3株生防細(xì)菌間親和性測定及其對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用

李恩琛，張樹武，徐秉良，劉佳，吉寶麗，唐仕娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

中國是蘋果生產(chǎn)第一大國，年產(chǎn)量穩(wěn)居世界第一[1].截止2017年，我國蘋果栽培面積達(dá)232.38萬hm2，栽培規(guī)模世界第一[2].由于蘋果病害的不斷發(fā)生，尤其蘋果樹腐爛病(Valsamali)的發(fā)生，是目前蘋果園內(nèi)最嚴(yán)重的病害之一，對蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)都帶來了不利的影響，導(dǎo)致果農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，而且這種不利影響有日趨增加的態(tài)勢，如不加以重視，將可能影響到蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3].據(jù)相關(guān)研究報道，由于樹齡老化，凍害，清園修剪不當(dāng)，管理粗放等原因我國正在經(jīng)歷第5次蘋果樹腐爛病發(fā)病高峰[4].2008年曹克強(qiáng)等[5]對我國蘋果主要產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了蘋果樹腐爛病的調(diào)查，結(jié)果顯示，在所調(diào)查的果園中，蘋果樹腐爛病發(fā)病率達(dá)52.7%，并且有逐年加重的趨勢.甘肅省作為全國蘋果重要產(chǎn)區(qū)之一，近年來一直深受腐爛病的影響，果農(nóng)損失嚴(yán)重，薛應(yīng)鈺等[6]對甘肅省主要蘋果產(chǎn)區(qū)12個縣的74個果園的腐爛病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明，在所調(diào)查的果園中蘋果樹腐爛病總體發(fā)病率為41.09%.

目前，對蘋果樹腐爛病的防治主要以化學(xué)防治為主，但長期使用化學(xué)合成農(nóng)藥不僅會殺死病原菌，而且會殺死有益微生物，破壞了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)平衡，對人類健康造成威脅、易使病原菌產(chǎn)生抗藥性等一系列問題隨之而來[7-9].生物防治具有對環(huán)境安全、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性、兼防兼治、促生等優(yōu)勢，是一種無公害植保新技術(shù)，所以利用微生物藥劑防治蘋果樹腐爛病已成為目前研究熱點(diǎn)之一[10-12].但是，相關(guān)學(xué)者研究認(rèn)為，單一生防細(xì)菌菌劑在田間實(shí)際應(yīng)用過程中存在一些劣勢，如防效易受環(huán)境因素影響，單一菌株定殖能力差，適應(yīng)能力低等，而親和性好的生防菌株間混配使用可以產(chǎn)生協(xié)同增效的作用，會提高微生物防治的穩(wěn)定性和廣度[13].陳紅等[14]研究表明，某些拮抗菌株混合后，其抑菌活性明顯高于單一菌株，并能提高植物生長速率，且混合培養(yǎng)后單位含菌量有所提高.但關(guān)于芽孢桿菌用于蘋果樹腐爛病防治的研究報道較少，尤其芽孢桿菌間復(fù)配防治蘋果樹腐爛病更是未見報道.

本試驗(yàn)以蘋果樹腐爛病原菌為研究對象，測定了不同生防細(xì)菌及其復(fù)配組合的抑菌率，以明確生防細(xì)菌及其組合的的抑菌效果，為新型的微生物藥劑的研制及田間應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試病原菌：蘋果樹腐爛病菌Valsamali，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存提供.

供試生防細(xì)菌：解淀粉芽孢桿菌TS-1203(TS-1203)Bacillusamyloliquefaciens、枯草芽孢桿菌B1(B1)Bacillussubtilis、多粘類芽孢桿菌FS-1206(FS-1206)Paenibacilluspolymyxa，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存提供.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單一生防細(xì)菌發(fā)酵菌液制備 單一生防細(xì)菌發(fā)酵菌液的制備：在60 mL NB培養(yǎng)液中接種一環(huán)活化好的生防細(xì)菌，置于28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12 h，獲得種子液.在滅菌的NYBD(60 mL)培養(yǎng)基中接種3 mL生防細(xì)菌種子液，在28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)48 h后獲得該生防細(xì)菌發(fā)酵菌液.

1.2.2 單一生防細(xì)菌發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 抑菌效果測定參考智小青等[15]采用的紙碟法和張靜等[16]采用的菌絲生長速率法，對紙碟法略作修改.接種蘋果腐爛病菌菌餅(d=5 mm)于平板中央，將分別蘸有單一生防細(xì)菌發(fā)酵菌液的圓形紙片(d=6 mm)放于距離中心位置2 cm的“十”字兩端，共計4片，以蘸有無菌水的圓形紙片作為對照，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，每個處理和對照均重復(fù)3次.

1.2.3 不同生防細(xì)菌之間親和性的測定 各細(xì)菌菌株在NA培養(yǎng)基上生長48 h后，分別接種于裝有60 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床振蕩.振蕩培養(yǎng)36 h后，取1 mL培養(yǎng)菌液稀釋至108CFU/mL ，之后取稀釋菌液200 μL用涂布器均勻涂抹于NA培養(yǎng)基上作為被測菌株；將直徑為5 mm的無菌濾紙片放入另一培養(yǎng)菌液(1010CFU/mL)，浸泡5 s后取出作為測試菌株放入含有被測菌株的NA培養(yǎng)基上，每皿2片，放入培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)48 h之后觀察兩菌株間是否有抑菌圈出現(xiàn)(親和性).各菌株培養(yǎng)菌液均作為測試菌株和被測菌株交叉測試，每個處理重復(fù)3次.

1.2.4 復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵菌液制備 復(fù)配生防細(xì)菌間發(fā)酵菌液的制備：在滅菌NYBD(60 mL)中加入不同比例生防細(xì)菌混合種子液3 mL(表1～2)，在28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床黑暗振蕩48 h后，可獲得生防細(xì)菌發(fā)酵菌液.

表1 3種生防細(xì)菌種子液復(fù)配組合

1.2.5 不同生防細(xì)菌復(fù)配發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 抑菌效果測定采用紙碟法和抑制菌絲生長速率法.接種蘋果樹腐爛病菌菌餅(d=5 mm)于平板中央，將分別蘸有復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵菌液的圓形紙片(d=6 mm)放于距離中心位置2 cm的“十”字兩端，以蘸有無菌水的圓形紙片作為對照，并置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，每個處理和對照均重復(fù)3次.

表2 FS-1206(或TS-1203)與B1種子液復(fù)配組合

1.2.6 B1、FS-1206及B1與FS-1206復(fù)配后生長曲線的測定 采用比濁法[17-18]，將在NA培養(yǎng)基上活化的生防細(xì)菌B1、FS-1206接種于NB培養(yǎng)液中，置于28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床振蕩12 h，獲得種子液，然后在滅菌NYBD(60 mL)中分別加入B1、FS-1206及B1與FS-1206混合(2∶1)種子液3 mL，繼續(xù)在28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng).分別于4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h時，取菌體培養(yǎng)液3 mL，用紫外分光光度計在600 nm下比色測定不同菌液的吸光值.以滅菌且未加種子液的NYBD培養(yǎng)液校零，每個處理重復(fù)3次.

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel整理，并采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件和Duncan氏新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及其差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 單一生防細(xì)菌發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病原菌的抑菌作用

3種生防細(xì)菌對蘋果樹腐爛病原菌的抑菌效果顯著不同(圖1和圖2).由圖1可以看出，TS-1203在3種生防細(xì)菌中對蘋果腐爛病原菌的抑菌活性最低，抑菌率為68.35，F(xiàn)S-1206趨于中間，抑菌率為74.99%.B1對腐爛病病原菌抑制效果最好，抑菌率為80.41%，與FS-1206和TS-1203都呈顯著性差異.

A:枯草芽孢桿菌B1； B：多粘類芽孢桿菌FS-1206； C:解淀粉芽孢桿菌TS-1203；D:CK.A:B.subtilis BS-1208；B：P.polymyxa FS-1206；C：B.amyloliquefaciens TS-1203.圖2 單個生防細(xì)菌發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用Figure 2 Bacteriostatic effect of single biocontrol bacterial fermentation broth on a Valsa mali

2.2 不同生防細(xì)菌間的親和性

分別將不同生防細(xì)菌培養(yǎng)菌液作為被測菌株和測試菌株交叉測試，測定3種生防細(xì)菌間的親和性，結(jié)果顯示(圖3)，B1無論作為測試菌株還是作為被測菌株，與多粘類芽孢桿菌FS-1206都表現(xiàn)為完全親和(圖3-A和圖3-B).而枯草芽孢桿菌B1作為被測菌株時，與解淀粉芽孢桿菌TS-1203完全不親和，兩菌株間有明顯抑菌圈產(chǎn)生(圖3-C)，作為測試菌株時與TS-1203基本不親和(圖3-D).當(dāng)TS-1203作為被測菌株時與FS-1206基本不親和(圖3-E)，而作為測試菌株時與FS-1206間產(chǎn)生明顯抑菌圈，表現(xiàn)為完全不親和(圖3-F).綜上可知，生防細(xì)菌菌株間的互作關(guān)系是多樣化的，對一種生防細(xì)菌來說，其與另一種生防細(xì)菌的親和性可能因條件不同而各異.

A：FS-1206作為被測，B1為測試菌株；B：B1作為被測，F(xiàn)S-1206為測試菌株；C：B1作為被測，TS-1203為測試菌株；D：TS-1203作為被測，B1為測試菌株；E：TS-1203作為被測，F(xiàn)S-1206為測試菌株；F：FS-1206作為被測，TS-1203為測試菌株.A：FS-1206 as the tested strain，B1 as the test strain；B：B1 as the tested strain，F(xiàn)S-1206 as the test strain；C：B1 as the tested strain，TS-1203 as the test strain；D：TS-1203 as the tested strain，B1 as the test strain；E：TS-1203 as the tested strain，F(xiàn)S-1206 as the test strain；F：FS-1206 as the tested strain，TS-1203 as the test strain.圖3 3種生防細(xì)菌間的親和性測定Figure 3 Determination of affinity among three biocontrol bacteria

2.3 復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病原菌的抑菌作用

由圖4可知，TS-1203、FS-1206與B1以不同比例復(fù)配后發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果不同，當(dāng)TS-1203、FS-1206與B1復(fù)配比例為2∶3∶1時，在所有復(fù)配比例中抑菌效果最好，抑菌率為78.14%，與其他復(fù)配比例抑菌率相比差異顯著.而單一生防菌株B1發(fā)酵菌液對腐爛病原菌抑菌率達(dá)80.41%，顯著高于3菌株所有復(fù)配比例，說明此3種生防細(xì)菌混合復(fù)配后對腐爛病菌的抑制效果無相加增效作用.

A：1∶1∶1；B：1∶2∶2；C：1∶3∶3；D：2∶1∶2；E：2∶2∶3；F：2∶3∶1；G：3∶1∶3；H：3∶2∶1；I：3∶3∶2；J：B1；K：FS-1206；L：TS-1203；圖上不同小寫字母表示經(jīng) Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在0.05水平差異顯著.Different lowercase letters in figure indicate that the significant differences at 0.05 level by Duncan's new complex range test.圖4 3種生防細(xì)菌復(fù)配對蘋果樹腐爛病菌的抑菌作用Figure 4 Antibacterial effect of three biocontrol bacteria combinations on Valsa mali

由圖5可知， 當(dāng)不親和組合菌株TS-1203與B1復(fù)配比例為2∶3時，其復(fù)配發(fā)酵菌液對腐爛病病原菌抑制率為45.62%，顯著高于其他復(fù)配比例.但TS-1203與B1復(fù)配后其任何比例下發(fā)酵菌液抑菌率都顯著低于單一生防菌株.

A:1∶1；B:1∶2；C:1∶3；D:2∶1；E:3∶1；F:2∶3；G:3∶2；H:B1；I:TS-1203；圖上不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在0.05水平差異顯著.Different lowercase letters in figure indicate that the significant differences at 0.05 level by Duncan's new complex range test.圖5 B1與TS-1203復(fù)配發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用Figure 5 Inhibitory effect of mixed fermentation broth of B1 and ts-1203 on Valsa mali

將親和組合菌株B1與FS-1206以不同比例復(fù)配，當(dāng)B1與FS-1206復(fù)配比例為2∶1時，其復(fù)配發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌抑制率達(dá)86.52%，顯著高于單一菌株及其他復(fù)配比例(圖6).

A:1∶1；B:1∶2；C:1∶3；D:2∶1；E:3∶1；F:2∶3；G:3∶2；H:B1；I:FS-1206；圖上不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在0.05水平差異顯著.Different lowercase letters in figure indicate that the significant differences at 0.05 level by Duncan's new complex range test.圖6 B1與FS-1206復(fù)配發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌作用Figure 6 B1 and FS-1206 compound fermentation broth have bacteriostatic effect on Valsa mali

綜上可知，B1、FS-1206、TS-1203 3種生防細(xì)菌不同組合、不同比例復(fù)配時，對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果不同.B1、 FS-1206與TS-1203不同比例復(fù)配時，其所有復(fù)配比例發(fā)酵菌液抑菌率均顯著低于單一生防細(xì)菌B1；B1與TS-1203不同比例復(fù)配時，其抑菌率都顯著低于兩種單一生防細(xì)菌發(fā)酵菌液；只有當(dāng)親和組合B1與FS-1206復(fù)配且復(fù)配比例為2∶1時對腐爛病原菌的抑制效果最好(圖6)，與單一菌株相比能顯著提高對腐爛病菌的抑菌活性.

2.4 B1、FS-1206及B1與FS-1206復(fù)配后生長曲線的測定

用紫外分光光度計在600 nm下分別比色測定B1、FS-1206及B1與FS-1206復(fù)配后不同菌液的吸光值，結(jié)果表明，3種菌液生長規(guī)律相似，在前16 h其生長速度緩慢，處于調(diào)整期，此時FS-1206的D600值為0.455，B1為0.656，B1∶FS-1206=2∶1D600為0.856；在NYBD培養(yǎng)液下發(fā)酵培養(yǎng)16 h后，菌株開始快速繁殖，各菌液濃度明顯增加，進(jìn)入生長對數(shù)期.在培養(yǎng)40 h后，F(xiàn)S-1206的D600值為1.940，B1D600值為2.182，B1∶FS-1206=2∶1復(fù)配菌液D600為2.682，其菌體生長開始趨于穩(wěn)定.在培養(yǎng)48 h之后，各培養(yǎng)菌液吸光值開始下降，出現(xiàn)了菌體生物量減少的現(xiàn)象，進(jìn)入菌體生長衰亡期.由圖6可以看出，3種菌液在相同培養(yǎng)條件下，在48 h時其吸光值都達(dá)到峰值，F(xiàn)S-1206、B1及B1與FS-1206復(fù)配D600分別為1.962、2.238、2.725，說明生防細(xì)菌菌株B1與FS-1206以2∶1復(fù)配時其生長、菌體繁殖速率及菌體數(shù)量都要明顯高于單一菌株.

圖7 FS-1206、B1及B1和FS-1206混配生長曲線Figure 7 Growth curves of FS-1206，B1，and B1 and FS-1206

3 討論

目前為止，大多數(shù)關(guān)于微生物防治植物病害的研究都還處于實(shí)驗(yàn)室階段，其中限制生物防治穩(wěn)定應(yīng)用于田間的一個重要原因就是生防微生物在田間防治效果不穩(wěn)定，受環(huán)境因素影響大.有研究表明，不同生防細(xì)菌具有不同的作用機(jī)制、不同生長需求、對環(huán)境不同的適應(yīng)能力，所以將不同生防細(xì)菌菌株混合培養(yǎng)使用，可有效提高生物防治在田間的防效及穩(wěn)定性[19-20].但不同生防細(xì)菌的混合使用并不一定能提高對病原菌的抑制效果，菌株間若存在拮抗性則會影響對植物病害的防效及穩(wěn)定性，若混合使用的生防細(xì)菌菌株彼此間不產(chǎn)生拮抗性，表現(xiàn)親和，那其混合使用后就能夠在一定程度上提高對植物病害的防治效果[21-24].本試驗(yàn)選用的3種生防細(xì)菌均能對蘋果樹腐爛病菌產(chǎn)生拮抗作用，其中以B1對腐爛病原菌抑制效果最好.

本試驗(yàn)3株細(xì)菌菌株間親和性測定結(jié)果表明，F(xiàn)S-1206與B1表現(xiàn)為完全親和，其他兩組組合間不親和.將此3種生防細(xì)菌以不同組合不同比例復(fù)配后作用于蘋果樹腐爛病病原菌發(fā)現(xiàn)，完全親和菌株B1與FS-1206以2∶1復(fù)配時，對蘋果樹腐爛病的抑菌效果最優(yōu)，顯著高于單一菌株.這說明不同拮抗菌株混合使用時，菌株間的不同作用機(jī)制和互作關(guān)系會對植物病害的防治效果產(chǎn)生影響，當(dāng)生防細(xì)菌菌株間表現(xiàn)為完全親和時，其混配使用對植物病害的防治效果會提高，這與陳志誼等[25]、傅瑩等[26]的研究結(jié)果一致.本研究分別通過對FS-1206、B1及FS-1206與B1以2∶1混合各菌液生長曲線的測定，結(jié)果表明，兩親和性好的菌株FS-1206與B1復(fù)配后，其菌體生長速度、分裂繁殖速率、活菌菌體數(shù)量均顯著高于單一生防細(xì)菌.所以，當(dāng)兩菌株間親和性好，混合發(fā)酵培養(yǎng)時，單位含菌量會有所提高，并可能分泌多種拮抗物質(zhì)，其混合作用于植物病害時可能不僅僅是簡單的累加，而是有一定的協(xié)同增效作用，這與陳紅等[ 25]、申愛榮等[15]的研究結(jié)果相似.

4 結(jié)論

綜上，多粘類芽孢桿菌FS-1206與枯草芽孢桿菌B1復(fù)配發(fā)酵菌液在蘋果樹腐爛病的生物防治方面具有良好的應(yīng)用前景.此外，室內(nèi)試驗(yàn)缺乏強(qiáng)有力的說服力，對于生防細(xì)菌復(fù)配組合對蘋果樹腐爛病的田間防效還需進(jìn)一步試驗(yàn)研究.