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      金雞顆粒中兩面針摻偽檢測方法的研究

      2020-11-18 07:37:34胡亮李瑞蓮王銀紅
      藥品評價 2020年15期
      關鍵詞:兩面針金雞結果表明

      胡亮,李瑞蓮,王銀紅*

      1.湖南省藥品檢驗研究院,湖南藥用輔料檢驗檢測中心,長沙 410001;2.湖南省藥品質量評價工程技術研究中心,長沙410001

      金雞顆粒處方由金櫻根、雞血藤、兩面針、功勞木、穿心蓮和千斤拔6味藥材組成,具有清熱解毒、健脾除濕、通絡活血等作用,通常用于濕熱下注引起的附件炎、盆腔炎等癥[1-4],其質量標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準》[5]。兩面針為蕓香科植物兩面針Zanthoxylum nitidum(Roxb.)D C.的干燥根。具有活血化瘀,行氣止痛,祛風通絡等功效[6-8]。金雞顆?,F行質量標準中未對兩面針進行質量控制,同時《中國藥典》2015 年版一部收載的兩面針藥材項下明確規(guī)定應不得檢出毛兩面針素[6],但現實狀況是兩面針藥材的資源不足,兩面針常見混有偽品飛龍掌血(特征成分為毛兩面針素)等,實際生產中可能存在替代兩面針投料生產的情況[9-10]。

      本文采用薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質譜法(LC-MS)建立了金雞顆粒中毛兩面素的檢查方法[11],并對收集的21 批樣品進行檢查研究,具體方法如下。

      1 儀器與試藥

      Waters Xevo G2 Q-TOF 液質聯(lián)用儀;Waters 2695 液相色譜儀;2998 二級管陣列檢測器(沃特世科技有限公司);METTLER AE240 型電子天平(梅特勒-托利多,萬分之一);XSE205DU 型電子天平(梅特勒-托利多,十萬分之一);超聲波清洗儀KQ500DE(500W,40KHz);進口硅膠G 預制板TLC Silica gel 60(Merck)。毛兩面針素對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號111531-201603);乙腈為色譜純(Fisher Chemical),其他試劑均為分析純。樣品來源為國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品評價抽驗工作金雞系列品種抽驗樣品及企業(yè)提供的部分樣品。

      2 方法與結果

      2.1 兩面針薄層色譜鑒別

      取本品8 g,研細,加水30 mL 使溶解,用濃氨試液調pH 值至11,用二氯甲烷振搖提取2 次,每次30 mL,合并二氯甲烷提取液,蒸干,殘渣加1 mL 二氯甲烷使溶解,作為供試品溶液。另取兩面針對照藥材1 g,加水30 mL,煮沸30 min,放冷,自“用濃氨試液調pH 值至11”起,同法制成對照藥材溶液。按處方工藝制成不含兩面針的樣品,同供試品溶液制備方法制成缺兩面針陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015 年版四部通則0502)試驗,吸取上述兩種溶液各10 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以二氯甲烷-甲醇-濃氨試液(40∶1∶0.2)為展開劑,展開,取出,晾干,在紫外光365 nm 下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點,陰性對照無干擾,斑點清晰,分離度較好,見圖1。

      圖1 兩面針薄層色譜鑒別圖

      2.2 兩面針摻偽研究

      2.2.1 薄層色譜(TLC)檢查取本品8 g,研細,加乙醇40 mL,密塞,超聲處理40 min,放冷,濾過,濾液蒸干,殘渣加乙醇1mL 使溶解,作為供試品溶液。取毛兩面針素對照品,加乙醇制成每1 mL含1 mg 的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015 年版四部通則0502)試驗,吸取對照溶液5 μL,供試品溶液10 μL,分別點于同一硅膠G 薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(20 ∶5 ∶3 ∶1 ∶0.18)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,出現與毛兩面針素相同顏色的斑點,提示可能存在用兩面針混偽品投料的情況,見圖2。

      圖2 毛兩面針素薄層色譜鑒別圖

      2.2.2 高效液相色譜(HPLC)檢查對照品溶液的制備:取毛兩面針素對照品適量,精密稱定,加乙醇制成每1 mL 中含30 μg 的溶液,作為對照品溶液。供試品溶液的制備:取本品適量,研細,取4 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇20 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率500 W,頻率40 KHz)40 min,放冷,再稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。陰性對照溶液的制備:另按顆粒劑處方稱取除兩面針外的其他藥味及輔料適量,按照樣品制備工藝,同法制備陰性對照溶液。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:采用Hypersil BDS C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:35℃;流動相:乙腈-0.1%磷酸(21 ∶79);PDA 檢測器,流速:0.8 min/mL;檢測波長:330 nm。理論塔板數按毛兩面針素峰計算應不低于3 000。取金雞顆粒陰性樣品溶液、毛兩面針素對照品溶液和初篩顯陽性樣品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,見圖3。

      圖3 高效液相色譜圖

      采用二極管陣列檢測器比較相應色譜峰在200~400 nm 波長范圍的紫外吸收光譜,初篩顯示金雞顆粒陽性樣品溶液與毛兩面針素對照品溶液的PDA 檢測紫外吸收光譜圖基本一致,見圖4。

      圖4 紫外-可見吸收光譜圖

      2.2.3 液質聯(lián)用(HPLC-MS/MS)確證3批疑似陽性樣品采用HPLC-MS/MS 進行確認,結果均出現與毛兩面針素對照色譜保留時間相同的色譜峰,且相應的提取離子流色譜圖與對照品一致。具體條件為:ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(1.8 μm,50 mm×2.1 mm);以乙腈-10 mmol醋酸銨溶液(18∶82)為流動相;柱溫30 ℃;電噴霧電離源(ESI),正離子模式,毛細管電壓2.5 kv,錐孔電壓40 V,萃取錐孔電壓4.0 V,脫溶劑溫度350 ℃,鞘氣流速600 L/h。毛兩面針素對照品溶液ESI+分子離子峰為m/z 309.13,與其結構吻合。對照品溶液及陽性樣品溶液一級質譜和二級質譜掃描圖見圖5。

      圖5 液質聯(lián)用分析圖

      2.2.4 篩查結果在本次篩查的21 批次樣品中,共有3 批金雞顆粒樣品檢出毛兩面針素,陽性樣品色譜保留時間與對照品色譜保留時間一致,且樣品峰在210~400 nm 波長范圍的紫外吸收光譜與對照品基本一致。對3 批次陽性樣品采用HPLC-MS/MS進行確認,出現與毛兩面針素對照品色譜保留時間相同的色譜峰,且與對照品的二級質譜圖一致。涉及樣品含量范圍為65.48~73.94 μg/g。

      2.3 HPLC含量測定

      2.3.1 對照品溶液的制備精密稱取毛兩面針素對照品12.22 mg,置50 mL 量瓶中,加乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液①(244.4 μg/mL),精密量取對照品溶液①3 mL 置10 mL 量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液②(73.32 μg/mL)。

      2.3.2 供試品溶液的制備及色譜條件供試品溶液的制備及色譜條件均同“2.2.2”項。

      2.3.3 線性關系考察精密吸取對照品溶液②1、5、8、10 μL,對照品溶液①5、10 μL 注入液相色譜儀,測定,以峰面積積分值為縱坐標,進樣量(μg)為橫坐標,繪制標準曲線。其回歸方程為:Y=3×106X-2.03×105,R2=0.999 5。結果表明:毛兩面針素對照品在0.073 32~2.444 μg 范圍內線性關系良好。

      2.3.4 精密度試驗精密吸取對照品溶液②(73.32 μg/mL),連續(xù)進樣6次,每次10 μL,分別記錄峰面積,計算RSD 為0.74%,結果表明儀器精密度良好。

      2.3.5 重復性試驗取金雞顆粒(批號20160101),分別按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液各6 份,進樣10 μL 進行分析,金雞顆粒中毛兩面針素含量平均值為71.53 μg/g,RSD 為1.69%。結果表明該法重復性良好。

      2.3.6 穩(wěn)定性試驗取“2.3.6”項下金雞顆粒同一份供試品溶液,室溫下放置,在0、2、6、12、22 h分別進樣10 μL 進行分析,分別記錄峰面積,計算RSD 為0.48%,結果表明供試品溶液在22 h 內穩(wěn)定性良好。

      2.3.7 加樣回收率試驗取已測定含量的樣品(20160101,含毛兩面針素71.53 μg/g)2.0 g,共6 份,分別精密稱定,置已精密加入對照品溶液②(73.32 μg/mL)1.80 mL 蒸干后的具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇20 mL,密塞,稱定重量,超聲處理40 min,放冷,稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。在上述液相色譜條件下進樣分析,按外標法計算加樣回收率,6 批樣品平均回收率為94.3%,RSD 為0.61%。結果表明該法加樣回收率較好。

      2.3.8 檢出限和定量限精密量取“2.3.1”項下毛兩面針素對照溶液①(244.4 μg/mL)1 mL 置200 mL 容量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,得對照品溶液③(1.222 μg/mL),根據進樣量不同,以信噪比為3∶1 的濃度作為儀器檢出限,信噪比為10 ∶1 的濃度為儀器定量限,測定其檢出限和定量限分別為1.22 ng 和3.44 ng。

      2.3.9 樣品測定取金雞顆粒陽性樣品,照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,進樣10 μL 進行測定,用外標法計算含量,測定結果表明3 批次毛兩面針素平均含量為70.31 μg/g,其中最高為73.94 μg/g,最低為65.48 μg/g。

      3 討論

      由于兩面針藥材生長周期較長,需求量逐年增加而野生資源不斷減少,導致兩面針市場混偽現象嚴重,造成臨床療效和用藥安全隱患。本文建立了金雞顆粒中兩面針的薄層色譜鑒別方法,同時對21批次樣品進行毛兩面針素檢查。結果表明,21 批次樣品中3 批次檢出毛兩面針素,檢出率為14%,表明可能存在用兩面針混偽品投料生產的情況,應對中成藥制劑中的摻偽或偽品投料情況引起高度重視,并加強監(jiān)管力度。

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