復(fù)方鹿角靈芝茶的制備及其免疫調(diào)節(jié)功能研究

許藝敏,梁志豪,張桂清,*,劉 斌,2,呂旭聰,羅海凌,林占熺(.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心,福建福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

富硒茶具有提高人體免疫力、預(yù)防衰老、防輻射及減輕治療不良反應(yīng)、助消化、消除口臭、降血壓血脂血糖、預(yù)防肝臟硬化、抗解金屬鹽和生物堿中毒、抑菌、抗病毒和抗腫瘤等功效[1-3]。有研究表明普通茶和富硒茶均能有效提高老齡大鼠記憶能力和自主活動(dòng)能力,增強(qiáng)免疫能力,但富硒茶效果更好[4]。鹿角靈芝的主要有效成分為靈芝多糖,具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗腫瘤[6]和抗炎[7]等作用。很多報(bào)道顯示多糖是理想的免疫調(diào)節(jié)劑,不僅可以改善生物體的防御能力,增強(qiáng)抵抗入侵病原體的能力,而且能激發(fā)宿主的免疫系統(tǒng),調(diào)節(jié)獲得性免疫[8],特別是在靈芝多糖發(fā)揮抗腫瘤的研究中,同時(shí)伴隨著宿主免疫功能的增強(qiáng)[9]。紫蘇富含紫蘇醛,黃酮、類胡蘿卜素及迷迭香酸等多種重要活性成分[10],研究表明紫蘇葉乙醇提取物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11],促進(jìn)大鼠腸道蠕動(dòng),增強(qiáng)大鼠的健胃消食功效[12]。

目前,顆粒劑和片劑是臨床應(yīng)用的常用劑型,顆粒劑具有吸收快,顯效迅速,生產(chǎn)設(shè)備操作簡(jiǎn)易,服用、攜帶、貯藏和運(yùn)輸方便等特點(diǎn),但其成本相對(duì)較高,易吸潮結(jié)塊,潮解;片劑具有劑量準(zhǔn)確,藥物含量差異較小,機(jī)械化生產(chǎn),產(chǎn)量大等特點(diǎn),但其制備過(guò)程中需經(jīng)壓縮成型,溶出度較顆粒劑差,不易吞服,含揮發(fā)性成分的片劑貯存較久時(shí)揮發(fā)性成分含量下降[13],在對(duì)兩種劑型進(jìn)行比較后,選定顆粒劑為適宜劑型來(lái)進(jìn)行制備工藝優(yōu)化。

本實(shí)驗(yàn)以富硒茶、鹿角靈芝和紫蘇3種提取物為原料，制備復(fù)方制劑,選擇BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究該復(fù)方對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用,為復(fù)方鹿角靈芝茶進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒紅茶粉 湖南省株洲市炎陵縣中村瑤族鄉(xiāng)新山茶葉有限公司;鹿角靈芝粉 福建省菌芝堂生物科技有限公司;紫蘇葉粉 廣東匯群中藥飲片股份有限公司;SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠 50只,4～5周齡,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(許可證號(hào):SCXK(瀘)2017-0005),體重(18±2) g,飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,溫度為23～25 ℃,濕度為60%;動(dòng)物飼料 閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司;甘露醇 廣西南寧化學(xué)制藥有限責(zé)任公司;聚維酮K30 博愛(ài)新開(kāi)源制藥股份有限公司;左旋咪唑 Sigma-Alorich公司;IL-2、IL-10、INF-γELISA試劑盒 欣博盛生物科技有限公司;SA緩沖液 北京百奧萊博科技有限公司;無(wú)水乙醇 西隴科學(xué)股份有限公司;綿羊紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞 上海蓋寧生物科技有限公司;牛肉膏、蛋白胨 上海展云化工有限公司;氯化鈉 鼎盛鑫化工有限公司;可溶性淀粉 湖州展望藥業(yè)有限公司。

FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;GD0615超聲波清洗儀 深圳市超潔科技實(shí)業(yè)有限公司;B-220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52CS 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵 貢義市予華儀器有限責(zé)任公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6 國(guó)華電器有限公司;YK-60型搖擺式顆粒機(jī) 泰州金城制藥機(jī)械有限公司,TG16-WS離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)方鹿角靈芝茶的提取與組成

1.2.1.1 鹿角靈芝粗多糖的提取 采用水提醇沉法,鹿角靈芝粉與水的料液比(g/mL)為1∶20,70 ℃水浴加熱4 h,減壓過(guò)濾,收集濾液,60 ℃真空減壓濃縮,加入濃縮液4倍的無(wú)水乙醇,4 ℃醇沉12 h,收集沉淀物,將沉淀物真空冷凍干燥,粉碎過(guò)80目,采用苯酚硫酸法[14]測(cè)得鹿角靈芝粗多糖樣品中的多糖含量為88.24%。

1.2.1.2 富硒茶粗茶多酚的提取 采用乙醇提取法,富硒茶粉與70%乙醇的料液比(g/mL)為1∶20,乙醇濃度為70%,70 ℃水浴加熱4 h,減壓過(guò)濾,收集濾液,60 ℃真空減壓濃縮,提取物真空冷凍干燥,粉碎過(guò)80目,參照鮮殊等[15]測(cè)得富硒茶粗茶多酚樣品中茶多酚含量為88.29%。

1.2.1.3 紫蘇粗多酚的提取 采用乙醇提取法,紫蘇粉與80%乙醇的料液比(g/mL)為1∶20,乙醇濃度為80%,70 ℃加熱4 h,減壓過(guò)濾,收集濾液,60 ℃真空減壓濃縮,提取物真空冷凍干燥,粉碎過(guò)80目,測(cè)得紫蘇粗多酚中多酚含量為62.96%,參照代沙[16]測(cè)得紫蘇粗多酚中黃酮含量為35.69%。

1.2.1.4 復(fù)方鹿角靈芝茶的組成 依據(jù)人體推薦量和中國(guó)藥典一部[17]建議,1份復(fù)方鹿角靈芝茶中添加鹿角靈芝粗多糖提取物0.38 g,富硒粗茶多酚提取物1.24 g和紫蘇粗多酚提取物33 mg。

1.2.2 顆粒的制備 將一份復(fù)方鹿角靈芝茶提取物和甘露醇,聚維酮K30一起過(guò)80目篩4次,使其混合均勻。將混合過(guò)后的物料放入研缽內(nèi),滴加一定濃度乙醇,不斷搓捏,混勻,直至“握之捏成團(tuán),壓之即散”即制軟材,在65目篩上制粒,放入60 ℃烘箱內(nèi)30 min,整粒,稱重,檢查成型率、吸濕率、堆密度、休止角和溶化率。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 填充劑用量對(duì)顆粒的影響 參考杜俊潮等[18]的研究,選取甘露醇作為填充劑。實(shí)驗(yàn)根據(jù)復(fù)方提取物與甘露醇配伍比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5,滴加適量85%乙醇,3%聚維酮K30進(jìn)行制粒,測(cè)定顆粒劑的成型率、吸濕率、堆密度、溶化率及休止角,確定較佳的配伍比例。

1.2.3.2 乙醇濃度對(duì)顆粒成型率的影響 分別以濃度為55%、65%、75%、85%和95%的乙醇為潤(rùn)濕劑,復(fù)方提取物與甘露醇比例為1∶3,3%聚維酮K30進(jìn)行制粒,以成型率作為考察指標(biāo),選擇適宜的潤(rùn)濕劑濃度。

1.2.3.3 聚維酮K30用量對(duì)顆粒的影響 分別以比例為0、1%、2%、3%、4%和5%的聚維酮K30為粘合劑,復(fù)方提取物與甘露醇比例為1∶3,滴加適量85%乙醇進(jìn)行制粒,以成型率、吸濕率、堆密度、溶化率及休止角作為考察指標(biāo),選擇適宜的聚維酮K30用量。

1.2.3.4 顆粒干燥時(shí)間對(duì)顆粒的影響 取復(fù)方鹿角靈芝茶提取物:甘露醇為1∶3和3%聚維酮K30,混合均勻后加入適量85%乙醇,制粒,分別干燥 20、25、30、35和40 min,考察測(cè)定干燥不同時(shí)間后顆粒的成型率、吸濕率、堆密度、溶化率及休止角。

1.2.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)篩選出影響較大的因素后采用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),分別測(cè)定成型率、吸濕率、堆密度及休止角多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分。

表1 復(fù)方鹿角靈芝茶顆粒制備工藝正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels table for orthogonal experiment of compound antler Ganoderma lucidumtea granules preparation process

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定方法 指標(biāo)測(cè)定方法參照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》[19]和李兆翌等[20]方法進(jìn)行檢測(cè)

1.2.5.1 成型率的測(cè)定 將制備好的顆粒稱重,將制備的顆粒依次通過(guò)一號(hào)篩和五號(hào)篩,稱量能通過(guò)一號(hào)篩與不能通過(guò)五號(hào)篩的總和,計(jì)算成型率。

式中:m1為所得合格顆粒重量,g;m2為所用藥粉和輔料重量,g。

1.2.5.2 休止角的測(cè)定 采用固定漏斗法。將3只漏斗串聯(lián)并固定于水平放置的坐標(biāo)紙上。高度處,將藥粉及顆粒沿漏斗壁倒入最上的漏斗中,直到最下面漏斗形成的藥粉圓錐體尖端接觸到漏斗口為止,由坐標(biāo)紙測(cè)出圓錐底部的直徑,使顆粒經(jīng)過(guò)一漏斗流下成一圓錐體堆,測(cè)定其堆高和錐體底部半徑。

式中:h為高度,cm;r為錐體底部半徑,cm。

1.2.5.3 吸濕率測(cè)定 將底部盛有氯化鈉過(guò)飽和溶液的玻璃干燥器放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫24 h,此時(shí)干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度為75%。分別在已恒重的稱量瓶底部放入厚約2 mm的顆?；蛩幏?準(zhǔn)確稱重后置于過(guò)飽和溶液的玻璃干燥器內(nèi)稱量瓶蓋打開(kāi),于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱保存,定時(shí)量,按下式計(jì)算吸濕百分率。

式中:m3為吸濕后顆粒的重量,g;m4為吸濕前顆粒的重量,g。

1.2.5.4 堆積密度測(cè)定 取顆粒適量,將容積約為50 cm3的樣品粉末裝入的50 cm3量筒中,每隔2 s把量筒從2.5 cm處擊在一塊硬木表面上,共擊3次,用量筒中樣品量除以最后容積,計(jì)算樣品的堆密度,分別測(cè)定三批顆粒堆密度。

式中:m5為樣品重量,g;V為最后容積,cm3。

1.2.5.5 溶化率的測(cè)定 在干燥恒重的5 mL離心管中加入精密稱定的顆粒,加入沸水5 mL,攪拌振蕩5 min,3000 r/min離心5 min,棄去上清液,在80 ℃烘箱中將殘?jiān)娓芍梁阒?精密稱定,計(jì)算溶化率。

式中:m6為顆粒的重量,g;m7為殘?jiān)闹亓?g。

1.2.5.6 綜合評(píng)分 綜合評(píng)分[21]=(15/最大成型率值)×成型率值+(15/最大堆積密度值)×堆積密度值+(最小休止角值×15)/休止角值+(20/最大溶化率值)×溶化率值+(最小吸濕率值×35)/吸濕率值

式中:最大值為本組試驗(yàn)中該指標(biāo)的最大值;最小值為本組試驗(yàn)中該指標(biāo)的最小值

1.2.5.7 水分的測(cè)定 取供試品3 g,平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中,精密稱定,開(kāi)啟瓶蓋在100～105 ℃干燥5 h,移置干燥器中,冷卻30 min,精密稱定,再在上述溫度干燥1 h,冷卻,稱重,直至連續(xù)兩次稱重的差異不超過(guò)5 mg為止,計(jì)算供試品中含水量(%)。

式中:m8為干燥后顆粒的重量,g;m9為干燥前顆粒的重量,g。

1.2.5.8 干燥失重的測(cè)定 稱取樣品1 g于80 ℃減壓干燥至恒重,減失重量不得超過(guò)2.0%。平行測(cè)定三組,以減少的重量與取樣量的比值計(jì)算顆粒的干燥失重。

式中:m10為減價(jià)干燥前顆粒的重量,g;m11為減壓干燥后顆粒的重量,g。

1.2.6 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)功能的影響

1.2.6.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將BALB/c小鼠50只隨機(jī)分成5組,即空白對(duì)照組、左旋咪唑陽(yáng)性對(duì)照組(10 mg·kg-1·d-1)[22]、復(fù)方低劑量組(215 mg·kg-1·d-1)、復(fù)方中劑量組(430 mg·kg-1·d-1)和復(fù)方高劑量組(645 mg·kg-1·d-1),連續(xù)給藥28 d。檢測(cè)免疫器官指數(shù)、血清細(xì)胞因子含量、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅血細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)和溶血空斑個(gè)數(shù);整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程,每隔1周測(cè)小鼠體重1次,同時(shí)觀察小鼠的狀態(tài),記錄小鼠飲食和飲水情況。

1.2.6.2 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠免疫器官的影響 給藥28 d后通過(guò)頸椎脫臼處死小鼠,剝離胸腺和脾,計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

脾臟指數(shù)=脾重(mg)/體重(g);胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g)

1.2.6.3 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響 給藥28 d后,小鼠摘眼球取血,血樣靜置1 h后,離心半徑8 cm,3000 r/min離心5 min取上清。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和干擾素γ(INF-γ)細(xì)胞因子的含量。

1.2.6.4 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠溶血空斑的影響 取綿陽(yáng)血細(xì)胞,用生理鹽水洗滌3次,2000 r/min離心10 min,計(jì)數(shù)細(xì)胞為5×107/mL的SRBC,每只小鼠給藥24 d后經(jīng)腹腔注射0.2 mL的SRBC。將SRBC免疫4 d后的小鼠頸椎脫臼處死,取脾臟制成5×106個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液。稱取1 g瓊脂糖加雙蒸水至100 mL配制表層培養(yǎng)基備用,將表層培養(yǎng)基加熱溶解后,與等量pH7.2～7.4,2倍濃度的Hanks液混合,分裝小試管,每管0.5 mL,向管內(nèi)依次加50 μL 10% SRBC和20 μL脾細(xì)胞懸液,迅速混勻,傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上,做平行片,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1.5 h,用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體1∶8加到培養(yǎng)基上層,繼續(xù)溫育1.5 h后,計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.2.6.5 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅血細(xì)胞的影響 稱取0.3 g牛肉膏、1.0 g蛋白胨和0.5 g氯化鈉溶于100 mL蒸餾水中,加熱后加入5.0 g可溶性淀粉配置成5%淀粉肉湯溶液;停藥前3 d給小鼠腹腔注射5%淀粉肉湯溶液1 mL,每天1次,連續(xù)3 d。停藥次日,腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液1 mL,間隔30 min,頸椎脫臼處死經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 mL,轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min,吸出腹腔洗液1 mL。將回收的腹腔洗液注入干凈的離心管中,沖洗細(xì)胞2次,計(jì)數(shù),調(diào)整濃度至2×106個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96孔板中,100 μL每孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),使巨噬細(xì)胞貼壁,孵育3 h,清洗培養(yǎng)孔,充分棄去非黏附的淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞,獲得貼壁細(xì)胞即為單層的巨噬細(xì)胞。吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100;吞噬指數(shù)=吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用Office 2010的t檢驗(yàn),以確定兩組之間的顯著性差異,并采用Prism軟件(7.0版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同甘露醇用量對(duì)顆粒的影響 輔料的用量是影響顆粒制備的重要因素之一,不同的主藥與輔料的配伍比例會(huì)影響顆粒劑的外觀及質(zhì)量以及顆粒的日處方量。甘露醇可防止提取物吸潮,不會(huì)干擾多糖含量的測(cè)定,含量越多防潮效果越好[23]。由表2可知當(dāng)主藥和甘露醇比例為1∶1時(shí),軟材發(fā)硬,制粒困難,顆粒色澤不均,發(fā)散,粒度大小不一,堆密度低。通過(guò)對(duì)其吸濕率進(jìn)行分析,當(dāng)主藥和甘露醇比例為1∶3時(shí),吸濕率最低為1.30%,易制備軟材,制粒容易,綜合評(píng)分最高,得到的顆粒色澤均勻,粒度大小均勻。

表2 不同甘露醇用量對(duì)顆粒品質(zhì)的影響Table 2 Effect of different amounts of mannitol on particle quality

2.1.2 不同乙醇濃度對(duì)顆粒的影響 本復(fù)方是以鹿角靈芝粗多糖、富硒茶茶多酚、紫蘇粗多酚提取物粉末的形式投料,提取物具有一定的吸濕性,直接用水或低濃度的乙醇制粒,物料太粘,無(wú)法制粒,且提取物潤(rùn)濕后會(huì)產(chǎn)生較大的粘性,高濃度乙醇可以使提取物保持松散狀態(tài)[24]。由圖1結(jié)果可知,顆粒的成型率隨著乙醇濃度的增大而增大,當(dāng)乙醇濃度為75%、85%和95%,顆粒的成型率較高,當(dāng)乙醇濃度為85%時(shí),顆粒的成型率最高,為71.42%。

圖1 不同乙醇濃度對(duì)顆粒成型率的影響Fig.1 Effect of different ethanol concentration on pellet formation rate

2.1.3 不同比例聚維酮K30用量對(duì)顆粒的影響 不同比例聚維酮K30用量對(duì)顆粒制備的影響如表3所示,聚維酮K30含量為0時(shí),吸濕性較高,堆密度最低,綜合評(píng)分最低,聚維酮K30含量為2%時(shí),吸濕率最低,顆粒粒度大小較為一致,綜合評(píng)分最高。聚維酮K30為粘合劑,主要起黏結(jié)固體的作用[25],隨著聚維酮K30含量增加,成型率和休止角性逐步上升,說(shuō)明一定量的聚維酮K30可提高顆粒的成型率,對(duì)休止角影響不大,故選取聚維酮K30用量為2%。

表3 不同比例聚維酮K30用量對(duì)顆粒品質(zhì)的影響Table 3 Effects of the dosage of povidone K30 in different proportions on particle quality

2.1.4 不同干燥時(shí)間對(duì)顆粒的影響 表4表明干燥時(shí)間越短顆粒結(jié)塊越多,整粒越困難,顆粒粒度分布不均,從而影響成型率、休止角和堆密度。而干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng),部分顆粒粒度的過(guò)小,粒度差距大,顆粒的成型率下降。綜合考慮,顆粒制備干燥時(shí)間為30 min時(shí)制粒效果最好。

表4 不同干燥時(shí)間對(duì)顆粒品質(zhì)的影響Table 4 Effect of different drying time on particle quality

2.2 正交試驗(yàn)

由表5的極差分析結(jié)果看出,復(fù)方鹿角靈芝茶顆粒制備影響的主次順序?yàn)楦事洞加昧勘壤?聚維酮K30>乙醇濃度。由K值和R值評(píng)估復(fù)方鹿角靈芝茶顆粒制備最佳工藝為A2B2C3。由表6方差分析表可知乙醇濃度和聚維酮K30含量對(duì)顆粒綜合評(píng)分無(wú)顯著影響,甘露醇用量對(duì)顆粒綜合評(píng)分的影響有顯著影響。通過(guò)直觀法和方差分析表數(shù)據(jù)分析,最佳參數(shù)為主藥與甘露醇的比例為1∶3,乙醇濃度為85%,聚維酮K30含量為4%為最佳工藝。在最佳工藝條件下做3組平行試驗(yàn),驗(yàn)證復(fù)方鹿角靈芝茶顆粒的最優(yōu)工藝。結(jié)果顯示在最優(yōu)條件下復(fù)方鹿角靈芝茶顆粒綜合得分為97.62,略高于正交結(jié)果,含水量為3.50%,干燥失重為1.3%,顆粒色澤均勻,復(fù)方鹿角靈芝茶顆粒的水分、成型率、干燥失重、溶化率和外觀均符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》的相應(yīng)要求,優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表5 復(fù)方鹿角靈芝茶顆粒制備工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of the preparation process of compound antler Ganoderma lucidum tea granules

表6 復(fù)方鹿角靈芝茶顆粒制備工藝正交試驗(yàn)方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test for preparation technology of compound antler Ganoderma lucidum tea granules

2.3 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響

2.3.1 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠免疫器官的影響 胸腺和脾臟是重要的免疫器官,器官指數(shù)在一定程度上可以反應(yīng)機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱,免疫器官指數(shù)如表7所示,與空白對(duì)照組相比,復(fù)方鹿角靈芝茶低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的脾臟指數(shù)無(wú)顯著性差異,而中劑量組和高劑量組的脾臟指數(shù)有顯著性差異(P<0.05),與陽(yáng)性對(duì)照組相比,樣品組均無(wú)顯著性差異。復(fù)方鹿角靈芝茶高劑量組的脾臟指數(shù)升高(P<0.05),胸腺指數(shù)升高(P<0.05),脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)隨著劑量的升高而升高,呈一定的量效關(guān)系,表明復(fù)方鹿角靈芝茶可促進(jìn)小鼠免疫器官的發(fā)育。

表7 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響Table 7 Effect of compound antler Ganoderma lucidum tea on immune organ index in mice

2.3.2 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠體重的影響 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠體重的影響如圖2所示,小鼠給藥28 d內(nèi)體重均有所增長(zhǎng),但樣品組與空白對(duì)照組的體重差異不顯著,表明復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠體重?zé)o顯著影響。

圖2 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠體重的影響Fig.2 Effect of compound antlerGanoderma lucidum tea on body weight of mice

2.3.3 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子的影響 不同劑量的復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠分泌細(xì)胞因子的影響見(jiàn)圖3。樣品組的小鼠分泌IL-10增多,一定程度上增強(qiáng)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞的吞噬能力[26]。IL-2和IFN-γ是Th1產(chǎn)生的兩種主要的免疫調(diào)節(jié)因子,IL-2可促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生,活化巨噬細(xì)胞[27],IFN-γ可活化T細(xì)胞,NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,發(fā)揮殺傷和吞噬作用[28]。隨著復(fù)方鹿角靈芝茶劑量的增高,小鼠IL-2和IFN-γ的含量不斷增高,呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。與空白對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和樣品組中IL-10、IL-2和IFN-γ細(xì)胞因子分泌量均極顯著上升(P<0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比,低劑量組和高劑量組的IL-10分泌量顯著(P<0.05)下降,中劑量組和高劑量組的IL-2和IFN-γ分泌量顯著(P<0.05)上升。

圖3 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠分泌細(xì)胞因子的影響Fig.3 Effect of compound antlerGanoderma lucidum tea on secretion of cytokines in mice注:與空白對(duì)照組相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組相比,##表示P<0.01,#表示P<0.05;圖4同。

2.3.4 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠溶血空斑的影響 經(jīng)SRBC刺激的小鼠脾細(xì)胞懸液產(chǎn)生的補(bǔ)體能溶解分泌抗體的脾細(xì)胞周圍的 SRBC從而形成肉眼可見(jiàn)的空斑,抗體細(xì)胞形成空斑的數(shù)量與產(chǎn)生抗體的能力成正比[29],由圖4可知,與空白對(duì)照組相比,樣品組的溶血空斑數(shù)增加,中、高劑量樣品組中溶血空斑數(shù)顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),與陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。表明復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)抗體生成細(xì)胞的增殖分化有一定的增強(qiáng)作用。

圖4 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠溶血空斑的影響Fig.4 Effect of compound antlerGanoderma lucidum tea on hemolytic plaque in mice

2.3.5 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅血細(xì)胞的影響 單核-巨噬細(xì)胞對(duì)顆粒性抗原物質(zhì)具有強(qiáng)大的吞噬功能,吞噬率在一定程度上可以反映機(jī)體非特異性免疫功能的強(qiáng)弱[30]。由表8可知,樣品組的吞噬率均高于空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組,與空白對(duì)照組對(duì)比,樣品組的吞噬率和吞噬指數(shù)均極顯著(P<0.01)增加,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,樣品組的吞噬率和吞噬指數(shù)均極顯著(P<0.01)增加,高劑量組的吞噬率和吞噬指數(shù)最高,分別為128.33%,0.31%,表明復(fù)方鹿角靈芝茶能顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

表8 復(fù)方鹿角靈芝茶對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Table 8 Effect of compound antler Ganoderma lucidum tea on phagocytic ability of mouse macrophages

3 結(jié)論

復(fù)方鹿角靈芝茶中含有鹿角靈芝粗多糖0.38 g,富硒粗茶多酚1.24 g和紫蘇粗多酚33 mg。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)獲得復(fù)方鹿角靈芝茶顆粒最佳制備工藝,最佳工藝為主藥:甘露醇為1∶3,乙醇濃度為85%,聚維酮K30含量為4%,通過(guò)驗(yàn)證得到的復(fù)方鹿角靈芝顆粒的水分、成型率、干燥失重、溶化率和外觀均符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》的相應(yīng)要求,為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠的依據(jù)。小鼠溶血空斑和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能力在一定程度上反映出機(jī)體的免疫功能,復(fù)方鹿角靈芝茶可顯著(P<0.05)增加小鼠細(xì)胞因子IL-10、IL-2和IFN-γ的分泌量,提高小鼠的抗體生成細(xì)胞水平,極顯著(P<0.01)提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能。綜上所述,復(fù)方鹿角靈芝茶能夠促進(jìn)機(jī)體非特異性和特異性免疫應(yīng)答。隨著國(guó)家政策對(duì)保健品行業(yè)的大力推動(dòng),保健品市場(chǎng)快速發(fā)展,復(fù)方鹿角靈芝茶因其免疫調(diào)節(jié)作用在保健品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有極大的市場(chǎng)推廣價(jià)值。