免疫性肝損傷過程中CYP2C19體內(nèi)外活力測定的方法學(xué)建立

李曉霞，劉鳳婷，王 濤，林 琴，薛永志

(包頭醫(yī)學(xué)院藥物代謝與肝臟分子藥理研究所，藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

CYP2C19細(xì)胞色素P450同工酶屬于家族2，亞家族C，多肽19，主要在肝臟中表達(dá)，但在小腸中可發(fā)現(xiàn)較低水平的酶。占肝臟CYP總含量的6.8%，是主要的6種CYP之一[1]。CYP2C19參與質(zhì)子泵抑制劑的代謝，因此可影響胃酸反流治療，潰瘍預(yù)防和幽門螺桿菌的根除治療[2-3]。CYP2C19酶在氯吡格雷的兩個生物激活步驟中也起著至關(guān)重要的作用，從而導(dǎo)致重大心血管不良事件的風(fēng)險(xiǎn)降低或更高[1]；它影響抗抑郁藥治療和美沙酮替代療法以及伏立康唑的抗真菌作用[1,4-5]；CYP2C19代謝他莫昔芬影響乳腺癌患者的預(yù)后[1,6-7]。因此，CYP2C19對治療結(jié)果影響最大的5個醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是腸胃病學(xué)、心臟病學(xué)、精神病學(xué)、真菌學(xué)和腫瘤學(xué)[1-7]。以往對CYP2C19的研究多基于其基因多態(tài)性，而在炎癥及免疫應(yīng)激方面對代謝活力影響的研究甚少。我們在此基礎(chǔ)上，主要研究在免疫性肝損傷過程中[8-10]，CYP2C19的活力變化及代謝情況。因此，急需要建立體內(nèi)和體外CYP2C19活力的檢測方法，來評估伴有炎癥和免疫刺激等情況下，代謝酶活性變化對上述5個醫(yī)學(xué)領(lǐng)域治療方案的影響，調(diào)整劑量和藥療方案，減少藥物不良反應(yīng)和不必要的藥物相互作用，提高治療效果，做到個體化精準(zhǔn)治療。

1 材料

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器Waters高效液相系統(tǒng)(1525泵， 2996-二極管陣列紫外可見檢測器，美國)、TGL-16C型離心機(jī)和TGL-20bR低溫高速離心機(jī)由上海安亭科學(xué)儀器廠提供、日本島津AUW120D型分析天平、上海本昂科學(xué)儀器有限公司NBI-24W型氮?dú)獯蹈蓛x、姜堰市新康醫(yī)療有限公司XK96-A型快速混勻器、上海賽默飛世爾儀器有限公司MuLtiskan FC型酶標(biāo)儀，OptimaL-80XPULtracentrifuge低溫超高速離心機(jī)和3111型CO2培養(yǎng)箱、北京欣凱隆生物科技有限公司XHF-D型內(nèi)切式勻漿機(jī)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑奧美拉唑鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(含量：95.2%，批號：100760-201504)、BCG凍干粉(60 mg/支，批號：2016-01)，由中國食品藥品檢定研究院提供；奧美拉唑鈉注射液(批號：20180727G2)，從常州四藥制藥有限公司購買；奧美拉唑鎂腸溶片(批號：1912015)，購自阿斯利康制藥有限公司；武漢博士德生物工程有限公司提供BCA蛋白定量試劑盒(批號：12C17B46)；NADPH再生系統(tǒng)(批號：20180906)，從北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司購買。無水甲醇(色譜純，批號：20191023)，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；其它實(shí)驗(yàn)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物♂SD清潔級大鼠，(180～220) g，購自內(nèi)蒙古大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物許可證號SCXK(蒙)2005-0001；♂昆明種清潔級小鼠，(18～22) g，從斯貝福北京生物技術(shù)有限公司引進(jìn),動物許可證號SCXK(京)2019-0010。

2 方法

2.1 HPLC方法學(xué)建立

2.1.1色譜條件 C18高效液相色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇 ∶水=50 ∶50(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))或甲醇 ∶0.01 mol·L-1K2HPO4= 60 ∶40(體外肝微粒體實(shí)驗(yàn))；流速設(shè)置為1 mL ·min-1；進(jìn)樣量25 μL。OME對照品及代謝物5'-OHOME紫外檢測波長分別為304 nm和262 nm，柱溫30 ℃。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限 用天平稱取OME對照品5 mg加甲醇溶解配成500 mg·L-1的貯備液，置于4 ℃冰箱避光保存。吸取OME貯備液0.2 mL，并用甲醇稀釋為梯度濃度為0.25、0.5、1、2、5、10、20、30 mg·L-1的溶液，然后加入3 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，3 500 r·min-1離心10 min，分離上清置于玻璃試管中用氮?dú)獯蹈蓛x將其吹干，用300 μL流動相復(fù)溶，然后進(jìn)行HPLC分析。用測得的樣品峰面積 (Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=114 013X-239 51(R2=0.999 4，n=6)，在0.25～40 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測限為0.05 mg·L-1，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3日內(nèi)/日間精密度(RSD)和回收率 利用10、20 mg·L-1高低2種濃度和各5個樣品測定的結(jié)果計(jì)算日內(nèi)RSD；日間RSD也采用上述兩種濃度和樣品數(shù)在不同的5 d測定結(jié)果計(jì)算，詳見Tab 1。

Tab 1 OME intra-day differences，inter-day differences and recovery

2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及免疫性肝損傷模型的制備♂ SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)并正常自由進(jìn)水進(jìn)食。采用單次靜脈注射BCG (125 mg·kg-1)復(fù)制免疫性肝損傷模型，Control組靜脈注射等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)d 14，將上述大鼠各分為兩組，一組尾靜脈注射奧美拉唑鈉(5 mg·kg-1)，另外一組灌胃奧美拉唑鎂腸溶片(50 mg·kg-1)。在給藥后分別按照不同時(shí)間點(diǎn)(靜脈注射2、5、8、15、20、30和120 min；灌胃0.5、0.75、1、1.5、2、3和4 h)進(jìn)行眼內(nèi)眥靜脈叢取血，之后采用HPLC法測定CYP2C19在體內(nèi)的代謝活性。

♂昆明種小鼠稱體質(zhì)量、標(biāo)號，按隨機(jī)數(shù)列表分為Control、BCG組。采用單次靜脈注射BCG (125 mg·kg-1)復(fù)制免疫性肝損傷模型，Control組靜脈注射相同體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)d 14頸椎脫臼法處死小鼠，門靜脈灌流法沖洗肝臟，迅速取出小鼠肝臟，提取肝微粒體，HPLC法測定CYP2C19體外代謝活性。

3 結(jié)果

3.1 免疫性肝損傷對大鼠奧美拉唑在體內(nèi)代謝活性的影響

3.1.1體內(nèi)代謝的藥時(shí)曲線考察 大鼠尾靜脈注射奧美拉唑鈉5 mg·kg-1或灌胃奧美拉唑鎂腸溶片50 mg·kg-1后，用內(nèi)徑1 mm的細(xì)玻璃管于給藥后從大鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血0.2 mL于肝素化試管中，取血點(diǎn)分別是2、5、8、15、20、30、120 min(注射)或30、45、60、90、120、180、240 min(灌胃)。血樣經(jīng)3 500 r·min-1離心10 min，分離血漿。精確吸取血漿200 μL于離心管中，加入乙酸乙酯3 mL渦旋震蕩5 min，3 500 r·min-1離心10 min進(jìn)行萃取。分離上清置于玻璃試管中，40 ℃氮?dú)獯蹈桑?00 μL流動相復(fù)溶，渦旋混勻過濾后進(jìn)樣，供HPLC分析檢測。BCG免疫性肝損傷導(dǎo)致探針?biāo)幬颫ME在灌胃給藥后5、8、15、20、30 min血藥濃度明顯高于Control(P<0.05)，表明CYP2C19代謝活力降低，見Fig 1。與上述結(jié)果相似，BCG免疫性肝損傷導(dǎo)致探針?biāo)幬颫ME在注射給藥后60、90、120、180 min血藥濃度明顯高于Control(P<0.05)，表明CYP2C19代謝活力降低，見Fig 2。

Fig 1 Effect of immune liver injury on blood concentration of OME in *P<0.05，**P<0.01 vs control

Fig 2 Effect of immune liver injury on blood concentration of OME in *P<0.05，**P<0.01 vs control

3.1.2體內(nèi)代謝的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)考察 將大鼠體內(nèi)血藥濃度的經(jīng)時(shí)變化代入DAS 3.0藥代動力學(xué)分析軟件進(jìn)行分析，經(jīng)計(jì)算機(jī)擬合，大鼠體內(nèi)奧美拉唑代謝符合二房室模型。藥代動力學(xué)參數(shù)見Tab 2和Tab 3，兩種給藥途徑的藥代動力學(xué)參數(shù)出現(xiàn)相似的結(jié)果。BCG免疫性肝損傷組大鼠血漿消除半衰期(T1/2)延長，清除率(CL)減慢，曲線下面積(AUC(0-t))明顯增大，與Control比較差異具有顯著性(P<0.05)，而消除速率常數(shù)(Ke)和表觀分布容積(V)則無顯著變化。表明BCG組大鼠CYP2C19代謝活力降低。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of intravenous injection of OME in rats

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of oral OME in rats

3.2 HPLC法測定CYP2C19在體外的代謝活性

3.2.1小鼠肝微粒體的制備方法及其體外方法學(xué)建立 實(shí)驗(yàn)小鼠禁食12 h，自由飲水，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日將其麻醉后，采用冰冷生理鹽水門靜脈灌流，沖洗肝臟，使其呈土黃色。取適量肝組織于玻璃試管中，加入25%磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，內(nèi)切式勻漿機(jī)3 500 r·min-1，0.2 min制備肝組織勻漿液。

3.2.1.1 差速離心法分離小鼠肝微粒體 4 ℃，10 000 r·min-1離心20 min肝勻漿液，分離并保留上清。上清再置于超高速離心機(jī)4 ℃，100 000 r·min-1離心1 h。用25%磷酸鹽緩沖液中重懸離心后的粉紅色微粒體沉淀物，貯存于-80 ℃冰箱備用。

3.2.1.2 鈣沉淀法分離小鼠肝微粒體 將肝臟勻漿液在低溫高速離心機(jī)4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，保留上清。按照10 ∶1的比例于上清中加入CaCl2溶液(88 mmol·L-1)，充分混勻后，15 000 r·min-1離心30 min，棄上清，沉淀物中再適量加入25%磷酸鹽緩沖液，15 000 r·min-1再次離心30 min。丟棄上清后所得。加入25%磷酸鹽緩沖液適量，重懸上述粉紅色肝微粒體沉淀物，置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.1.3 BCA法測定小鼠肝微粒體的蛋白質(zhì)濃度 按照蛋白樣本 ∶生理鹽水=1 ∶30的配比將其稀釋到適宜濃度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制。把標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及稀釋好的蛋白樣本適量逐個加入96孔板中，再加入200 μL BCA工作液，充分混勻后，把96孔板放在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育30 min。把冷卻到室溫后的酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀內(nèi)測定其在562 nm處的吸光度。把測得標(biāo)準(zhǔn)品溶液(Y)濃度對吸光度值(X)做線性回歸方程，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.000 2X+0.199 6，R2=0.997 3。

3.2.1.4 構(gòu)建小鼠肝微粒體孵育體系 孵育體系總體積為200 L，由肝微粒體、Tris-鹽酸緩沖液，NADPH 1 mmol·L-1、探針?biāo)幬颫ME組成。適量濃度體積的肝微粒體中分別加入不同質(zhì)量濃度的OME和Tris-鹽酸緩沖液，先在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中預(yù)孵育5 min，然后加入NADPH(A液 ∶B液=5 ∶1)啟動催化反應(yīng)，30 min后加入3倍體積的乙酸乙酯終止反應(yīng)。旋渦5 min， 8 000 r·min-1離心10 min，把置于玻璃試管中的上清液40 ℃氮?dú)獯蹈?，?00 L流動相復(fù)溶，HPLC進(jìn)樣對CYP2C19體外代謝活性進(jìn)行測定。OME的終質(zhì)量濃度分別為400、500 mg·L-1。

3.2.1.5 不同微粒體濃度對OME代謝影響 以15 mg·L-1的OME加入孵育系統(tǒng)，觀察不同微粒體濃度對代謝率的影響，結(jié)果見Fig 3。根據(jù)數(shù)據(jù)，認(rèn)為15 mg·L-1的底物濃度，0.7 g·L-1的微粒體濃度的孵育體系最為合適。

Fig 3 Effects of different microsome concentrations on OME metabolism

3.2.1.6 不同底物濃度對OME代謝影響 見Fig 4。根據(jù)上圖數(shù)據(jù)，選擇孵育體系中加入0.7 g·L-1的微粒體，進(jìn)行不同底物濃度對代謝影響的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，10～20 mg·L-1的底物濃度處于曲線的中間部分，適合做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2.1.7 不同孵育時(shí)間對OME代謝的影響 按著上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇0.7 g·L-1的微粒體15 mg·L-1的底物濃度加入孵育體系，觀察不同的孵育時(shí)間對代謝率的影響。結(jié)果顯示，孵育20 min最合適。見Fig 5。

3.2.1.8 差速離心法和鈣沉淀法制備微粒體代謝率的比較 見Fig 3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，各個微粒體濃度下，兩種方法的代謝率相似，沒有顯著性差異。相對于差速離心法，鈣沉淀法更加便捷，不需要超高速低溫離心機(jī)，可做大樣本的實(shí)驗(yàn)。見Fig 6。

Fig 4 Effect of different substrate concentrations on OME metabolism

Fig 5 Effect of different incubation time on OME metabolism

Fig 6 Comparison of metabolic rate between two microsome preparation methods

3.2.2BCG誘導(dǎo)免疫性肝損傷對CYP2C19體外代謝活力的影響 結(jié)果如Fig 7，以5-OHOME生成率描述代謝率，反映CYP2C19體外代謝活力。與對照組比較，BCG組OME代謝活力明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05)。表明CYP2C19代謝活力下降。在400、500 mg·L-1兩個濃度都得到了相同的結(jié)論。應(yīng)用Michaelis-Menten方程和Eadie-Hofstee制圖法，計(jì)算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。Control組Vm值為82.9 nmol·min-1·mg protein，Km值為50.1 μmol·L-1；BCG組Vm值為38.6 nmol·min-1·mg protein，Km值為18.2 μmol·L-1)，表明BCG組大鼠底物親和力降低(Km)，酶促反應(yīng)速度減慢(Km)。

Fig 7 Effect of BCG immune liver injury on metabolic rate of *P<0.05，**P<0.01 vs control

4 討論

本研究建立了以O(shè)ME為探針?biāo)幬铮瑥亩疾霤YP2C19在體內(nèi)、體外代謝活性的研究方法。通過尾靜脈及灌胃給藥后，檢測血漿中OME及其代謝物5'-OHOME的血漿藥物濃度經(jīng)時(shí)變化曲線。另外將OME經(jīng)肝微粒體孵育體系后，檢測其與5-OHOME的生成、代謝速率，以此來反映CYP2C19在體外的活性變化。經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地研究，體內(nèi)CYP2C19代謝采用靜脈注射大鼠模型，相對于口服給藥，數(shù)據(jù)相對準(zhǔn)確，影響因素小。而口服給藥可能受到過多的吸收效率的個體差異的影響，數(shù)據(jù)變動范圍較大。體外肝微粒體孵育系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)可以更好地判斷肝臟藥物代謝酶的代謝活力，而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是肝臟和其它還有CYP2C19代謝酶亞型的器官代謝活力的總和。體外實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，鈣沉淀法較沿用了多年的差速離心法更加方便，數(shù)據(jù)也較穩(wěn)定，適合檢測肝臟微粒體代謝活力。分析其原因可能是CYP2C19位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)膜上，細(xì)胞破碎的程度決定酶提取的多少，內(nèi)切式勻漿機(jī)定轉(zhuǎn)速和時(shí)間可實(shí)現(xiàn)每個樣本均一的破碎程度，微粒體蛋白定量的準(zhǔn)確性進(jìn)一步保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，鈣沉淀法完全可以高效、簡便和大樣本的進(jìn)行肝臟微粒體實(shí)驗(yàn)，避免了超高速冷凍離心機(jī)的限制。孵育體系條件的精準(zhǔn)性也是實(shí)驗(yàn)成功的決定因素。孵育時(shí)間、底物濃度和微粒體的濃度都進(jìn)行了系統(tǒng)地實(shí)驗(yàn)，摸索出了合適的條件。

作為6種主要的CYP450家族中重要的一個亞族，CYP2C19活性除了受基因多態(tài)性影響，細(xì)菌、病毒等感染造成的免疫性肝損傷亦明顯影響其活性，進(jìn)而可影響機(jī)體對藥物的暴露程度，產(chǎn)生藥物不良反應(yīng)或藥物相互作用，影響個體化用藥藥療方案的制定[1]。CYP2C19參與的藥物代謝有[1-7]：質(zhì)子泵抑制劑埃索美拉唑、蘭索拉唑、奧美拉唑、托拉唑、雷貝拉唑；抗抑郁藥阿米替林；抗血小板藥氯吡格雷；5-羥色胺再攝取抑制劑類抗焦慮藥西酞普蘭、依他普侖；三環(huán)抗抑郁藥氯米帕明和丙咪嗪；抗焦慮藥氧異安定、地西泮；止痛藥美沙酮；抗真菌藥伏立康唑；抗雌激素他莫昔芬；抗病毒奈非那韋。BCG誘導(dǎo)的免疫性肝損傷過程中[8-10]，CYP2C19代謝活力下調(diào)，可影響上述多種藥物的代謝，從而影響腸胃病學(xué)、心臟病學(xué)、精神病學(xué)、真菌學(xué)和腫瘤學(xué)5大醫(yī)療領(lǐng)域的藥物治療。根據(jù)本研究，在免疫性肝損傷過程中，可合理調(diào)整上述5大領(lǐng)域的藥療方案，做到精準(zhǔn)治療，個體化治療。