釀酒酵母發(fā)酵混合果汁的功能性研究

岑敏連,陳 陣,Prabhathara de Zoysa,Savindi Kaushalya Edirisinghe,黃 俊,2,朱瑞瑜,2,*(.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 30023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 30023)

真菌毒素已多次在全球范圍引發(fā)了重大的食品安全事件,是人類健康最大的威脅之一[1-3]。棒曲霉素是一種常見的真菌毒素,廣泛存在于谷物、海鮮、堅(jiān)果中,在水果及其制品中尤其常見。棒曲霉素對(duì)人體、動(dòng)物、植物、細(xì)菌等均有毒害作用,短期大量攝入可引起急性中毒,如損傷消化系統(tǒng)、危害肝臟和腎臟等臟器,長期接觸會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷、肺充血、致畸、致癌等遺傳毒性[4-5]。微生物法被認(rèn)為是一種能有效控制棒曲霉素污染的方法,研究報(bào)道Rhizopusisolates能有效地去除棒曲霉素[6];Pichiaohmeri培養(yǎng)2 d對(duì)棒曲霉素的去除率為83%[7];Gluconobacteroxydans處理10 mg/L的棒曲霉素3 d,去除率為84%[8]。然而,絕大多數(shù)已報(bào)道的菌株并非食品級(jí)的微生物,不能直接應(yīng)用到食品生產(chǎn)中。

釀酒酵母是歷史悠久的食品級(jí)發(fā)酵菌株,有研究表明以果汁為原料,經(jīng)釀酒酵母和乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵或二者混合發(fā)酵得到的發(fā)酵果汁,具有調(diào)節(jié)胃腸道、改善營養(yǎng)均衡、抑菌抗氧化、通便和減肥等功效[9]。隨著人們生活水平的提高,肥胖發(fā)生率日益增高,肥胖癥現(xiàn)已成為世界四大醫(yī)學(xué)社會(huì)問題[10]。肥胖不僅影響美觀,甚至?xí)l(fā)心腦血管疾病、癌癥、糖尿病、抑郁癥等一系列的病癥。食療方法被認(rèn)為是安全可靠且易普及的減肥方法之一,其中發(fā)酵果蔬汁以其豐富的營養(yǎng)價(jià)值和功能性成分而備受青睞。

本研究以蘋果、獼猴桃、梨為原料,經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵得到一款新型的混合發(fā)酵果汁,研究了該混合發(fā)酵果汁對(duì)棒曲霉素的去除作用及其降解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的毒性,評(píng)價(jià)混合發(fā)酵果汁的抗氧化能力及對(duì)α-淀粉酶、脂肪酶的抑制效果,探究其潛在的減肥功效,以期為開發(fā)一款新型的功能性發(fā)酵果汁提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果、梨、獼猴桃 均為市售;釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeKD 購于Dibosh;大腸埃希氏菌CMCC44102 海博生物有限公司;乙腈(色譜純) 美國Thermo Fisher Scientific公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 日本TCI公司;α-淀粉酶、ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽) 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉、碘化鉀、碘、淀粉、Tris、對(duì)硝基苯酚、二甲基亞砜 分析純,上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g)、營養(yǎng)酵母葡萄糖液體培養(yǎng)基(小牛浸膏8 g,酵母浸出粉5 g,葡萄糖10 g):121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min;營養(yǎng)酵母葡萄糖液體培養(yǎng)基(NYDB液體培養(yǎng)基):8 g小牛浸膏、5 g酵母浸出粉和10 g葡萄糖溶于1 L蒸餾水,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

UV-5500PC紫外分光光度計(jì) 上海市元析儀器有限公司;Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng) 美國waters公司;SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices;TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;NDK-12W水浴氮吹儀 上海皓莊儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵果汁預(yù)處理 選擇成熟度合適的水果,將獼猴桃、蘋果和梨的果肉(1∶1∶1)與水(果肉:水,w/w)以1∶0.5的比例混合后榨汁,過濾,用0.1 mol/L Na2CO3將pH調(diào)至6.3,90 ℃水浴滅菌25 min。

1.2.2 釀酒酵母在發(fā)酵過程中對(duì)棒曲霉素的降解 挑取斜面保存的釀酒酵母單菌落,接種到NYDB中,28 ℃下,150 r/min培養(yǎng)2 d后,再次將釀酒酵母接種到新鮮NYDB中,28 ℃下,150 r/min培養(yǎng)2 d;將活化兩代的釀酒酵母按終濃度107cfu/mL接種到棒曲霉素含量為2 mg/L的混合果汁中,以加入等濃度棒曲霉素而不加酵母菌的果汁作為對(duì)照,28 ℃下置于180 r/min的搖床中培養(yǎng)3 d,每12 h檢測(cè)棒曲霉素的殘留量。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。

棒曲霉素的檢測(cè)方法參考Zhu等[11]的報(bào)道,并進(jìn)行適當(dāng)修改:采用高效液相色譜系統(tǒng),選取C-18反向色譜柱(Phenomenex 250×4.6 mm,5 μm,USA),流動(dòng)相為水(0.05%乙酸,v/v)和乙腈90∶10 (v/v),流速1 mL/min。檢測(cè)波長為276 nm,柱溫恒定為35 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.3 棒曲霉素降解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的毒性評(píng)估 活化兩代的大腸桿菌分別接種于含0、1、2、10、100 mg/L的棒曲霉素溶液和降解發(fā)酵液的LB培養(yǎng)基中,每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)平行。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱,分別在0、1、2、4、6、8、10 h檢測(cè)培養(yǎng)液在600 nm的吸光值。

1.2.4 混合發(fā)酵果汁功能性評(píng)估 將活化兩代的釀酒酵母接種到混合果汁中,使得終濃度分別為107cfu/mL,置于28 ℃條件下培養(yǎng)6 d,每1 d進(jìn)行取樣測(cè)定。

1.2.4.1 DPPH自由基清除率 參考Blois[12]的方法并略作修改:將200 μL樣品,加水至2 mL,加入到4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液中,再加入450 μL Tris-HCl緩沖液(pH7.4),25 ℃下恒溫水浴30 min。以去離子水為參比溶液,在517 nm下測(cè)定吸光度。

×100

式(1)

式中:A0-空白對(duì)照液的吸光度;A1-樣品測(cè)定管的吸光度;A2-樣品本底管的吸光度。

1.2.4.2 ABTS自由基清除率 參考Karadag等[13]的方法并略作修改,取7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L的過硫酸鉀共25 mL混勻,避光12～16 h,用5 mmol/L PBS稀釋。取30 μL的樣品用上述PBS稀釋至300 μL,再加入5 mL ABTS稀釋液,在30 ℃下,反應(yīng)1 h。以去離子水為參比溶液,在734 nm下測(cè)定吸光度。

×100

式(2)

式中:A0-空白對(duì)照液的吸光度;A1-樣品測(cè)定管的吸光度;A2-樣品本底管的吸光度。

1.2.4.3 還原力 參考Nilsson等[14]的方法并略作修改,將125 μL樣品加PBS緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)至2.5 mL,然后加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀(w/v),混合均勻,50 ℃下反應(yīng)30 min,再加入2.5 mL 10%三氯乙酸(w/v),混合均勻,靜止10 min,立即取2.5 mL上清液,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵(w/v),混合均勻,以去離子水為參比溶液,在700 nm下測(cè)定吸光度。

1.2.5 混合發(fā)酵果汁對(duì)α-淀粉酶、脂肪酶的抑制作用

1.2.5.1 混合發(fā)酵果汁對(duì)α-淀粉酶的抑制作用 參考Watanabe等[15]的方法并作適當(dāng)修改:25 μL 1KNU的淀粉酶溶液加25 μL樣品,反應(yīng)10 min;加入25 μL 1%的淀粉溶液,反應(yīng)30 min;加入160 μL鹽酸終止反應(yīng);加入15 μL 5 mmol/L碘溶液,顯色反應(yīng),在620 nm下測(cè)定吸光度。α-淀粉酶抑制率的測(cè)定按照上述淀粉酶活力的測(cè)定方法。

式(3)

式中:I:抑制率,%;X:α-淀粉酶活力,KNU/mL;X′:抑制后的酶活力,KNU/mL。

1.2.5.2 混合發(fā)酵果汁對(duì)脂肪酶的抑制作用 參考Teng等[16]的方法并稍作修改:0.05 mol/L This-HCl緩沖液(pH=8.0)30 μL、5 mg/mL的酶液30 μL 37 ℃恒溫預(yù)熱15 min,加入到15 μL的底物溶液中,搖床15 min,加入150 μL 0.5 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng),加入50 μL 0.5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH,以未加脂肪酶溶液的空白為對(duì)照,在405 nm下測(cè)定吸光度。參照對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線,可求得對(duì)硝基苯酚的濃度。

X=cV/tV′

式(4)

式中:X:脂肪酶活力,U/mL;c:對(duì)硝基苯酚濃度,mmol/L;V:反應(yīng)體系總體積,mL;t:反應(yīng)時(shí)間,min;V′:酶用量,U/mL。脂肪酶抑制率的測(cè)定按照上述脂肪酶活力的測(cè)定方法。

式(5)

式中:I:抑制率,%;X:脂肪酶活力,U/mL;X′:抑制后酶活力,U/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,采用Duncan法進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05),采用Origin 8.0和Excel軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中釀酒酵母對(duì)棒曲霉素的降解作用

棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色圖譜如圖1所示,釀酒酵母在發(fā)酵混合果汁過程中對(duì)棒曲霉素的降解情況如圖2所示,混合果汁發(fā)酵12 h后,釀酒酵母對(duì)棒曲霉素的降解率達(dá)到了55%,發(fā)酵72 h后降解率接近100%。

圖1 棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of patulin standard

圖2 釀酒酵母在發(fā)酵果汁中對(duì)棒曲霉素的降解Fig.2 Degradation of patulin by S. cerevisiae in fermented juice

2.2 棒曲霉素降解產(chǎn)物的毒性

將棒曲霉素加入到E.coli的培養(yǎng)基中,隨著棒曲霉素濃度的升高,E.coli的生長受抑制程度越明顯(圖3)。當(dāng)棒曲霉素含量為2 mg/L時(shí),即對(duì)E.coli的生長產(chǎn)生了顯著的抑制作用,而同濃度下棒曲霉素的降解產(chǎn)物對(duì)E.coli的生長沒有任何影響。

圖3 棒曲霉素及其降解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的毒性Fig.3 Toxicity of patulin and its degradation product to E.coli

Ianiri等[17]發(fā)現(xiàn)酵母Sporobolomycessp對(duì)棒曲霉素有去除作用,處理3 d后降解率達(dá)90%。另據(jù)報(bào)道,紅冬孢酵母Rhodosporidiumpaludigenum可在3 d內(nèi)完全去除培養(yǎng)基中的棒曲霉素[18];用畢赤酵母Pichiacaribbica處理棒曲霉素,15 d后去除率為80%[19]。然而以上報(bào)道的菌株并非食品級(jí)微生物,即便能降解棒曲霉素卻不能直接應(yīng)用到食品中,且有些菌株對(duì)棒曲霉素的去除效率并不高。釀酒酵母是歷史悠久的食品發(fā)酵微生物,圖2、圖3的結(jié)果顯示釀酒酵母KD可高效降解果汁中的棒曲霉素,且降解產(chǎn)物的毒性大大下降,有利于保障食品安全。

2.3 混合果汁發(fā)酵過程中DPPH、ABTS自由基清除率、還原力的變化

由圖4可知,與新鮮的果汁相比,混合發(fā)酵果汁的DPPH自由基清除率在發(fā)酵過程中呈先上升后下降趨勢(shì),在發(fā)酵第4 d達(dá)到最高,清除率為60.3%,較新鮮果汁提高了15.0%。

圖4 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化Fig.4 DPPH free radical scavenging rate during fermentation注:對(duì)照為未發(fā)酵的新鮮果汁,不同字母表示有顯著性差異(P<0.05);圖5～圖8同。

在發(fā)酵過程中,ABTS自由基清除率整體呈上升趨勢(shì)(圖5),發(fā)酵5 d迅速上升至84.3%，較新鮮果汁增長了45.9%。

圖5 發(fā)酵過程中ABTS自由基清除率的變化Fig.5 ABTS free radical scavenging rate during fermentation

混合果汁發(fā)酵過程中還原力的變化如圖6所示。發(fā)酵前2 d果汁的還原力顯著上升(P<0.05),發(fā)酵6 d后果汁的還原力較新鮮果汁提高了10.6%,整個(gè)發(fā)酵期間還原力呈上升的趨勢(shì)。

圖6 發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.6 Reducing power during fermentation

由圖4～圖6可知,發(fā)酵后果汁的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和還原力等指標(biāo)相較新鮮果汁均顯著提高,表明果汁在發(fā)酵過程中抗氧化活性得到顯著增強(qiáng)(P<0.05)。有不少研究報(bào)道,發(fā)酵蘋果汁的抗氧化能力(DPPH、ABTS自由基清除能力以及還原力)較新鮮蘋果汁顯著提高(P<0.05),且抗氧化能力的變化和發(fā)酵過程中總酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)和有機(jī)酸等物質(zhì)的含量變化有關(guān)[20-24]。如范昊安等[25]發(fā)現(xiàn),蘋果梨酵素發(fā)酵過程中,ABTS自由基清除率和還原力與總酚、總黃酮、檸檬酸含量之間均存在極顯著的正相關(guān)(P<0.01)。在果汁發(fā)酵過程中,微生物會(huì)把大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)換成小分子酚類物質(zhì),使是酚類物質(zhì)的總含量增加[26]。Fereidoon等[27]認(rèn)為酚類物質(zhì)給出的H+易與DPPH自由基發(fā)生反應(yīng)形成穩(wěn)定化合物,從而提高了榛子產(chǎn)品的DPPH清除率及抗氧化能力。此外,還有研究表明ABTS自由基清除能力和還原力與總酚類物質(zhì)芳香環(huán)的數(shù)量、分子質(zhì)量和羥基取代基的性質(zhì)相關(guān)[28-30]。Haslsm[31]認(rèn)為芳香環(huán)上的羥基負(fù)責(zé)抗氧化活性前體物質(zhì)的形成。而課題組前期的研究表明,釀酒酵母發(fā)酵果汁的總酚含量相較于新鮮果汁有顯著的提高[32]。這與其他科研成果的報(bào)道相符,也從一個(gè)方面解釋了本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 混合發(fā)酵果汁對(duì)α-淀粉酶、脂肪酶的抑制作用

碳水化合物對(duì)肥胖和健康的影響很大,低碳水化合物的的飲食更符合健康的要求[33]。然而,中國人的主食,如米飯、面條等均以淀粉為主要成分。如圖7所示,發(fā)酵果汁對(duì)α-淀粉酶的抑制作用相比新鮮果汁顯著增強(qiáng),且在發(fā)酵過程中呈上升趨勢(shì),表明發(fā)酵果汁可顯著抑制α-淀粉酶活力(P<0.05)。市面上常見減肥藥阿卡波糖(0.2 mg/mL)對(duì)淀粉酶活力的抑制率為40.2%,發(fā)酵4 d的果汁可達(dá)到與之相同的抑制效果。發(fā)酵6 d的果汁對(duì)α-淀粉酶的抑制作用最強(qiáng),抑制率達(dá)到了52.4%。有研究表明微生物代謝產(chǎn)生的含N碳水化合物和一些分子量為3936～8500 Da之間的聚合肽具有抑制α-淀粉酶活力的效果[34]。由此推測(cè)釀酒酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的某些代謝物也可能是引起α-淀粉酶活力下降的原因。

圖7 發(fā)酵果汁對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of fermented fruit juice on α-amylase注:對(duì)照為未發(fā)酵的新鮮果汁,陽性對(duì)照為0.2 mg/mL的阿卡波糖。

脂肪酶的功能是催化甘油三酯水解成脂肪酸和甘油,可通過抑制脂肪酶的活性,降低人體對(duì)過多供給的甘油三酯的吸收利用,從而達(dá)到減肥的效果[35]。如圖8所示,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,發(fā)酵果汁對(duì)脂肪酶的抑制效果顯著增強(qiáng),在發(fā)酵6 d達(dá)到了45.2%;而陽性對(duì)照,奧利司他(0.2 mg/mL)對(duì)脂肪酶的抑制率為29.4%。表明發(fā)酵果汁對(duì)脂肪酶的抑制效果顯著強(qiáng)于減肥藥奧利司他(P<0.05)。有研究結(jié)果認(rèn)為烏龍茶多酚和石榴皮多酚等酚類物質(zhì)可通過抑制α-淀粉酶和脂肪酶的活性達(dá)到降血糖和減脂的功效[36-37],因此可推測(cè)果汁發(fā)酵后多酚類物質(zhì)的含量變化使發(fā)酵果汁可能具有減肥的功效。

圖8 發(fā)酵果汁對(duì)脂肪酶的抑制作用Fig.8 Inhibition of lipase by fermented fruit juice注:對(duì)照為未發(fā)酵的新鮮果汁,陽性對(duì)照為0.2 mg/mL的奧利司他。

3 結(jié)論

隨著科技的進(jìn)步、社會(huì)的發(fā)展,人們的保健意識(shí)逐漸增強(qiáng),對(duì)食品安全、健康的要求也越來越高。雖然傳統(tǒng)的混合果汁營養(yǎng)豐富,但發(fā)酵后的果汁不但產(chǎn)生了氨基酸、多酚等多種活性成分,提高了果汁的營養(yǎng)附加值,而且降低了果汁中的糖分,受眾更廣。本研究利用釀酒酵母發(fā)酵混合果汁,不僅能有效地去除棒曲霉素的污染,還可增強(qiáng)果汁的抗氧化能力,甚至可能賦予了發(fā)酵果汁潛在的減肥功效,大大提高了果汁的營養(yǎng)附加值和保健功能，為開發(fā)功能性發(fā)酵果汁提供了有力的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。