葡萄糖氧化酶和嗜酸乳桿菌與小檗堿配伍對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用

陳景巖 耿啟泉 常娟 王平 尹清強(qiáng) 劉超齊 李茂龍 朱群 盧富山

摘要 為了獲得抗生素的最佳替代品，采用單因素和多因素設(shè)計(jì)開(kāi)展了葡萄糖氧化酶（GOD）和嗜酸乳桿菌與小檗堿（BBR）配伍對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)抑制作用的研究。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖氧化酶、嗜酸乳桿菌、小檗堿和金霉素均對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有顯著的抑制作用 （P<0.05），并且隨著濃度的增加其抑制作用逐步增強(qiáng)。多因素試驗(yàn)結(jié)果表明，選取 0.005 0%GOD和1×105 CFU/mL嗜酸乳桿菌與 0.001 5%BBR組合對(duì)大腸桿菌的抑制作用與75～150 mg/kg金霉素的抑菌作用相當(dāng)。通過(guò)該研究獲得了一種新的抗生素替代品，為畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)提供了保障。

關(guān)鍵詞 葡萄糖氧化酶;嗜酸乳桿菌;小檗堿;金霉素;抑菌作用

中圖分類號(hào) S816.7? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）20-0095-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.026

Inhibition Effects of Glucose Oxidase and Lactobacillus acidophilus and Berberine on the Proliferation of Escherichia coli

CHEN Jing-yan1，GENG Qi-quan2，CHANG Juan1 et al （1.College of Animal Science & Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450046;2.Weihui Agricultural and Rural Bureau of Henan Province，Weihui，Henan 453100）

Abstract In order to obtain the optimal substitute of antibiotics，the inhibition effects of combination of glucose oxidase （GOD） and Lactobacillus acidophilus with berberine （BBR）? on the growth of Escherichia coli were studied by single-factor and multi-factor experiments.The results of single-factor experiment showed that GOD，L.acidophilus，BBR and aureomycin individually had significant inhibitory effects on the proliferation of E.coli （P<0.05）， and the antibacterial activity gradually increased with increasing of their concentrations.The multi-factor experiments showed that the combination of 0.005 0% GOD，1×105 CFU/mL L.acidophilus and 0.001 5% BBR had the same inhibitory effect on E.coli growth with 75-150 mg/kg aureomycin.A new antibiotic substitute was obtained，which provided guarantee for the safe production of livestock products.

Key words Glucose oxidase;Lactobacillus acidophilus;Berberine;Aureomycin;Antibacterial activity

20世紀(jì)50年代我國(guó)就開(kāi)始使用抗生素類飼料添加劑來(lái)提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，但抗生素產(chǎn)生的濫用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腸胃功能紊亂，并產(chǎn)生抗藥、耐藥、二重感染以及體內(nèi)殘留等問(wèn)題，給畜禽生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的威脅。因而，尋找可代替抗生素類的飼料添加劑勢(shì)在必行 [1]。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）是一種能在動(dòng)物腸道內(nèi)定殖的益生菌，其耐酸性和抗逆性強(qiáng)，是腸道內(nèi)重要的益生菌。嗜酸乳桿菌具有調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群平衡、抑制腸道病原微生物生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力等作用，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中 [2-4]。

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種需氧脫氫酶，能專一氧化β-D-葡萄糖為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，并在此過(guò)程中消耗O2。目前，葡萄糖氧化酶已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。據(jù)報(bào)道，葡萄糖氧化酶具有抑菌、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用，且無(wú)毒、無(wú)抗藥性，是一種替代抗生素的新型添加劑，具有廣闊的應(yīng)用前景 [5]。

小檗堿（berberine，BBR）是從黃連根莖中提取的異喹林生物堿，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一。小檗堿具有顯著的抑菌作用，臨床上主要作為非處方藥，用于治療胃腸道炎癥和細(xì)菌性痢疾 [6]。由于單一因素的抑菌作用所需劑量大、效果差、成本高，所以研究低濃度嗜酸乳桿菌和葡萄糖氧化酶與小檗堿配伍對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）生長(zhǎng)的抑制作用，對(duì)于抗生素替代品的研制具有重要意義。筆者采用單因素和多因素設(shè)計(jì)開(kāi)展了葡萄糖氧化酶（GOD）和嗜酸乳桿菌與小檗堿（BBR）配伍對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)抑制作用的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用大腸桿菌和嗜酸乳桿菌均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究實(shí)驗(yàn)室保存。小檗堿（純度99%）和葡萄糖氧化酶（10 000 U/g）由河南德鄰生物制品有限公司提供，鹽酸金霉素（純度90%）由福建浦城正大生化有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH為7.0～7.2，在121 ℃、0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min，4 ℃下保存?zhèn)溆谩＂贛RS培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，吐溫80? 1 mL，磷酸氫二鉀 2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，檸檬酸銨2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH為6.2～6.6，在 121 ℃、0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min，4 ℃下保存?zhèn)溆?。③伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）：稱取42.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH為（7.2±0.2），在121 ℃、0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min，備用。

1.3 菌種活化、計(jì)數(shù)與母液配制

將大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后按照2% 接種量接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，再于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后測(cè)定活菌數(shù)，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將嗜酸乳桿菌接種到MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h后按照2%的接種量接入新鮮MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h后測(cè)定活菌數(shù)，4 ℃下保存?zhèn)溆谩７謩e將BBR、GOD、金霉素配制成0.03%、2.50%、0.15%的母液，用濾膜過(guò)濾除菌后4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同濃度GOD對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用。利用已配制好的GOD母液，分別配制成GOD終濃度為0、 0.005 0%、0.012 5%、0.025 0%的 LB培養(yǎng)液100 mL，按照1%的接種量接入大腸桿菌，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，分別在8、16、24 h對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行取樣，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)9個(gè)重復(fù)。用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基計(jì)算大腸桿菌數(shù)量（CFU/mL），用常用對(duì)數(shù)表示。

1.4.2 不同活菌數(shù)嗜酸乳桿菌對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用。將已經(jīng)計(jì)數(shù)好的嗜酸乳桿菌分別稀釋成最終活菌數(shù)為0、1×105、 1×106、1×107 CFU/mL的MRS培養(yǎng)液，將大腸桿菌按照1%的接種量接入含有不同活菌數(shù)嗜酸乳桿菌的100 mL MRS培養(yǎng)液中， 37 ℃、60 r/min搖床培養(yǎng)24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.4.3 不同濃度BBR對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用。將預(yù)先配制好的小檗堿母液配制成終濃度為0、0.001 5%、 0.003 0%、0.006 0%、0.009 0%的MRS 培養(yǎng)液100 mL，在 121 ℃、 0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min后，按照1%接種量接入大腸桿菌菌液，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.4.4 GOD與嗜酸乳桿菌組合對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用。分別配制含0.005 0%GOD的不同活菌數(shù)嗜酸乳桿菌（0、1×105、1×106、1×107 CFU/mL）的100 mL MRS培養(yǎng)液，按照1%的接種量接入大腸桿菌， 37 ℃、搖床中60 r/min培養(yǎng)24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.4.5 GOD、BBR和嗜酸乳桿菌組合對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用。分別配制含有0.005 0%GOD和0.001 5%小檗堿及不同活菌數(shù)嗜酸乳桿菌（0、1×105、1×106、1×107 CFU/mL）的MRS培養(yǎng)液100 mL，按照1%的接種量接入大腸桿菌，? 37 ℃、 60 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.4.6 GOD和BBR與嗜酸乳桿菌的不同組合以及不同濃度的金霉素對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用。配制含0.005 0%GOD、0.001 5%BBR和1×105 CFU/ml嗜酸乳桿菌的MRS培養(yǎng)液100 mL，配制金霉素有效含量分別為37.50、75.00、 150.00 mg/kg的MRS培養(yǎng)液100 mL，分別按照1%的接種量接入大腸桿菌，并以100 mL MRS培養(yǎng)液接入1%大腸桿菌作為對(duì)照組，在37 ℃、轉(zhuǎn)速60 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，其他處理同“1.4.1”。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度GOD對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用

由表1可知，僅添加2%葡萄糖對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有一定的抑制作用（P<0.05）。在僅添加單一GOD時(shí)，對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)不具有抑制作用（P>0.05），而只能在有葡萄糖共同作用下才有抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的作用（P<0.05），且隨著GOD濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng) （P<0.05）。

2.4 GOD與不同活菌數(shù)嗜酸乳桿菌組合對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用

由表4可知，0.005 0%GOD與不同活菌數(shù)的嗜酸乳桿菌組合對(duì)大腸桿菌具有顯著的抑制作用（P<0.05），并且隨著嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制大腸桿菌的作用逐漸增強(qiáng)（P<0.05）。這初步證實(shí)了低濃度GOD 與不同活菌數(shù)嗜酸乳桿菌組合的抑菌效果與高濃度GOD相當(dāng)，并具有較好的協(xié)同抑菌作用。

2.5 GOD和BBR與不同活菌數(shù)的嗜酸乳桿菌組合對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用

從表5可以看出，0.005 0%GOD和0001 5%BBR與不同活菌數(shù)嗜酸乳桿菌組合具有明顯抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的作用（P<0.05）。與單一因素或雙因素組合結(jié)果相比，低濃度的三因素組合的抑菌作用更強(qiáng)。

2.6 GOD和BBR與嗜酸乳桿菌的不同組合以及不同濃度金霉素對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用

由表6可知，低濃度GOD、BBR與嗜酸乳桿菌兩兩組合或者三者組合以及不同濃度的金霉素對(duì)大腸桿菌均具有明顯的抑制作用 （P<0.05）。其中，三因素組合的抑菌作用最強(qiáng)，與150.00 mg/kg金霉素的抑菌效果相當(dāng)。另外，GOD與嗜酸乳桿菌雙因素組合的抑菌作用效果，與75.00 mg/kg金霉素的抑菌效果相當(dāng)。

3 討論與結(jié)論

3.1 單一BBR、GOD和嗜酸乳桿菌的抑菌功能

小檗堿具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗痢疾等藥理作用 [7]，通過(guò)建立人工感染沙門氏菌小鼠體內(nèi)模型發(fā)現(xiàn)小檗堿可以抑制小鼠體內(nèi)革蘭氏陰性菌，并可延長(zhǎng)細(xì)菌感染小鼠的存活時(shí)間及降低細(xì)菌感染小鼠的死亡率 [8]。借助人工建立大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌懸浮液體外模型，結(jié)果表明小檗堿具有抑制大腸桿菌（抑菌率93.96%）、金黃色葡萄球菌（抑菌率41.88%）、白色念珠菌（抑菌率34.28%）的作用 [9]，這與該研究結(jié)果相吻合。小檗堿的抑菌機(jī)理包括抑制菌體分裂、核酸復(fù)制、致病性和蛋白酶活性，與腸道菌群相互作用，并對(duì)胃腸道黏膜具有保護(hù)作用等 [7]。

葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，能專一性氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。由于氧氣的消耗抑制了需氧菌的生長(zhǎng)，有利于厭氧益生菌的生長(zhǎng)，形成微生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，從而抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的存活，所產(chǎn)生的過(guò)氧化氫具有殺菌作用 [10]。該研究結(jié)果表明，GOD能夠顯著改善動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡以及腸道消化環(huán)境，保護(hù)腸道健康，提高飼料的利用率，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體抗病力，是一種綠色、安全、高效、對(duì)人體無(wú)毒副作用的飼料添加劑 [11]。楊久仙等 [12]研究表明日糧中添加0.2%和0.3%GOD可以顯著降低仔豬胃和回腸的大腸桿菌數(shù)量，增加仔豬胃和回腸內(nèi)乳酸菌數(shù)量。湯海鷗等 [13]開(kāi)展了GOD體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明GOD對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌生長(zhǎng)具有明顯的抑制效果。該研究結(jié)果表明，低劑量的GOD也表現(xiàn)出較好的抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的作用。

嗜酸乳桿菌是一種微生態(tài)制劑，屬于乳酸菌家族的成員，可在腸道中定殖，具有改善和調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡、抑制病原微生物生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抑制腫瘤細(xì)胞的形成等功能 [14-15]。Sartor [2]報(bào)道用嗜酸乳桿菌對(duì)137例急性腹瀉患者進(jìn)行治療，結(jié)果表明口服嗜酸乳桿菌制劑24 h后，82%的患者腹瀉次數(shù)明顯減少，糞便稠度也有改善;治療 72 h 后，所有患者排便次數(shù)和糞便稠度恢復(fù)正常。該研究結(jié)果表明，單一的嗜酸乳桿菌具有較強(qiáng)的抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的作用，且隨著嗜酸乳桿菌數(shù)量的增多，其抑菌效果逐漸增強(qiáng)，是一種較好的抗生素替代品。

3.2 GOD、BBR與嗜酸乳桿菌組合對(duì)大腸桿菌的抑制作 用

雖然單一GOD、BBR和嗜酸乳桿菌都具有良好的抑制大腸桿菌生長(zhǎng)作用，但使用劑量均較高，這在生產(chǎn)成本和實(shí)際應(yīng)用中都受到一定的限制。另外，GOD、BBR和嗜酸乳桿菌這3種產(chǎn)品均有各自的優(yōu)勢(shì)。如何發(fā)揮三者的協(xié)同作用，對(duì)于研制高效的抗生素替代品具有重要意義。

GOD可以催化葡萄糖生成葡萄糖酸，改善胃腸道酸性消化環(huán)境，當(dāng)與嗜酸乳桿菌配合可在腸道內(nèi)發(fā)揮酸化劑和微生態(tài)制劑的雙重作用，可使胃腸道內(nèi)pH降低，抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)和繁殖，促進(jìn)益生菌的增殖 [16]。趙國(guó)先等 [17]研究表明，在日糧中添加 GOD能不同程度降低回腸和空腸pH，但對(duì)胃和十二指腸中pH卻無(wú)顯著影響;同時(shí)，GOD 還具有明顯抑制大腸桿菌生長(zhǎng)、促進(jìn)盲腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌增殖的作用。嗜酸乳桿菌屬于腸道中乳桿菌屬，同時(shí)也是腸道中的益生菌類，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，與GOD配伍可以起到協(xié)同抑制大腸桿菌的作用。

Wang 等 [18]報(bào)道BBR通過(guò)減少腸道菌產(chǎn)生ATP和NADH，起到抑菌作用。Zhang 等 [19]報(bào)道小檗堿能夠增加具有短鏈脂肪酸產(chǎn)生功能的 Blautia 和 Allobaculum 等菌屬數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道pH，抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)和繁殖。據(jù)報(bào)道，益生菌和中藥提取物配伍使用通常比二者單一使用具有更強(qiáng)的抗菌作用 [20-21]，充分證實(shí)了BBR與益生菌協(xié)同抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的有效性，與該研究結(jié)果相一致。

GOD與益生菌配伍以及益生菌與BBR配伍的協(xié)同抑菌作用已有相關(guān)報(bào)道，但GOD、嗜酸乳桿菌、BBR三者協(xié)同對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究結(jié)果表明，低濃度葡萄糖氧化酶和低濃度嗜酸乳桿菌與低濃度小檗堿配伍，其抑菌作用與75～150 mg/kg金霉素相當(dāng)，充分證實(shí)了三者配伍對(duì)抑制大腸桿菌生長(zhǎng)和繁殖的有效性和疊加性，為抗生素替代及畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)提供了一種新的飼料添加劑。

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