家蠶絲腺中FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平及RNAi分析

趙國(guó)棟,張 瀟,黃 鑫,成嘉璐,錢荷英,李 剛,徐安英

(1.江蘇科技大學(xué) 蠶業(yè)研究所/生物技術(shù)學(xué)院,鎮(zhèn)江 212100)(2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所,鎮(zhèn)江 212100)

鱗翅目昆蟲家蠶(Bombyxmori)具有強(qiáng)大的吐絲結(jié)繭能力,一直以來(lái)被人類馴養(yǎng)從而發(fā)揮出巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值,目前也是生物研究中一種極為熱門的模式動(dòng)物,是進(jìn)行生理生化、分子遺傳研究的重要模型[1-2]．

家蠶絲腺是天然的蛋白質(zhì)資源庫(kù),能夠?yàn)樾Q絲蛋白的合成提供場(chǎng)所和物質(zhì)材料．根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同,可以將家蠶絲腺分為吐絲管,前部絲腺(ASG)、中部絲腺(MSG)和后部絲腺(PSG)等[3]．家蠶絲蛋白主要由絲膠蛋白(主要在中部絲腺合成)和絲素蛋白(主要在后部絲腺合成)組成．在幼蟲各齡的眠期和蛻皮期,家蠶合成少量的絲蛋白,當(dāng)進(jìn)入五齡盛食期時(shí),絲素蛋白,絲膠蛋白在家蠶體內(nèi)大量合成[4-6]．研究表明絲蛋白基因的表達(dá)涉及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,受到多個(gè)特異因子的調(diào)控,主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平,目前已發(fā)現(xiàn)至少有6種轉(zhuǎn)錄因子參與到絲蛋白基因的表達(dá)調(diào)控中,分別是SGF-1、SGF-2、SGF-4、FMBP-1和FBF-A1[7-8]．一般認(rèn)為這些不同的蛋白結(jié)合因子通過(guò)結(jié)合絲蛋白基因上游相應(yīng)位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)對(duì)絲蛋白基因表達(dá)的調(diào)控．

最初絲腺蛋白特異性轉(zhuǎn)錄因子FMBP-1(Fibroin-modulator-binding protein-1)、FMBP-2、FMBP-3被檢測(cè)到與絲蛋白基因內(nèi)含子元件結(jié)合,后來(lái)發(fā)現(xiàn)這些FMBP均與上游元件結(jié)合[9]．從FMBP-2、FMBP-3結(jié)合的蛋白中鑒定為BmFkh和POU-M1．BmFkh在中部絲腺和后部絲腺中均有表達(dá),是絲素蛋白和ser-1基因共同的調(diào)控元件[10-11]．POU-M1基因在包括絲腺在內(nèi)的許多組織中均有表達(dá),該基因可能是一種抑制子或者與其他因子協(xié)同發(fā)揮作用[12-13]．而FMBP-1被發(fā)現(xiàn)在四齡和五齡幼蟲攝食期的后部絲腺中含量較高,但在四齡蛻皮期的中部和后部絲腺中含量較低,推測(cè)其與絲蛋白基因的特異性表達(dá)密切相關(guān)[9]．

本研究以家蠶和野桑蠶以及不同絲量品種的家蠶為供試材料,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)絲腺組織中FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平,比較其在不同品種中的轉(zhuǎn)錄水平差異,同時(shí)采用RNAi技術(shù)探究該基因在絲蛋白基因表達(dá)中發(fā)揮的作用,為進(jìn)一步研究絲蛋白基因的表達(dá)調(diào)控提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持．

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與主要試劑

1.1.1 材料供試家蠶品種菁松、皓月和大造,均由江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所品種資源組保存并提供,野桑蠶來(lái)源于江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所桑園．在標(biāo)準(zhǔn)條件下用新鮮的桑葉飼養(yǎng),飼育溫度25℃±1℃,相對(duì)濕度 60%～75%,光照晝夜12 h交替．

1.1.2 主要試劑保幼激素(JHⅢ)購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司,總RNA抽提試劑盒TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptTMFirst-strand synthesis System for RT-PCR以及SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司．siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成,序列為F:GCC GGU CGA UAU GAU ACA ATT;R:UUG UAU CAU AUC GAC CGG CTT．

1.2 方法

1.2.1 保幼激素溶液的配制及添食

先將保幼激素(JHⅢ)用95%乙醇溶解至50 μg/mL,使用時(shí)再用雙蒸水將其稀釋至10 ng/mL．將新鮮桑葉浸入保幼激素溶液5 s,自然晾干后添食家蠶5齡4 d幼蟲,以清水浸葉并晾干為對(duì)照處理．

1.2.2 家蠶絲腺總RNA的提取及cDNA第1鏈合成

將收集的各品種家蠶和野桑蠶五齡中期幼蟲絲腺置于預(yù)冷的研缽中,添加液氮研磨至粉末,加入Trizol提取組織的總RNA,-70℃保存?zhèn)溆茫崛〉目俁NA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠快速電泳檢測(cè)其完整性,并用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度．cDNA第1鏈用SuperScriptTMFirst-strand synthesis System for RT-PCR試劑盒合成,合成反應(yīng)50 μL體系包括:總RNA 1 μg,50 μmol/L Oligo(dT)16引物1 μL,5×M-MLV buffer 10 μL,10 mmol/L dNTP 2.5 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL,200 U/μL M-MLV 1 μL;于42℃反應(yīng)1 h合成cDNA,70℃ 15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶,加RNAse H 后37℃ 20 min消化剩余的RNA,-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的家蠶絲腺轉(zhuǎn)錄因子FMBP-1的編碼序列(登錄號(hào):NM-001043504.1),采用Primer5.0軟件,按照熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)所需的引物,設(shè)計(jì)的引物序列如表1．引物由上海生工生物工程股份有限公司合成．

表1 Real-time PCR引物對(duì)Table 1 Primer pairs for Real-time PCR

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒,在ABI Prism 7300型熒光定量PCR儀(美國(guó),Applied Biosystems)上進(jìn)行測(cè)定,具體實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行,反應(yīng)體系為20 μL．反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃變性1 min;隨后40個(gè)循環(huán):95 ℃ 15 s, 60 ℃ 31 s．反應(yīng)過(guò)程由測(cè)定儀軟件自動(dòng)設(shè)定,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次．

1.2.5 RNAi分析

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的家蠶絲腺轉(zhuǎn)錄因子FMBP-1的編碼序列,按照siRNA設(shè)計(jì)原則委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)．

選取生長(zhǎng)一致的家蠶皓月幼蟲,在5齡第2 d開始分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別飼養(yǎng)．注射前饑餓1 h,放置冰上1 min,用50 μL微量注射器從幼蟲背面注射FMBP-1 siRNA,每頭注射5 μg,對(duì)照組注射同體積PBS,48 h后解剖收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的中部絲腺和后部絲腺,并提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用qRT-PCR檢測(cè)RNAi后FMBP-1基因和絲蛋白基因的表達(dá)情況．

分別觀察并記錄對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)處理組家蠶化蛹、結(jié)繭、化蛾階段的變化差異,并調(diào)查兩組家蠶繭層率．

1.3 數(shù)據(jù)處理

熒光定量RT-PCR的結(jié)果數(shù)據(jù)用實(shí)驗(yàn)儀器自帶的Sequence detection software version 1.3.1軟件處理,并參照J(rèn)an H Schefe的方法進(jìn)行效率校正[14]．圖表采用Microsoft Office Excel軟件制作,并分析差異顯著性．

2 結(jié)果與分析

2.1 FMBP-1基因在不同品種家蠶和野蠶絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平差異

首先采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,分別測(cè)定了家蠶(菁松)和野蠶五齡幼蟲不同發(fā)育時(shí)間中部絲腺和后部絲腺FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平．結(jié)果如圖1：家蠶菁松5齡1 d和5齡4 d中部絲腺中FMBP-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于野蠶(圖1(a)),在后部絲腺中,5齡4 d和5齡7 dFMBP-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平同樣高于野蠶(圖1(b))．這與家蠶和野蠶蠶繭的大小是一致的,說(shuō)明該基因與絲蛋白的表達(dá)調(diào)控有一定的相關(guān)性．

“*”表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),圖2～7同．

圖1FMBP-1基因在家蠶(菁松)和野蠶絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平

Fig.1Transcriptional level ofFMBP-1 gene in the silk

glands ofBombyxmori(Jingsong)andBombyxmandarina

采用同樣的方法,分別檢測(cè)多絲量品種皓月和少絲量品種大造五齡幼蟲不同時(shí)間中部絲腺和后部絲腺中FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果如圖2，該基因在皓月品種中部絲腺和后部絲腺的五齡3個(gè)測(cè)定時(shí)間,其mRNA轉(zhuǎn)錄水平均高于大造品種(圖2),表明該基因與家蠶繭絲量存在一定的相關(guān)性．

圖2 FMBP-1基因在皓月和大造絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Transcriptional level of FMBP-1 genein the silk glands of Haoyue and Dazao

2.2 添食保幼激素對(duì)五齡幼蟲絲腺中FMBP-1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

與對(duì)照組相比,添食保幼激素(JH)后,中部絲腺中FMBP-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平先呈現(xiàn)下降趨勢(shì)然后上升,后部絲腺中,添食保幼激素后,實(shí)驗(yàn)組FMBP-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平同樣先下降后上升,而且相對(duì)表達(dá)量的峰值延遲1 d(圖3)，由此推斷FMBP-1基因參與蠶絲蛋白的合成,或?qū)z蛋白的合成起到一定的調(diào)控作用．

圖3 添食保幼激素后家蠶絲腺組織FMBP-1基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Transcriptional level of FMBP-1 gene inthe silk glands of silkworm after feeding JH

2.3 RNAi對(duì)家蠶幼蟲FMBP-1基因干擾效果及影響分析

2.3.1 RNAi對(duì)家蠶絲腺FMBP-1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過(guò)RNAi技術(shù)對(duì)家蠶皓月絲腺組織FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行干擾,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)干擾后家蠶絲腺該基因的轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果如圖4，在家蠶中部絲腺和后部絲腺中,FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比分別下降了38.9%和25.4%,說(shuō)明對(duì)FMBP-1基因的干擾效果較為顯著．

圖4 RNAi干擾后家蠶絲腺FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Transcriptional level of FMBP-1 genein the silk glands of silkworm after RNAi

2.3.2 干擾FMBP-1基因表達(dá)對(duì)家蠶表型性狀的影響

RNAi處理后家蠶表型性狀的變化，如圖5，與對(duì)照組相比,RNAi處理后的家蠶蛹體積變小,繭殼皺縮,繭層明顯變薄,化蛾后,蠶蛾腹部存在一定程度的皺縮．此外,通過(guò)RNAi干擾FMBP-1基因表達(dá)后對(duì)家蠶的繭層率也有影響,與對(duì)照組相比,RNAi實(shí)驗(yàn)組的繭層率顯著下降(圖6)．根據(jù)RNAi后家蠶表型性狀的變化,推測(cè)FMBP-1基因在絲蛋白的合成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用．

圖5 通過(guò)RNAi干擾FMBP-1基因表達(dá)的家蠶表型性狀Fig.5 Phenotype of Bombyx mori after FMBP-1gene were disturbed by RNAi

圖6 RNAi干擾FMBP-1基因表達(dá)對(duì)家蠶繭層率的影響Fig.6 Effects of silencing the expression ofFMBP-1 gene on cocoon layer rate

2.3.3 干擾FMBP-1基因表達(dá)對(duì)絲蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

為進(jìn)一步檢測(cè)FMBP-1基因?qū)z蛋白合成的作用,我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步從分子水平檢測(cè)了絲素重鏈Fib-H、絲素輕鏈Fib-L和P25基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果如圖7，F(xiàn)MBP-1基因經(jīng)RNAi干擾后,實(shí)驗(yàn)組中Fib-H、Fib-L和P25基因的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比都顯著下降,分別下降46%、41%和80%,表明FMBP-1基因?qū)z蛋白基因的轉(zhuǎn)錄有重要的作用．

圖7 干擾FMBP-1基因表達(dá)對(duì)絲蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.7 Effects of silencing the expression of FMBP-1gene on the transcriptional levels of silk protein genes

3 討論

家蠶絲腺是高度特異化的器官,具有超強(qiáng)合成絲蛋白的能力,一直是蠶業(yè)科學(xué)研究的重點(diǎn)[15]．絲蛋白基因的表達(dá)特異性受到多個(gè)特異因子調(diào)控,對(duì)家蠶絲腺功能基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究以及分析絲腺特異性表達(dá)基因的調(diào)控機(jī)制具有積極的意義．絲蛋白的合成主要在五齡盛食期,而在眠期和蛻皮期基本處于關(guān)閉狀態(tài)．家蠶在五齡中期以前,食下的桑葉蛋白質(zhì)主要用于蠶體自身的構(gòu)成,到五齡中后期,蠶體生長(zhǎng)基本完成,食入的桑葉蛋白質(zhì)則主要用于蠶絲蛋白的合成．其中,順式作用元件和反式作用因子的調(diào)控以及二者之間的相互作用對(duì)于絲蛋白在家蠶絲腺中的特異性表達(dá)常常起到重要的作用[16]．

先前的研究表明FMBP基因是一種正調(diào)節(jié)因子,主要在家蠶五齡絲腺組織表達(dá)[17]．本實(shí)驗(yàn)分析比較了家蠶和野蠶、以及多絲量品種皓月和少絲量品種大造絲腺的FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平與家蠶絲量多少密切正相關(guān)．

家蠶絲腺的生長(zhǎng)發(fā)育受到蛻皮激素和保幼激素的協(xié)同調(diào)控[18]．保幼激素由昆蟲咽側(cè)體分泌,它能夠保持幼蟲的蟲態(tài),調(diào)控昆蟲發(fā)育、變態(tài)和生殖等過(guò)程[19]．文獻(xiàn)[20-21]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)喂食保幼激素類似物可以增加15%的繭絲量,而且能促進(jìn)后部絲腺細(xì)胞RNA的合成．另有研究表明保幼激素類似物可以使家蠶幼蟲的齡期延長(zhǎng),并且可以使后部絲腺的RNA合成活性呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì),絲蛋白合成活性也呈現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)．文中通過(guò)喂食保幼激素,發(fā)現(xiàn)喂食后的家蠶絲腺內(nèi)FMBP-1基因的含量有顯著的變化,推測(cè)該基因在保幼激素的調(diào)控通路中發(fā)揮著重要作用,有待進(jìn)一步研究,也說(shuō)明該基因?qū)z蛋白合成有至關(guān)重要的作用．

此外,本實(shí)驗(yàn)還利用RNAi技術(shù),對(duì)FMBP-1基因在絲腺組織的功能進(jìn)行了探究分析,結(jié)果表明,FMBP-1基因?qū)倚Q蠶繭的繭層率有重要影響,對(duì)蠶絲蛋白的表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要作用,這與之前的研究結(jié)果也是一致的[8],當(dāng)然,調(diào)控的機(jī)理還待進(jìn)一步研究,希望本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果能為進(jìn)一步探究絲腺特異性轉(zhuǎn)錄因子的深入研究提供線索和參考．