克雷伯桿菌O852產(chǎn)反式二氫香芹酮關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化條件及超聲提取工藝優(yōu)化

李 志,張瑩瑩,張璐璐,李 曉,范 剛,彭芷芊,任婧楠,潘思軼(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070)

檸檬烯(limonene)又稱苧烯,是一種單萜類化合物,在自然界中廣泛存在。檸檬烯是柑橘類水果香氣成分中的主要成分,相對(duì)含量達(dá)到95%左右[1]。檸檬烯作為柑橘業(yè)加工的副產(chǎn)物,每年的產(chǎn)量達(dá)到50000噸,且價(jià)格非常便宜[2]。檸檬烯化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,光照和加熱都會(huì)使其發(fā)生自身氧化反應(yīng)[3],且香氣值較低,使其在香精香料領(lǐng)域的應(yīng)用存在一定局限性,而與檸檬烯具有相同骨架的一些含氧化合物,包括紫蘇醇、松油醇、香芹酮等,具有更加獨(dú)特的芳香氣味,是高級(jí)香精香料的原料,有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,而且還具有抗菌、抗腫瘤等重要的藥理作用[4]。

香芹系列香料是調(diào)配高級(jí)食品和化妝品香精的重要原料,代表化合物為香芹醇、香芹酮、二氫香芹酮、二氫香芹醇等。其中二氫香芹酮存在于長(zhǎng)葉留蘭香、蒔蘿、當(dāng)歸子中,具有清涼薄荷香味,可用于調(diào)配糖果、口香糖、興奮飲料等食用香精,也用于口腔衛(wèi)生用品中[5]。除此之外在殺蟲、抑菌等方面,二氫香芹酮也被證實(shí)有顯著功效[6-7]。

目前,香芹系列香料的獲取有物理提取法、化學(xué)合成法及微生物轉(zhuǎn)化法,其中以化學(xué)合成法為主。有文獻(xiàn)報(bào)道,在Ni、Pt、Pd、Rh、Ru、Au-TiO2等催化劑的作用下可將香芹酮轉(zhuǎn)化成二氫香芹酮[8],而這種方法常常導(dǎo)致其它不飽和官能團(tuán)的氫化,從而生成多種復(fù)雜的化合物,且產(chǎn)率較低。相比較而言,利用微生物轉(zhuǎn)化制備香精香料具有高度專一性、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速率快、收率高、成本低及反應(yīng)步驟少等優(yōu)點(diǎn)[9],利用這種方法得到的香精香料可以被認(rèn)為是“天然的”,而消費(fèi)者往往更青睞于“天然的”香精香料產(chǎn)品。在此背景下,研究二氫香芹酮的生物合成是很有必要的。有研究表明微生物可以利用檸檬烯,在NADPH依賴的檸檬烯-6-單加氧酶作用下通過(guò)6位羥基化生成香芹醇,隨后在香芹醇脫氫酶作用下生成香芹酮,最終在香芹酮還原酶作用下生成二氫香芹酮[10-14]。

在本實(shí)驗(yàn)室之前的工作中,篩選到一株能利用檸檬烯為唯一碳源生長(zhǎng)的微生物菌株。經(jīng)鑒定為Klebsiellasp.,屬于細(xì)菌域,變形菌門,γ-變形菌綱,腸桿菌目,腸桿菌科,克雷伯桿菌屬。該菌種可將檸檬烯轉(zhuǎn)化為二氫香芹醇、β-松油醇和檸檬烯-1,2-環(huán)氧產(chǎn)物。其中反式二氫香芹酮是Klebsiellasp. O852轉(zhuǎn)化檸檬烯的主要產(chǎn)物,目前尚沒(méi)有文章報(bào)道Klebsiellasp.可以進(jìn)行檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Klebsiellasp. 實(shí)驗(yàn)室保存菌種;LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,氯化鈉10,pH自然,在121 ℃下滅菌20 min;(+)-檸檬烯(>95.0%) 梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;無(wú)水乙醇、環(huán)己酮、氯化鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、鹽酸 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;KYC-1102恒溫培養(yǎng)搖床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;AR522CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;pH計(jì)(PB-10) Sartorius公司;Agilent 6890N GC-5975B質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司;Centrifuge 5415R高速冷凍離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司;VCX750高強(qiáng)度超聲波細(xì)胞破碎儀 Sonics公司;Avanti J-E高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備 無(wú)菌條件下,用接種環(huán)挑取一環(huán)Klebsiellasp.的單菌落在LB培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接2次,將50 μL菌液接種至100 mL培養(yǎng)基中,于37 ℃,210 r/min條件下培養(yǎng)12 h,作為種子液備用。

1.2.2 菌體制備 將種子液按1%的接種量接種在培養(yǎng)基中,于37 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)8 h。培養(yǎng)結(jié)束后在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min,棄上清,用pH=7.0,10 mmol/L的PBS緩沖液洗滌菌體,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min,棄上清,重復(fù)兩次,得到菌體。

1.2.3 粗酶液制備 所得到的菌體,用10 mmol/L pH=7.0的PBS緩沖液,按照一定的料液比對(duì)菌體進(jìn)行重懸,使用超聲波細(xì)胞破碎儀,在一定的振幅條件下超聲處理一定的時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞破碎。超聲工作時(shí)間3 s,間歇時(shí)間5 s,每次超聲破碎的體積為5 mL。破碎完成后,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min。收集上清即為粗酶液[15]。

1.2.4 酶的定位 按照1.2.2的方法進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后取菌液1 mL,剩余菌液在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min,分別收集發(fā)酵液和菌體,取發(fā)酵液1 mL,菌體按照1.2.3的方法進(jìn)行破碎獲取粗酶液,取粗酶液1 mL。分別向菌液、發(fā)酵液、粗酶液中各加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下轉(zhuǎn)化12 h,用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)反式二氫香芹酮含量[16]。

1.2.5 克雷伯桿菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

1.2.5.1 克雷伯桿菌O852生長(zhǎng)曲線的繪制 將種子液按1%的接種量接種在培養(yǎng)基中,于37 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)48 h,期間每4 h取一次樣,測(cè)定其在600 nm處的吸光度值。以無(wú)菌的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。以時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D600值為縱坐標(biāo),繪制菌種的生長(zhǎng)曲線,以確定菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[17]。

1.2.5.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響 將種子液按1%的接種量接種在培養(yǎng)基中,于37 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)24 h,在培養(yǎng)至4、8、12、16、20、24 h時(shí)分別取樣,按照1.2.3的方法制備粗酶液,取粗酶液1 mL,加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下轉(zhuǎn)化12 h。比較不同培養(yǎng)時(shí)間條件下的酶活性,以此考察在不同的生長(zhǎng)時(shí)期,實(shí)驗(yàn)菌種產(chǎn)酶能力的差別[18]。

1.2.5.3 緩沖體系對(duì)酶活的影響 按照1.2.2的方法進(jìn)行培養(yǎng),將洗滌和重懸菌體所用的緩沖液分別換做10 mmol/L pH=7.0的PBS、Tris-HCl、HEPES緩沖液,并以此緩沖液作為酶促反應(yīng)的介質(zhì)。取粗酶液1 mL,加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下轉(zhuǎn)化12 h?？疾觳煌彌_體系對(duì)酶活的影響[19]。

1.2.5.4 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)酶活的影響 按照1.2.3的方法制備粗酶液,取粗酶液1 mL,加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下,分別轉(zhuǎn)化4、8、12、16、20、24 h,考察不同轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)酶活的影響[20]。

1.2.6 蛋白含量的測(cè)定 使用BCA(bicinchonininc acid)蛋白濃度試劑盒進(jìn)行樣品中蛋白濃度的測(cè)定。將試劑A和試劑B按50∶1的比例配制成BCA工作液。蛋白標(biāo)準(zhǔn)品依此取0、2、4、6、8、10 μL,粗酶液取2 μL加入96孔板,加10 mmol/L的PBS緩沖液補(bǔ)足到10 μL。每個(gè)測(cè)定做3個(gè)平行。向粗酶液和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中加入200 μL BCA工作液,混勻。37 ℃反應(yīng)30 min后,使用酶標(biāo)儀在562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程為y=0.572x+0.1308,線性決定系數(shù)R2=0.995 4,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。

1.2.7 檸檬烯轉(zhuǎn)化生成反式二氫香芹酮關(guān)鍵酶酶活測(cè)定方法及得率的計(jì)算 取粗酶液1 mL,加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下轉(zhuǎn)化4 h,即為轉(zhuǎn)化液。反式二氫香芹酮的含量采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行測(cè)定。取1 mL轉(zhuǎn)化液入30 mL萃取瓶中,40 ℃條件下平衡15 min,插入已活化好的50/30 pm DVB/CAR/PDMS的SPME萃取頭(270 ℃活化l h),推出纖維頭,頂空吸附40 min后,插入GC-MS進(jìn)樣口解析5 min。

氣相色譜條件:毛細(xì)管柱為HP-5(30 m×320 μm×0.25 μm),程序升溫,起始溫度40 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至160 ℃,保持2 min,再以8 ℃/min升至220 ℃,保持3 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃,檢測(cè)器溫度:FID 250 ℃。

質(zhì)譜條件:離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,離子化方式EI,電子能量70 eV,質(zhì)量范圍為45～550 AMU/sec。

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,將環(huán)己酮按1∶1000的比例稀釋于無(wú)水乙醇中,吸取10 μL與樣品混合作為內(nèi)標(biāo)。1 mL粗酶液1 h內(nèi)產(chǎn)生1 μg反式二氫香芹酮定義為1 U。酶活含量為處理單位質(zhì)量的菌體所得到的酶活含量,單位為U/g[21]。

產(chǎn)反式二氫香芹酮關(guān)鍵酶酶活含量(U/g)=樣品中產(chǎn)反式二氫香芹酮關(guān)鍵酶酶活(U)/菌體質(zhì)量(g)

采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定反式二氫香芹酮的含量的計(jì)算公式如下:

反式二氫香芹酮的含量(mg/L)=(反式二氫香芹酮峰面積×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量(mg))/(內(nèi)標(biāo)物峰面積×樣品體積(L))

1.2.8 超聲波破碎條件單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 超聲時(shí)間的選擇 將菌體按照1∶5的料液比重懸于10 mmol/L的PBS緩沖液中,使用超聲波細(xì)胞破碎儀,在振幅30%,超聲工作時(shí)間3 s,間歇時(shí)間5 s的條件下進(jìn)行細(xì)胞破碎,總時(shí)間分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30 min,每次超聲破碎的體積為5 mL。破碎完成后,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min。收集上清即為粗酶液,考察超聲總時(shí)間對(duì)酶活得率的影響。

1.2.8.2 料液比的選擇 將菌體重懸于10 mmol/L的PBS緩沖液中,使用超聲波細(xì)胞破碎儀,在振幅30%,超聲工作時(shí)間3 s,間歇時(shí)間5 s,總時(shí)間20 min的條件下進(jìn)行細(xì)胞破碎,料液比分別設(shè)置為1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20。每次超聲破碎的體積為5 mL。破碎完成后,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min。收集上清即為粗酶液,考察料液比對(duì)酶活得率的影響。

1.2.8.3 振幅的選擇 將菌體按照1∶5的料液比重懸于10 mmol/L的PBS緩沖液中,使用超聲波細(xì)胞破碎儀,在超聲工作時(shí)間3 s,間歇時(shí)間5 s,總時(shí)間20 min的條件下進(jìn)行細(xì)胞破碎,振幅分別設(shè)置為20%、25%、30%、35%、40%。每次超聲破碎的體積為5 mL。破碎完成后,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min。收集上清即為粗酶液,考察振幅對(duì)酶活得率的影響。

1.2.9 超聲波破碎條件的響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以超聲時(shí)間(A)、料液比(B)、振幅(C)為自變量,單位質(zhì)量菌體中獲得的酶活總量(Y)為響應(yīng)值,利用Design-Expert. V8.0.6軟件,根據(jù)Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),采用響應(yīng)面分析方法對(duì)Klebsiellasp.轉(zhuǎn)化檸檬烯生成反式二氫香芹酮的關(guān)鍵酶的最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì),響應(yīng)面分析因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面考察因素及水平Table 1 Factors and levels coding of response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次并取其平均值進(jìn)行分析,采用Design-Expert. V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面組合實(shí)驗(yàn),采用origin 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的定位

培養(yǎng)后的菌液、發(fā)酵液和粗酶液轉(zhuǎn)化相同時(shí)間得到的產(chǎn)物含量如圖1所示,在培養(yǎng)后的菌液中可以檢測(cè)到產(chǎn)物生成,可見(jiàn)此菌種可利用環(huán)境中的檸檬烯進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,生成反式二氫香芹酮。將菌液做離心處理后,在發(fā)酵液中幾乎無(wú)產(chǎn)物生成,而在菌體破碎后獲取的粗酶液中可以檢測(cè)到一定量的反式二氫香芹酮,由此可初步判斷該酶為胞內(nèi)酶。

圖1 菌液、發(fā)酵液和菌體轉(zhuǎn)化生成反式二氫香芹酮的含量Fig.1 Contents of trans-dihydrocarvone produced by bacterial solution,fermentation broth and bacterial cells

2.2 克雷伯桿菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.2.1 克雷伯桿菌O852生長(zhǎng)曲線的繪制 細(xì)菌的生長(zhǎng)通常分為延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期及衰亡期四個(gè)階段[22-23]。如圖2所示,在本實(shí)驗(yàn)條件下,菌體迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而未出現(xiàn)明顯的延滯期,這與侯星[24]研究的產(chǎn)α-半乳糖苷酶的成團(tuán)泛菌在37 ℃條件下的生長(zhǎng)曲線結(jié)果相類似。在12 h左右達(dá)到穩(wěn)定期。

圖2 Klebsiella sp. O852的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Klebsiella sp. O852

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響 菌體產(chǎn)酶能力隨時(shí)間的變化如圖3所示,在0～8 h范圍內(nèi),酶活隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,在8 h時(shí)有最大酶活,為(6.60±0.30) U,對(duì)應(yīng)菌種生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)中期,表明此時(shí)酶活力最為旺盛,隨后酶活呈下降趨勢(shì)并在12～24 h范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。當(dāng)菌種生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后,酶活基本保持不變。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇8 h作為菌體的培養(yǎng)時(shí)間。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of culture time on enzyme activity

2.2.3 緩沖體系對(duì)酶活的影響 用一系列不同的緩沖體系對(duì)菌體進(jìn)行洗滌,重懸,并作為酶促反應(yīng)的介質(zhì),探討不同緩沖體系對(duì)酶活的影響,結(jié)果如圖4所示。以磷酸鹽緩沖液(PBS)為緩沖體系時(shí),得到的酶活最高,為(5.48±0.18) U。這可能是因?yàn)檫@種緩沖體系能提供更適宜的緩沖介質(zhì)環(huán)境,從而一定程度上提高了酶活[19]。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,選擇PBS提取該酶。

圖4 緩沖體系對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of buffer on enzyme activity

2.2.4 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)酶活的影響 如圖5所示,轉(zhuǎn)化開(kāi)始時(shí),隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的增加,酶活成持續(xù)下降趨勢(shì),在4 h時(shí)的酶活最高,為(16.92±1.83) U,約是8 h時(shí)的2倍左右。轉(zhuǎn)化時(shí)間為12、16、20和24 h時(shí),酶活變化較為穩(wěn)定。這可能是因?yàn)槊傅姆磻?yīng)速度較快,在4 h時(shí)已轉(zhuǎn)化完全,此后即便延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間,也不會(huì)有產(chǎn)物的生成。且隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)物可能存在分解等狀況。故在后續(xù)的研究中選取4 h為轉(zhuǎn)化時(shí)間。

圖5 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of conversion time on enzyme activity

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)相關(guān)酶酶活及蛋白含量的影響 如圖6所示,總蛋白濃度隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,而酶活則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),但變化趨勢(shì)不明顯。超聲時(shí)間的延長(zhǎng)有助于細(xì)胞破壁和蛋白的釋放,而時(shí)間過(guò)長(zhǎng),體系內(nèi)熱量增加可能導(dǎo)致酶的催化活性部分受損,從而降低酶活[25]。綜上選取最佳超聲時(shí)間為20 min。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)酶活及蛋白含量的影響Fig.6 Effect of ultrasound time on enzyme activity and protein content注:同一指標(biāo)的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖7～圖8同。

2.3.2 料液比對(duì)相關(guān)酶活及蛋白含量的影響 如圖7所示,總蛋白濃度隨著料液比的增大而減少,而酶活則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在1∶10時(shí)達(dá)到最高。料液比較低時(shí),相同體積的樣品中所含菌體量較大,因此,破碎菌體能夠釋放更多的蛋白。當(dāng)料液比較小時(shí),不利于空化作用和均勻化作用的發(fā)揮,且容易導(dǎo)致局部過(guò)熱致酶失活[26]。隨著料液比增大,細(xì)胞破碎更為完全,使酶活得到升高,料液比繼續(xù)增大,菌體過(guò)少導(dǎo)致得不到足夠的酶量,使酶活降低。綜上選取最佳料液比為1∶10。

圖7 料液比對(duì)酶活及蛋白含量的影響Fig.7 Effect of material-liquid ratio of enzyme activity and protein content

2.3.3 振幅對(duì)相關(guān)酶活及蛋白含量的影響 如圖8所示,總蛋白濃度隨著振幅的增高而增加,當(dāng)振幅達(dá)到35%時(shí),蛋白濃度基本不變,說(shuō)明可提取的蛋白已基本完全提取,酶活隨著振幅的增高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在35%時(shí)達(dá)到最高。隨著振幅的增高,超聲提取對(duì)細(xì)胞的破壞作用增大,有助于細(xì)胞破壁和蛋白的釋放,而振幅過(guò)高,可能使得體系中局部溫度、壓力過(guò)高,進(jìn)而導(dǎo)致酶的失活[27]。綜上選取最佳振幅為35%。

圖8 振幅對(duì)酶活及蛋白含量的影響Fig.8 Effect of amplitudeon enzyme activity and protein content

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.4.1 模型的建立與顯著性分析 響應(yīng)面法可在實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少的情況下,全面考察各種因素及其交互作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,從而有效的確定最佳條件[28]。根據(jù)此前的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以超聲時(shí)間、料液比、振幅為自變量,以酶活為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)各組結(jié)果見(jiàn)表2,利用Design Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,建立數(shù)學(xué)模型如下:

Y=38.24+0.71A+2.71B+1.58C+2.56AB-2.18AC+1.47BC-4.19A2-3.09B2-4.97C2。對(duì)模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,擬合模型具有顯著性(P=0.0047<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.7718),回歸方程決定系數(shù)R2=0.9181,表示91.81%的酶活變化可由此模型解釋,以上內(nèi)容說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合良好。一次項(xiàng)中料液比顯著,超聲時(shí)間和振幅不顯著;二次項(xiàng)均顯著;交互項(xiàng)均不顯著。說(shuō)明各因素和響應(yīng)值之間非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。根據(jù)F值可以得出影響酶活的大小順序?yàn)榱弦罕?振幅>超聲時(shí)間。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of the regression model

2.4.2 模型交互項(xiàng)的解析 三因素之間的三維響應(yīng)曲面圖及等高線圖如圖9所示。等高線圖中形狀呈橢圓形且排列密集,說(shuō)明兩因素之間存在明顯的交互作用,呈圓形且排列稀疏則說(shuō)明交互作用不明顯[29];在三維響應(yīng)曲面圖中,當(dāng)曲面的坡度較為平緩,說(shuō)明兩因素交互作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大,若坡度較為陡峭則相反[30]。從圖9中可以看出,隨著各因素的水平在一定范圍內(nèi)增大,酶活均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),各因素對(duì)酶活影響的響應(yīng)曲面坡度較為平緩,等高線呈橢圓形但排列較為稀疏,這說(shuō)明兩因素間的交互作用均不顯著[31],這與方差分析的結(jié)果相同。根據(jù)二次多元回歸方程的擬合,得到的最佳超聲提取工藝預(yù)測(cè)值為:超聲時(shí)間21.03 min,料液比1∶12.86,振幅為35.99%,在此條件下,最佳酶活為39.25 U/g。

2.4.3 最佳工藝條件驗(yàn)證 根據(jù)最佳工藝預(yù)測(cè)值,將提取工藝定為超聲時(shí)間21 min,料液比1∶13,振幅36%,進(jìn)行三次驗(yàn)證,得到平均酶活為(40.97±2.02) U/g,與理論值基本相符,說(shuō)明回歸模型能夠較好的預(yù)測(cè)酶活,優(yōu)化結(jié)果可靠。

圖9 因素間交互作用的影響Fig.9 The effect of interaction of factors

3 結(jié)論

通過(guò)分別使用發(fā)酵液和粗酶液進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,可以判斷該酶為胞內(nèi)酶。培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到8 h時(shí)進(jìn)行細(xì)胞破碎,獲取的粗酶液用以進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,得到的酶活最高。參照生長(zhǎng)曲線可知,此時(shí)對(duì)應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)中期。研究發(fā)現(xiàn)酶活隨轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低,在4 h時(shí)測(cè)得的酶活最高。提取時(shí)選用磷酸鹽緩沖液獲得的酶活最高,說(shuō)明磷酸鹽緩沖液可較好的保護(hù)酶活。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),并使用響應(yīng)面法對(duì)超聲提取該酶的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,得出當(dāng)提取工藝為超聲時(shí)間21 min,料液比1∶13,振幅36%時(shí),獲得酶活最高,達(dá)到(40.97±2.02)U/g。