發(fā)酵對(duì)小根蒜揮發(fā)性物質(zhì)、有機(jī)硫化合物及其抗氧化活性的影響

彭 穎,黃 晴,李 珂(.長沙商貿(mào)旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 406;.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 408)

小根蒜(AlliummacrostemonBunge)是一種藥食同源植物,多生長于我國大部分野外地區(qū),栽培較少[1-2]。作為一種野生蔬菜,小根蒜全株可作為食材,兼具蒜、蔥、藠的特殊風(fēng)味,喜愛人群廣泛。小根蒜中存在多種游離氨基酸及烴的衍生物,具有各種風(fēng)味并影響其作為食物和藥物的價(jià)值[3]。小根蒜的干燥鱗莖是一種傳統(tǒng)中藥材,稱為薤白,其抑菌、抗氧化、抗癌等藥理作用已獲得普遍認(rèn)同[4]。目前國內(nèi)外對(duì)薤白及其方劑的成分、藥理、臨床應(yīng)用有大量的研究,研究發(fā)現(xiàn)薤白中含有甾體皂苷、含氮化合物、揮發(fā)油、甾體皂甙、多糖等多種化學(xué)成分,具有增強(qiáng)免疫力、降脂、抗氧化、抗菌、肝藥酶抑制、抗抑郁等多種藥理作用[5-7]。

完整的小根蒜并無明顯刺激性氣味,當(dāng)其表皮遭到破壞時(shí),才會(huì)散發(fā)出一股強(qiáng)烈的刺激性氣味。其特殊刺激性風(fēng)味物質(zhì)的形成,主要取決于揮發(fā)性物質(zhì)的組成。對(duì)于揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè),不同的前處理方式及檢測(cè)方法導(dǎo)致其檢測(cè)結(jié)果會(huì)有所差異。吳雁等人首次用GC-MS檢測(cè)方法對(duì)薤白揮發(fā)油進(jìn)行了分析,鑒定了21種化合物,其中19種為含硫化合物,主要成分為二甲基三硫,甲基丙基三硫,甲基丙基二硫和丙基異丙基二硫[8]。也有研究者對(duì)薤白揮發(fā)油進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)主要成分為烯丙基甲基硫醚、二甲基二硫醚等小分子有機(jī)硫化物[9-10]。薤白為小根蒜的干燥鱗莖,為小根蒜的一部分,且小根蒜的莖葉同樣有食用及藥用價(jià)值,因此把小根蒜作為整體研究,更具科學(xué)意義。孫穎等人用SPME-液液萃取法分析小根蒜整體的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),發(fā)現(xiàn)成分中含量較高的化合物為醚類(8.69%),其次是醛類(3.18%)和含硫化合物(2.83%)[11]。小根蒜中的有機(jī)硫化物含量雖少,但卻是小根蒜具有刺激性特殊氣味的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵能有效去除生蒜的辛辣味及刺激性臭味,以改善口感[12],且在發(fā)酵過程伴隨著有機(jī)硫化物的轉(zhuǎn)變[13]。而有機(jī)硫化物作為蔥屬重要的生物活性物質(zhì),具有免疫活性,并參與氧化還原修飾[14-15],其前體大蒜素,也能提高抗免疫活性,預(yù)防炎癥性疾病[16]。含硫化物的組成不同,對(duì)其生理功能具有顯著影響。

發(fā)酵小根蒜是湖南湘西地區(qū)特色食品,長期以來主要在民間家庭采用傳統(tǒng)方式發(fā)酵制作,目前少數(shù)當(dāng)?shù)匦⌒褪称芳庸て髽I(yè)開展了小規(guī)模的生產(chǎn)并向市場(chǎng)推廣,但對(duì)發(fā)酵小根蒜的認(rèn)識(shí)仍存在不足。綜合現(xiàn)有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),關(guān)于新鮮及發(fā)酵小根蒜的揮發(fā)性物質(zhì)研究并不充分,特別是具有功能性的小根蒜特殊風(fēng)味物質(zhì)(有機(jī)硫化物)研究。因此,本文對(duì)比分析了小根蒜及其發(fā)酵產(chǎn)品中的揮發(fā)性物質(zhì),深入研究了揮發(fā)性物質(zhì)中有機(jī)硫化物的抗氧化特性,為揭示發(fā)酵過程對(duì)特色風(fēng)味形成、營養(yǎng)特性改變提供了重要參考依據(jù),為充分開發(fā)發(fā)酵小根蒜地方特色食品,為湘西貧困地區(qū)發(fā)展食品產(chǎn)業(yè)帶動(dòng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小根蒜花 垣縣苗漢子野生蔬菜開發(fā)專業(yè)合作社提供,產(chǎn)地湖南省花垣縣,樣品獲得后于-80 ℃儲(chǔ)存;無水乙醇、硝酸汞、三氯乙酸、硫酸高鐵銨、甲醇、甲酸、磷酸吡哆醛 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Ferrozine 上海瑞永生物科技有限公司;XAD-2樹脂 Sigma貿(mào)易有限公司;AB-8樹脂 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;X-5樹脂 東鴻化工有限公司。

7890-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司;SQD2型液相色譜-質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱 Waters科技有限公司;FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 上海精密儀器儀表有限公司;DBS-100全自動(dòng)柱層析收集系統(tǒng) 上海滬西有限公司;AUY120電子分析天平、UV2450紫外分光光度計(jì) 島津分析技術(shù)研發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 新鮮小根蒜洗凈后瀝干水,切成2 cm小段,包裝密封并放置-20 ℃?zhèn)溆谩０l(fā)酵小根蒜以新鮮小根蒜為原料,將切好的小根蒜置于密封容器中,25 ℃下自然發(fā)酵3個(gè)月。待色澤呈褐黃色并有濃郁酸味時(shí)即發(fā)酵完全,放置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

有機(jī)硫化物的提取工藝:根據(jù)文獻(xiàn)[17]方法,并加以改進(jìn)。將新鮮及發(fā)酵小根蒜勻漿處理,密封,30 ℃下磷酸吡哆醛酶解30 min。以料液比1∶4 g/mL加入無水乙醇,混勻后于水浴40 ℃下,浸提1 h。然后以1000 r/min離心10 min,上清液即為粗提取液。取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),真空條件下,溫度為40 ℃,快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇味。濃縮后的粗提取液放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥成粉。冷凍干燥條件為溫度-60 ℃,真空度為15 kPa,真空冷凍干燥時(shí)間16 h,樣品厚度不超過0.5 cm。

1.2.2 GC-MS檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì) 分別取新鮮小根蒜與發(fā)酵小根蒜5 g于密封的樣品瓶中,加入萃取溶劑無水乙醇20 mL,水浴加熱至80 ℃,保持10 min,將萃取頭放入樣品瓶中,萃取吸附20 min,吸附結(jié)束后進(jìn)樣氣相色譜-質(zhì)譜儀。解析溫度270 ℃,解吸時(shí)間30 min,采集數(shù)據(jù)。色譜柱條件:DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度為270 ℃。色譜柱升溫程序:50 ℃保持2 min,以5 ℃/min升溫,升溫至250 ℃,保持50 min,以25 ℃/min升溫,升溫至280 ℃,保持2 min。掃面范圍:30～450 amu,溶積延遲:0.5 min。質(zhì)譜條件:EI離子源,電子能量60 eV,掃描范圍m/z:30～400,全離子掃描。譜圖檢索采用NIST2017譜庫,并按各峰的質(zhì)譜裂片圖與文獻(xiàn)資料比對(duì),確定主要化學(xué)成分;采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

1.2.3 有機(jī)硫化物的測(cè)定 比較3種有機(jī)硫化物含量測(cè)定方法在小根蒜樣品測(cè)定中的適用性,最終確定1種用于后續(xù)測(cè)定。3種不同的測(cè)定方法為:定硫法測(cè)定法[18]、分光光度法[19-20]、硝酸汞滴定法[21]。

1.2.4 有機(jī)硫化物提取得率的計(jì)算方法

1.2.4.1 有機(jī)硫化物得率

式中,m1為提取獲得的有機(jī)硫化物的質(zhì)量(g);w1為小根蒜樣品的質(zhì)量(g),以干重計(jì)。

1.2.4.2 有機(jī)硫化物提取物純度

式中,m2為純化后的小根蒜有機(jī)硫化物的量(g);w2為取樣重量(g),以干重計(jì)。

1.2.5 大孔樹脂層析柱純化 小根蒜有機(jī)硫化物組分取1.2.1步驟中制備的新鮮及發(fā)酵的小根蒜粗提取液上樣于玻璃層析柱,經(jīng)大孔吸附樹脂分離純化,以獲得純度較高的有機(jī)硫化物組分。

1.2.5.1 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn) 選擇95%乙醇預(yù)處理XAD-2、AB-8、X-5三種樹脂。分別稱取三種樹脂各0.5 g于錐形瓶中,加入小根蒜粗提取液100 mL,溫度為30 ℃,振蕩頻率為100 r/min,振蕩吸附24 h后,測(cè)定溶液有機(jī)硫化物濃度,由以下公式計(jì)算樹脂的吸附量:

式中:C0為小根蒜粗提取液初始有機(jī)硫化物濃度(mg/mL);C為吸附平衡后的小根蒜粗提取液有機(jī)硫化物濃度(mg/mL);V為溶液體積(mL);M為樹脂重量(g)。

樹脂取出后,用水洗去雜質(zhì),然后加入95%乙醇30 mL,30 ℃、100 r/min下,恒溫振蕩。24 h后測(cè)定瓶中液體有機(jī)硫化物的含量。用以下公式計(jì)算樹脂的解吸率:

式中:C1為解吸液中有機(jī)硫化物濃度(mg/mL)。

為考察試驗(yàn)條件對(duì)樹脂吸附能力的影響,分別選擇吸附時(shí)間(0.5～3.0 h)、粗提液pH(2.5～5.0)及解吸時(shí)乙醇的體積分?jǐn)?shù)(50%～100%)為變量,固定其他條件(吸附時(shí)間2 h,pH4.0,乙醇體積分?jǐn)?shù)80%)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以吸附量、解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.5.2 動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn) 取30 g樹脂于95%乙醇溶液浸泡,采用濕法裝柱,取小根蒜提取液(0.1 mg/mL)以3 BV上樣量,采用乙醇溶液(濃度為1.2.5.1優(yōu)化后得到的濃度)洗脫,設(shè)置流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min,分段收集流出液,考察洗脫速度對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)解吸率的影響。確定最佳洗脫流速后,再分別考察樹脂填充量及上樣量對(duì)樹脂解吸率的影響。樹脂填充量分別為5、10、15、20、25、30 g,上樣量分別為1、2、3、4、5、6 BV。收集各組提取純化液,進(jìn)行冷凍干燥后,置于-20 ℃保存,備用。

式中:V1為解吸液的收集體積(mL)。

1.2.6 新鮮與發(fā)酵小根蒜中有機(jī)硫化物清除自由基能力的測(cè)定 新鮮及發(fā)酵小根蒜中的有機(jī)硫化物經(jīng)分離純化,得到的各組分提取液用于抗氧化檢測(cè)。DPPH自由基清除能力的測(cè)定依據(jù)參考文獻(xiàn)[22-23]進(jìn)行,以谷胱甘肽作為對(duì)照;Fe2+螯合能力的測(cè)定依據(jù)參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行,以EDTA作為對(duì)照;·OH清除能力的測(cè)定依據(jù)參考文獻(xiàn)[24]進(jìn)行,以維生素C作為對(duì)照;總還原力的測(cè)定依據(jù)參考文獻(xiàn)[25]進(jìn)行,以維生素C作為對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以O(shè)rigin 8.5以及SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用LSD或鄧肯分析比較每組均值,當(dāng)P<0.05時(shí),被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小根蒜中揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

從表1可知,2種小根蒜樣品共檢測(cè)到揮發(fā)性物質(zhì)39種,新鮮小根蒜中檢出27種,發(fā)酵后的小根蒜中檢出23種,經(jīng)過發(fā)酵后,小根蒜中的揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜的變化,有16種揮發(fā)性物質(zhì)消失,新增12種,1種揮發(fā)性物質(zhì)含量增加(3-甲基丁醛),10種含量減少。小根蒜中揮發(fā)性物質(zhì)由醛、醇、酯、酸及有機(jī)硫化物組成。新鮮小根蒜中有4類物質(zhì),包括醛類物質(zhì)8種(33.8%),醇類物質(zhì)2種(12.32%),其余為酯與酮。發(fā)酵小根蒜中有5類物質(zhì),其中醇類物質(zhì)11種(49.46%),酸類物質(zhì)只有1種,為乙酸(41.32%),酯類2種(6.67%),醛類物質(zhì)2種(0.98%),其中一種含硫。

表1 小根蒜中的揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 Volatile substances in Allium macrostemon Bunge

小根蒜的發(fā)酵過程是醛類物質(zhì)向醇類物質(zhì)和酸類物質(zhì)的轉(zhuǎn)變。相對(duì)于新鮮小根蒜,發(fā)酵小根蒜中醇類物質(zhì)中的甲醇、乙醇含量降低,丙醇、丁醇含量大幅提高,其中2-丁醇含量最高(15.12%);醛類物質(zhì)大量減少,丙醛、戊醛、己醛已完全轉(zhuǎn)化分解。微生物發(fā)酵的代謝途徑主要有醋酸、乙醇、乳酸、檸檬酸發(fā)酵,前期糖代謝可以為微生物提供發(fā)酵原料[26],在酵母菌的發(fā)酵下,乙醛被還原為乙醇,實(shí)現(xiàn)了醛類物質(zhì)向醇類物質(zhì)的轉(zhuǎn)變;而好氧型的醋酸菌能將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸,另外乳酸菌發(fā)酵也可能產(chǎn)生乙酸[27],所以新增了大量的乙酸。

新鮮小根蒜中的有機(jī)硫化物種類多于發(fā)酵后的小根蒜,新鮮小根蒜中含有15種有機(jī)硫化物,占全部揮發(fā)性物質(zhì)的52.11%,其中10種直鏈硫醚類物質(zhì)中,含烯丙基、丙烯基的有機(jī)硫化物分別有兩種,含環(huán)狀的有機(jī)硫化物有4種。發(fā)酵后的小根蒜中含有8種有機(jī)硫化物,占全部揮發(fā)性物質(zhì)1.66%,環(huán)狀有機(jī)硫化物幾乎全部分解消失。另外在發(fā)酵過程中,烯丙基、丙烯基來源于蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜,S-allyl-L-cysteine sulfoxide,SACS)、異蒜氨酸(S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜,isoalliin),這兩種有機(jī)硫化物雙鍵斷裂,分解成為二烯丙基硫化物(Diallyl sulfide,DAS)、二烯丙基二硫化物(Diallyl disulfide,DADS)等?？寡趸矫?新鮮小根蒜中含有丙烯基、烯丙基等的有機(jī)硫化物,其抗氧化性已有文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)[28]。除此之外,還有噻吩類等物質(zhì),這一類物質(zhì)及其衍生物的抗氧化性等生物學(xué)功能目前仍處于研究階段。

小根蒜在發(fā)酵前后,其揮發(fā)性物質(zhì)組成不同,是發(fā)酵小根蒜的風(fēng)味不同于新鮮小根蒜的原因。蒜在細(xì)胞破碎后,有機(jī)硫化物前體物質(zhì)在酶的作用下發(fā)生降解反應(yīng),生成大蒜素。大蒜素在常溫或光照下緩慢降解,得到終產(chǎn)物硫醚類等有機(jī)硫化物[29]。蔥屬植物因含有大蒜素,通常具有標(biāo)志性的辛辣味。新鮮小根蒜也含有這種辛辣味,同時(shí)散發(fā)出類似蔥的清香味。但經(jīng)過發(fā)酵后,小根蒜中的有機(jī)硫化物在微生物的作用下分解、轉(zhuǎn)化,發(fā)生了顯著變化,最后與酸類物質(zhì)形成了和諧的特殊氣味[30],這種特殊且又柔和的氣味也將是發(fā)酵小根蒜產(chǎn)品的一大特色。

2.2 不同方法測(cè)定的有機(jī)硫化物得率

定硫法檢測(cè)的是含有亞砜基的一類物質(zhì)[18],分光光度法檢測(cè)的是含有巰基的半胱氨酸類活性的有機(jī)硫化物[19-20],硝酸汞滴定法檢測(cè)的是含有硫離子的化合物[21]。從圖1所示,硝酸汞滴定法測(cè)得小根蒜中的有機(jī)硫化物含量最高,其次是分光光度法,檢測(cè)得率最小的是定硫法。根據(jù)之前的參考文獻(xiàn)[21],采用硝酸汞滴定法測(cè)定大蒜中的有機(jī)硫化物精密度試驗(yàn),結(jié)果顯示該方法的精密度良好。說明硝酸汞滴定法在本試驗(yàn)中用于檢測(cè)有機(jī)硫化物具有穩(wěn)定、可靠、易被檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì),因而后續(xù)測(cè)定小根蒜中有機(jī)硫化物采用硝酸汞滴定法。

圖1 不同方法測(cè)定的有機(jī)硫化物得率Fig.1 Yield of organic sulfide determined by different methods注:**表示與定硫法相比,有極顯著差異(P<0.01)。

2.3 靜態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 樹脂篩選結(jié)果 從表2可以看出XAD-2在吸附量與解析率都明顯領(lǐng)先于X-5,且優(yōu)于AB-8大孔吸附樹脂,所以試驗(yàn)選擇XAD-2大孔吸附樹脂作為粗提液中有機(jī)硫化物分離純化的材料。

表2 樹脂吸附量及解吸率Table 2 Adsorption and desorption rate of resin

2.3.2 吸附時(shí)間對(duì)吸附效果的影響 由圖2可知,XAD-2大孔樹脂對(duì)有機(jī)硫化物的吸附能力隨著吸附時(shí)間增加逐步減緩,在2.5 h后趨于飽和,因此選擇2.5 h的吸附時(shí)間繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 樹脂在不同吸附時(shí)間下對(duì)有機(jī)硫化物吸附量的影響Fig.2 Effect of adsorption time on the adsorption of organic sulfide

2.3.3 pH對(duì)吸附效果的影響 由圖3可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH為3.5,即液體原pH時(shí),XAD-2對(duì)有機(jī)硫化物的吸附量最高,隨著pH的繼續(xù)增加,吸附量卻在不斷降低,因此pH選擇為3.5。

圖3 不同pH對(duì)有機(jī)硫化物吸附量的影響Fig.3 Effect of different pH on the adsorption of organic sulfide

2.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響 由圖4可知,解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高而增高,在90%乙醇以上增長緩慢,無水乙醇時(shí)解吸率最高,考慮到樹脂預(yù)處理選用的是95%的乙醇,且無水乙醇更易揮發(fā),而造成實(shí)驗(yàn)因素不穩(wěn)定,因而選用95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇。

圖4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)有機(jī)硫化物解吸率的影響Fig.4 Effect of different volume fraction of ethanol on desorption rate of organic sulfides

2.4 動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 流速對(duì)解吸效果的影響 由圖5可知,解吸率隨流速的增高而降低,在吸附時(shí)間足夠的情況下,流速促使有機(jī)硫化物從樹脂中洗脫,慢流速讓有機(jī)硫化物在樹脂中擴(kuò)散洗脫,有利于分離,但洗脫管數(shù)相應(yīng)增加,造成有機(jī)硫化物在此過程中的損失。有機(jī)硫化物的解吸率在流速為0.5和1.5 mL/min之間較高,為了減少有機(jī)硫化物在解吸過程中的損失,且盡可能地得到分離,因此選擇流速為1.5 mL/min的條件較優(yōu)。

圖5 不同流速對(duì)有機(jī)硫化物解吸率的影響Fig.5 Effect of different velocity on the desorption rate of organic sulfide

2.4.2 樹脂填充量對(duì)解吸效果的影響 由圖6可知,在固定其他條件下,樹脂填充量越多,解吸率越低。但樹脂填充量太少時(shí),不利于洗脫液流速的控制,對(duì)上樣量也有影響。為保證樹脂能在60%以上的解吸率,且對(duì)上樣量及洗脫流速無顯著影響,因此選擇樹脂填充量為15 g。

圖6 不同樹脂填充量對(duì)有機(jī)硫化物解吸率的影響Fig.6 Effect of different resin filling amount on the desorption rate of organic sulfide

2.4.3 上樣量對(duì)解吸效果的影響 由圖7可知,在同等床體積條件下,上樣量在3 BV時(shí),解吸率最高,達(dá)到93.47%。上樣量的繼續(xù)增長降低了其解吸率,可能因其吸附量達(dá)到飽和,隨之解吸率降低。

圖7 不同上樣量對(duì)有機(jī)硫化物解吸率的影響Fig.7 Effect of different sample volumes on the desorption rate of organic sulfide

2.5 分離純化后小根蒜中總有機(jī)硫化物得率

圖8 新鮮小根蒜(A)和發(fā)酵小根蒜(B)中有機(jī)硫化物的分離結(jié)果Fig.8 Separation result of organic sulfides from fresh Allium macrostemon Bunge(A)and fermented Allium macrostemon Bunge(B)

采用無水乙醇,在溫度30 ℃、時(shí)間30 min、料液比為1∶4條件下對(duì)小根蒜進(jìn)行浸提,得到有機(jī)硫化物組分,上樣于層析柱,樹脂填充量為15 g,上樣量為3 BV,流速為1.5 mL/min,分離純化得到有機(jī)硫化物組分。新鮮小根蒜提取物獲得的總有機(jī)硫化物得率為7.7 mg/g,其純度為65.72%。發(fā)酵小根蒜提取物中有機(jī)硫化物的總得率為8.3 mg/g,其純度為65.72%。

2.6 對(duì)有機(jī)硫化物組分分離純化效果

新鮮小根蒜的分離管數(shù)達(dá)到100管,大致得到10個(gè)組分,其中第二個(gè)與第三個(gè)組分未分離完全,分離組分最佳的是第五個(gè)組分。小根蒜中的有機(jī)硫化物種類多,想要得到單個(gè)組分較為困難。

發(fā)酵小根蒜中有機(jī)硫化物的分離管數(shù)達(dá)80管,分離為9個(gè)組分,其中第3和第4個(gè)組分未分離完全,第6個(gè)與第7個(gè)組分分離不明顯。

2.7 小根蒜有機(jī)硫化物各組分清除自由基能力

新鮮及發(fā)酵小根蒜的分離液中每個(gè)組分測(cè)定其清除自由基能力,結(jié)果如表3和表4。新鮮小根蒜中清除DPPH自由基能力最好的為第1個(gè)組分(56.13%),Fe2+螯合能力最好的為第5個(gè)組分(54.82%),·OH最好的為第2個(gè)組分(83.12%),總還原能力最好的為第9個(gè)組分(0.186),綜合4個(gè)清除自由基能力的測(cè)定結(jié)果,抗氧化性最強(qiáng)的為第2個(gè)組分。

表3 新鮮小根蒜中各組分的清除自由基能力Table 3 Scavenging free radical ability of each component in fresh sample

表4 發(fā)酵小根蒜中各組分的清除自由基能力Table 4 Scavenging free radical ability of each component in fermented sample

發(fā)酵小根蒜中清除DPPH自由基能力最好的為第1個(gè)組分(60.99%),Fe2+螯合能力最好的為第9個(gè)組分(43.40%),·OH自由基清除能力最好的為第3個(gè)組分(72.11%),總還原能力最好的為第1個(gè)組分(0.195),綜合4個(gè)清除自由基能力的測(cè)定結(jié)果,抗氧化性最強(qiáng)的為第1個(gè)組分。在DPPH自由基清除能力和總還原能力方面,發(fā)酵小根蒜優(yōu)于新鮮小根蒜。

新鮮及發(fā)酵小根蒜在清除自由基能力的抗氧化性方面,顯著(P<0.05)低于陽性對(duì)照,說明小根蒜中的有機(jī)硫化物在抗氧化性的能力體現(xiàn)不在于直接清除自由基,以DPPH自由基清除能力為例,DPPH·可與H·形成分子,或接受電子,從而清除DPPH自由基[31],而有機(jī)硫化物上的分子結(jié)構(gòu)多以雙鍵、二硫鍵、環(huán)狀結(jié)構(gòu),所以在清除自由基能力上較弱。

3 討論與結(jié)論

本文采用GC-MS對(duì)新鮮小根蒜及其發(fā)酵產(chǎn)品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)在新鮮小根蒜中檢出了27種物質(zhì),主要為醛類物質(zhì);在發(fā)酵產(chǎn)品中檢出23種,主要為醇類和酸類物質(zhì)。這些變化主要通過乳酸菌、醋酸菌等能夠產(chǎn)酸的細(xì)菌代謝形成,且醛類物質(zhì)在發(fā)酵過程中被還原形成醇類物質(zhì),伴隨著酯類物質(zhì)的生成,因此發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生了獨(dú)特的香味。這種發(fā)酵過程正如沙蔥的自然發(fā)酵,主要為酒精發(fā)酵和異型乳酸菌發(fā)酵[32]。

通過進(jìn)一步研究小根蒜中的有機(jī)硫化物的分離提純方法,確定了硝酸汞滴定法是測(cè)定小根蒜中有機(jī)硫化物的最佳方法,用XAD-2大孔吸附樹脂作為小根蒜粗提液中有機(jī)硫化物分離純化的材料,在樹脂填充量為15 g,上樣量為3 BV,流速為1.5 mL/min下,分離純化效果達(dá)最優(yōu)。這種方法與柏冬等人純化大蒜總皂苷的工藝相似[33]。

小根蒜中的生物活性物質(zhì)主要為有機(jī)硫化物[34],通過比較有機(jī)硫化物純化后的各組分體外清除自由基能力,發(fā)現(xiàn)各組分有機(jī)硫化物的抗氧化效果存在顯著差異。各組分經(jīng)分離純化后,其有機(jī)硫化物純度雖顯著提高,但仍為混合物,無法確定是哪種有機(jī)硫化物的作用。同時(shí),提取工藝的不同,導(dǎo)致有機(jī)硫化物的組分也有差異[35],因此對(duì)不同自由基的清除能力也略有不同。

因此,未來將進(jìn)一步分離這一混合物,驗(yàn)證體外抗氧化活性最好的有機(jī)硫化物單體物質(zhì),以及其在生物體內(nèi)的整體抗氧化性,促進(jìn)小根蒜有機(jī)硫化物的進(jìn)一步開發(fā)利用,這將對(duì)小根蒜特色產(chǎn)品的開發(fā)及醫(yī)學(xué)藥用有重要意義。