種疾病(如心臟病、癌癥等)和機(jī)體衰老的重要因素[13-14],這引發(fā)了人們對(duì)天然抗氧化活性成分的濃厚興趣[15-18]。應(yīng)用較多的篩選抗氧化劑的方法主要有總抗氧化力(FRAP法)及清除自由基(DPPH法)等方法[16,19]。黃山貢菊富含多種活性成分,其中主要包括黃酮及其苷類、揮發(fā)油類、有機(jī)酸及其酯類、三萜類及植物甾醇等化合物,這些物質(zhì)具有較好的去除自由基及抗氧化作用[20]。

目前,關(guān)于菊花的研究主要集中于化學(xué)成分的提取[21]、分離[22]及含量分析[23]等傳統(tǒng)方法,而關(guān)于菊花抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)方面的研究報(bào)道較少[24]。但中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)整體、協(xié)同的理念。近年來(lái)高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜如UPLC-ESI-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)在中藥化學(xué)成分的鑒定方面顯現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)[24-25]。本文旨在采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃山貢菊抗氧化活性成分的提取工藝條件,并進(jìn)一步利用HPLC-MS分析其具備抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ),為黃山貢菊的藥食同源應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

黃山貢菊 食品級(jí),購(gòu)自恒熠花茶銷售有限公司;三吡啶三吖嗪(TPTZ) AR,Adamas 試劑公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) AR,上海藍(lán)季生物有限公司;甲醇、乙醇、硫酸、冰醋酸等 均為上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的分析純?cè)噭?/p>

DYF-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;TP-120A電子天平 湘儀天平儀器設(shè)備有限公司;ATY124分析天平 日本島津公司;SB25-12DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;DK-S28型電子恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;UV-2450可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃山貢菊抗氧化活性成分的提取工藝 稱取1.00 g貢菊粉末于100 mL錐形瓶中,加入一定濃度的乙醇水溶液,以一定的液料比超聲輔助提取適當(dāng)時(shí)間時(shí)間,靜置5 min,取上清液以3000 r/min離心10 min,取上清液測(cè)定總抗氧化能力。

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 經(jīng)過(guò)前期試驗(yàn),確定響應(yīng)面因素及水平,采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)以黃山貢菊總抗氧化能力為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)為三因素三水平。因素水平編碼如表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Levels and codes used in response surface methodology

1.2.3 FRAP法測(cè)定總抗氧化能力 參考文獻(xiàn)[16]方法,具體方法如下:準(zhǔn)確稱取適量硫酸亞鐵銨[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O],配制成Fe2+離子儲(chǔ)備液。再配制0.4～2.0 mmol/L Fe2+離子的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。工作液為pH=3.6的醋酸緩沖液20 mL,10 mol/L的TPTZ溶液 2 mL及20.00 mol/L的 FeCl3溶液2 mL混合液,現(xiàn)配現(xiàn)用。移取0.1 mL Fe2+離子濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L溶液于10 mL比色管中,加入6 mL工作液,置于37 ℃水浴30 min。在波長(zhǎng)593 nm下測(cè)定吸光度。以吸光值對(duì)Fe2+離子濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10 μL樣品提取液,按上述方法顯色并測(cè)定吸光值。按回歸方程計(jì)算樣品的總抗氧化能力。

1.2.4 清除DPPH自由基活性 參考文獻(xiàn)[13]的方法。移取100 μL樣品溶液于比色管中,加入濃度為1.5×10-4mol/L的DPPH甲醇溶液2 mL,輕輕振搖使其混合搖勻,置于室溫下的黑暗環(huán)境中反應(yīng)30 min。用可見分光光度計(jì)在517 nm的條件下測(cè)定反應(yīng)物的吸光度值。以DPPH自由基清除能力的百分比計(jì)算去除率。

式(1)

式中,A0,未加入測(cè)試樣品的吸光度;A,樣品的吸光度。

1.2.5 HPLC-MS分析條件 參考文獻(xiàn)[24]方法進(jìn)行試驗(yàn),具體條件如下。

HPLC條件:HPLC為Thermo Vanquish Horizon系統(tǒng)。色譜柱:hypersil gold aQ(100 mm×2.1 mm,1.9 μm),柱溫:35(C;進(jìn)樣量:2 μL。水(含0.1% FA,A)-乙腈(含0.1% FA,B)梯度洗脫:0.0～1.0 min,2% B;11.0 min,20% B;15.0 min,45% B;18.0～20.0 min,98% B;20.1～22.0 min,2% B。流速:0.35 mL/min。

質(zhì)譜條件:MS為Thermo ORBITRAP ID-X系統(tǒng),離子源:ESI源,噴霧電壓:3.8 kV(+)/3.2 kV(-),噴霧溫度:350 ℃;毛細(xì)管溫度:320 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平行三次后取平均值,采用Origin 8.5軟件和Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件

2.1.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 在前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果(本文未列出)的基礎(chǔ)上,以乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)和料液比(C)三個(gè)因素作為響應(yīng)變量,抗氧化活性亞鐵離子當(dāng)量為響應(yīng)值(Y),采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn),結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken experimental design

2.1.2 響應(yīng)面回歸模型與方差分析 運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,以總抗氧化能力(Y)為響應(yīng)值優(yōu)化黃山貢菊抗氧化成分的提取條件。其擬合回歸方程為:

Y=0.65-0.016A+0.032B+0.052C+0.029AB+0.002AC-0.004BC-0.090A2-0.023B2-0.022C2

回歸模型的方差分析見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance for total antioxidant capacity of Gongju extraction

由表3 的方差分析可知,該回歸模型決定系數(shù)R2為0.9225,說(shuō)明該模型與真實(shí)數(shù)據(jù)擬合度良好,試驗(yàn)誤差小?；貧w模型P<0.01,表明該模型極顯著,可用來(lái)分析和預(yù)測(cè)黃山貢菊總還原力提取物的提取條件。失擬項(xiàng)P=0.2337>0.05,不顯著。由表3中顯著性分析結(jié)果可知,因素一次項(xiàng)C對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著(P<0.01),而B對(duì)黃山貢菊總抗氧化能力的影響也相對(duì)較大(P=0.0204<0.05);二次項(xiàng)A2對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著(P<0.01)?；貧w方程的F值顯示各個(gè)因素的變化對(duì)黃山貢菊提取物抗氧化能力的影響依次是料液比(C)>超聲時(shí)間(B)>乙醇濃度(A)。

2.1.3 因素交互作用分析 進(jìn)一步對(duì)影響超聲輔助提取黃山貢菊抗氧化成分的因素進(jìn)行交互作用分析,結(jié)果如圖1所示。

圖1 各因素交互作用對(duì)黃山貢菊總抗氧化能力的影響Fig.1 Response surface and contour plots for the interactive effects of three extraction parameters on total antioxidant capacity of Huangshan Gongju

由圖1可知,乙醇濃度與料液比之間以及乙醇濃度與提取時(shí)間之間的交互作用等高線圖表現(xiàn)為明顯的橢圓形,說(shuō)明兩者之間交互作用顯著;而料液比與超聲時(shí)間之間交互作用的等高線圖呈現(xiàn)圓形,說(shuō)明兩者之間交互作用不顯著。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)響應(yīng)面模型分析,超聲輔助提取黃山貢菊抗氧化活性成分的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度60.52%,超聲時(shí)間 26.13 min,料液比1∶35。在此條件下,黃山貢菊提取物的總抗氧化能力預(yù)測(cè)值可達(dá)到2.010 mmol/L。考慮到實(shí)際操作,對(duì)上述參數(shù)稍微修改為:乙醇濃度60%,超聲時(shí)間25 min,料液比35∶1 (mL/g)。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),得到黃山貢菊提取物的總抗氧化能力為(2.134±0.011) mmol/L(RSD=1.97%,n=3),這與預(yù)測(cè)值能夠很好的吻合。

2.2 黃山貢菊提取物的抗氧化活性

蘆丁為槲皮素的糖苷化合物,廣泛存在于植物體中,具有良好的抗氧化、清除自由基的能力,常用作這類研究的對(duì)照樣品[26]。本文進(jìn)一步比較了不同濃度下的黃山貢菊提取物與蘆丁的總抗氧化活性及清除DPPH自由基的能力,結(jié)果如圖2所示。

圖2 黃山貢菊乙醇提取液濃度對(duì)其抗氧化效果的影響Fig.2 Effect of concentration of ethanol extracts of Huangshan Gongju on antioxidant capacity注：A:總抗氧化力;B:清除DPPH自由基。

由圖2A可知,黃山貢菊提取物的總抗氧化能力與其質(zhì)量濃度具有良好的量-效關(guān)系。當(dāng)黃山貢菊乙醇粗提物的質(zhì)量體積濃度與蘆丁的相近時(shí),其總抗氧化能力為蘆丁的50%左右,即表明黃山貢菊乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

由圖2B可知,黃山貢菊乙醇提取物濃度在7.5～17.5 mg/L時(shí),它對(duì)DPPH自由基的清除率與其質(zhì)量體積濃度間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,說(shuō)明黃山貢菊乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力具有明顯的量-效關(guān)系。當(dāng)提取物濃度達(dá)到17.5 mg/L時(shí),其清除率與蘆丁(20.0 mg/L)的清除率接近。提取物濃度進(jìn)一步上升時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率增加緩慢(清除率已高達(dá)94.81%),這可能說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中的DPPH自由基已基本清除。

2.3 黃山貢菊抗氧化活性成分的HPLC-MS分析

為了探討黃山貢菊乙醇提取物中具有抗氧化作用的主要化學(xué)成分,本文進(jìn)一步對(duì)其提取物進(jìn)行了HPLC-MS分析,總離子流圖如圖3所示。

圖3 HPLC-MS分析總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of HPLC-MS注：A:正離子模式;B:負(fù)離子模式。

通過(guò)HPLC-MS一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)共鑒定出黃酮類、苯丙素類(香豆素類及簡(jiǎn)單苯丙素類)、萜類、綠原酸衍生物等一共113個(gè)化合物,并進(jìn)一步對(duì)含量較高的部分組分進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜分析。主要抗氧化活性成分的分析結(jié)果如表4所示。

表4 黃山貢菊提取物的主要化學(xué)成分Table 4 Main chemical constituents of the ethanol extracts of Huangshan Gongju

續(xù)表

續(xù)表

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,黃酮類、綠原酸類以及香豆素類化合物一般都具有良好的抗氧化活性[27]。本文通過(guò)液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),從菊花抗氧化活性提取物中分離鑒定了黃酮類化合物72,綠原酸及衍生物7個(gè)、香豆素類8個(gè),這些化合物可能是黃山貢菊提取物具備良好的總抗氧化能力與清除DPPH自由基的活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

菊花因品種、產(chǎn)地差異,其活性物質(zhì)含量及種類差異都較大。黃山貢菊因生長(zhǎng)的特殊的地理環(huán)境歷來(lái)被認(rèn)為是菊花茶飲中的上品。但是,對(duì)黃山貢菊抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究鮮見報(bào)道。本文以響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助提取黃山貢菊抗氧化活性成分的工藝條件,進(jìn)一步以FRAP法及DPPH法分析了提取液的總抗氧化能力及清除自由基的能力,以HPLC-MS分析了黃山貢菊提取物的抗氧化活性化學(xué)成分。在乙醇濃度 60%、提取時(shí)間 25 min、液料比35∶1 mL/g的條件下,黃山貢菊提取物的總抗氧化能力為(2.134±0.011) mmol/L(RSD=1.97%,n=3),這與預(yù)測(cè)值(2.010 mmol/L)能夠很好吻合。黃山貢菊提取物以蘆丁為當(dāng)量計(jì)的總黃酮濃度為7.88 mg/L的總抗氧化能力相當(dāng)于2.87 mmol/L亞鐵離子的還原力;而濃度為25.85 mg/L的貢菊提取物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到94.81%。HPLC-MS分析鑒定了黃山貢菊提取物的113個(gè)化合物,主要為黃酮類化合物,以及綠原酸及衍生物和香豆素類。本文為黃山貢菊的藥食同源及茶飲的抗氧化活性成分研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ),并可以為其進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)的藥理作用方面的研究提供理論依據(jù)。