高含油量油菜品系遺傳多樣性分析

郭凱紅，趙衛(wèi)國(guó)，王曉東，李殿榮，田建華，李保軍，陳文杰，尚麗平，張立堅(jiān)，羅 斌，王 灝，栗茂騰

(1.陜西省雜交油菜研究中心，陜西 楊凌 712100；2.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)作所，江蘇 南京 210014；3.華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

油菜是我國(guó)的第一大油料作物，種植面積常年維持在666.7萬(wàn)hm2左右，年產(chǎn)量超過(guò)1 400萬(wàn)t[1, 2]，菜籽油產(chǎn)量占國(guó)產(chǎn)油料作物產(chǎn)油量的55%以上[3]。然而，我國(guó)食用油對(duì)外依存度依然很高，2017年的進(jìn)口比例已達(dá)69.2%，進(jìn)口油菜占國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的份額不斷增加[4]，因此，在現(xiàn)有種植面積上，提高油菜籽含油量，選育高含油量品種應(yīng)是緩解我國(guó)菜籽油供需矛盾的有效途徑。 近年來(lái)，通過(guò)常規(guī)育種結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)等培育的油菜種質(zhì)資源含油量不斷提升，如華中農(nóng)業(yè)大學(xué)傅廷棟[5]、江蘇農(nóng)科院傅壽仲[6]、中國(guó)農(nóng)科院王漢中[7]等先后選育出了一批含油量超過(guò)50%的新品系。本研究團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于高油種質(zhì)創(chuàng)新和育種研究應(yīng)用，通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外不同遺傳背景的油菜品系進(jìn)行小孢子培養(yǎng)、基因聚合和生態(tài)穿梭獲得了一大批含油量50%以上、部分達(dá)到60%以上的高油種質(zhì)資源，并育成了含油量超過(guò)50%的我國(guó)第一個(gè)雜交油菜品種“秦雜油4號(hào)”[5]。我國(guó)有著豐富的高含油種質(zhì)資源，但對(duì)高油種質(zhì)資源之間的遺傳多樣性卻鮮有研究，品種間的親緣關(guān)系也不明確，優(yōu)良的高油親本不能被有效充分利用。因此研究高油種質(zhì)資源間的遺傳多樣性，拓寬高油品種的遺傳基礎(chǔ)，對(duì)高油育種親本的選擇和雜交組合選配具有重要的指導(dǎo)意義。

SRAP分子標(biāo)記分布均勻、重復(fù)性好、簡(jiǎn)單易操作、花費(fèi)少，已被廣泛應(yīng)用于油菜等作物的遺傳育種研究[8]。文雁成、王漢中等[9]用 SRAP 標(biāo)記分析中國(guó)甘藍(lán)型油菜品種的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)近60%的甘藍(lán)型油菜品種遺傳多樣性較匱乏。張羽等[10]用SRAP 標(biāo)記結(jié)合 SSR 標(biāo)記對(duì)陜南地區(qū)油菜主要育種材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示56 份該地區(qū)甘藍(lán)型油菜自交系中多數(shù)材料親緣關(guān)系較近，在育種中需要?jiǎng)?chuàng)新種質(zhì)資源。陳玉峰等[11]用SRAP標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)型油菜品種進(jìn)行含油量的遺傳多樣性進(jìn)行研究，表明高含油量供試品種間存在著較大的遺傳差異。王燕惠等用[12]SRAP分子標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外43份甘藍(lán)型油菜材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，也發(fā)現(xiàn)參試材料差異較大，彼此之間存在不同程度的親緣關(guān)系。對(duì)甘藍(lán)型油菜育種材料遺傳多樣性的研究較多，但目前還未見對(duì)甘藍(lán)型油菜高油種質(zhì)(含油量高于50%)群體間的遺傳多樣性進(jìn)行詳細(xì)地分析報(bào)道。

筆者研究以不同來(lái)源的54份高油油菜品系為材料，利用 SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，以期理清高含油量油菜種質(zhì)資源間的分子遺傳關(guān)系，為后續(xù)親本選配和雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料由陜西省雜交油菜研究中心提供，共54份，來(lái)源于國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)，通過(guò)聚合雜交、小孢子培養(yǎng)、生態(tài)、黃籽、高油雜交優(yōu)勢(shì)等育種技術(shù)多年創(chuàng)制而成。

1.2 品質(zhì)檢測(cè)

供試材料的含油量用德國(guó)BRUKER公司的PC-120核磁共振儀(NMR)進(jìn)行測(cè)定，其測(cè)定方法參照王竹云等[13]。油菜籽粒的芥酸、硫甙含量用近紅外反射光譜儀(NIRS)測(cè)定，由陜西省雜交油菜研究中心品質(zhì)分析檢測(cè)室檢測(cè)，具體方法參照陳文杰等[14]。

1.3 SRAP標(biāo)記檢測(cè)

1.3.1 DNA的提取 油菜總DNA的提取采用王灝等優(yōu)化后的SDS法[15]。提取好的DNA，溶解在 TE 溶液中，用核酸分析儀測(cè)定其濃度，保存在-80℃ 備用。

1.3.2 SRAP引物組合選擇及PCR擴(kuò)增 SRAP引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，通過(guò)引物組合篩選比較，從中選取多態(tài)性豐富的SRAP引物組合8對(duì)。

PCR擴(kuò)增反應(yīng) 反應(yīng)體系：2 μl 10×Buffer(含 20 mmol·L-1Mg2+)、0.5 μl 10 mmol·L-1dNTPs、上/下游引物(20 μmol·L-1)各1μL、2 μL DNA 模板(約 30 ng)、0.4 U Taq DNA 聚合酶，加ddH2O 至20 ul。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，35 ℃復(fù)性 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 5 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)54份高油材料進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，將電泳圖譜上清晰的條帶記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”，構(gòu)建 0/1 矩陣圖。利用POPGENE 32 軟件對(duì)SRAP 分子標(biāo)記的結(jié)果進(jìn)行包括引物擴(kuò)增總條帶數(shù)(TNB)、多態(tài)性條帶數(shù)(NPB)、多態(tài)性條帶百分比(PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)和多態(tài)性信息含量(PIC)等遺傳多樣性參數(shù)分析。用 NTSYS-pc2.10軟件中的中 DICE 法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)平均法(UPMGA)進(jìn)行聚類構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 高含油量油菜品系相關(guān)性狀分析

54份高含油量油菜品系材料背景來(lái)源、含油量、芥酸、硫苷、種皮色澤等相關(guān)性狀見表1。從表1可以看出，高油品系來(lái)自加拿大、韓國(guó)、英國(guó)和我國(guó)陜西、湖北、貴州、青海、西藏等不同地域背景材料。通過(guò)對(duì)不同背景來(lái)源的高油品系進(jìn)行分析，含油量49.98%～58.05%，其中55%以下材料38份，大于55%的材料16份。

芥酸是油分構(gòu)成中的一種脂肪酸，是重要的品質(zhì)性狀，筆者研究的高油品系中高芥酸材料22份，低芥酸材料32份(占59.62%)。在不同高油構(gòu)成中，含油量55%以下的低芥品系占52.63%，55%以上品系中低芥酸占到75%，表明經(jīng)過(guò)高油和低芥酸目標(biāo)改良選擇，在低芥酸的背景下同樣可以獲得高油，芥酸和含油量的相關(guān)性可通過(guò)遺傳改良打破。低芥酸的高油種質(zhì)成為高油種質(zhì)創(chuàng)新的必要要求。硫苷是油菜又一重要的品質(zhì)性狀指標(biāo)，其主要存在于籽粕中。筆者研究的高油品系中低硫苷品系有43份，占到79.63%，不同程度高油中，55%以下30份，55%以上13份，分別占比78.95%和81.25%。該數(shù)據(jù)表明低硫苷改良和高油沒有相關(guān)性，是不同的遺傳性狀方向。對(duì)照雙低目標(biāo)，其品系雙低率為51.85%。

粒色深淺影響種皮厚度和種皮在種子中的占比，進(jìn)而影響含油量。筆者研究的高油品系中，黑粒、五花中間色和黃粒的材料份數(shù)分別為13、13和28，各占比例為24.07%、24.07%和51.85%，黃籽材料數(shù)量居多。而含油量在55%以下的占比為黑、中、黃分別為28.95%、23.68%和47.37%；55%以上的對(duì)應(yīng)比例則為12.5%、25%和62.5%，表明隨著含油量的提升，黑籽深色種質(zhì)數(shù)量在減少，五花、黃色淺色種皮種質(zhì)數(shù)量在增多。按黑粒、五花、黃粒色統(tǒng)計(jì)平均含油量是52.75%、53.27%、53.58%，黃粒相對(duì)較高[5]，體現(xiàn)了高油和粒色具有顯著的相關(guān)性。同時(shí)，在不同粒色中皆有較高含油量的種質(zhì)，表明除粒色外，其種仁的含油量起到了更重要的貢獻(xiàn)作用，高油的形成是油分貢獻(xiàn)基因協(xié)作共同遺傳表達(dá)的結(jié)果。

表1 高含油材料品質(zhì)分析結(jié)果

續(xù)表1 高含油材料品質(zhì)分析結(jié)果

2.2 高油油菜品系的SRAP結(jié)果分析

研究從100多對(duì)SRAP引物組合中篩選出具有條帶清晰、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富的引物組合8對(duì)。通過(guò)8對(duì)引物組合對(duì)54個(gè)材料的SRAP分析，共獲得電泳條帶113個(gè)，各引物擴(kuò)增條帶數(shù)目分別在 8～26 之間，平均14.13個(gè)。其中多態(tài)性條帶83個(gè)，Rem12/Fme3組合擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)最多，達(dá)到17個(gè)，Rem14/Fme8組合擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)最少，僅為5個(gè)，平均多態(tài)條帶10.38個(gè)，多態(tài)率為73.45%。 這表明SRAP 標(biāo)記對(duì)油菜種質(zhì)資源遺傳背景具有較強(qiáng)的鑒別能力，適合用于遺傳分析的研究。

利用POPGENE 32 軟件對(duì)SRAP 分子標(biāo)記的結(jié)果進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)有效等位基因數(shù)(Effective number ofalleles，Ne)的變異范圍為 1.45～2.0，平均為 1.74；Nei’s基因多樣性指數(shù)(Neil’s sgenediversity，H)分布在1.28～1.69，均值為1.46；Shannon’s 信息指數(shù)(Shannon’s information index，I)介于 0.17～0.4，平均值為0.27。當(dāng)多態(tài)性信息含量PIC(Polymorphism information content)>0.5時(shí)，該基因座為高度多態(tài)基因座；0.25

表2 高含油材料 SRAP 標(biāo)記遺傳多樣性參數(shù)

2.3 高含油量油菜品系的聚類分析

根據(jù)上述SRAP分析結(jié)果，計(jì)算54份高含油量油菜品系之間的遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖(圖1)。聚類圖中的油菜品系編號(hào)與表1的油菜品系編號(hào)一致。聚類結(jié)果顯示：54份材料的遺傳相似系數(shù)在0.71～0.98之間，在相似性系數(shù)為0.73時(shí)，可將供試品系分為三大類，第一類為油研9號(hào)和23569兩份材料構(gòu)成，第二類是中油雜2號(hào)一個(gè)品系，剩余51份材料構(gòu)成最大的第三類群，占比94.44%，表明第一類和第二類的3份材料與其他資源遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。在相似性系數(shù)0.78處，可將供試材料分為6個(gè)類群，其中I、II類和上面一致，第三類再被分成III、IV、 V、VI四類，該分類更能詳細(xì)地對(duì)所選資源進(jìn)行分析、充分說(shuō)明問(wèn)題。

依照相似性系數(shù)0.78處的分類，I類有23569和油研9號(hào)兩份材料，II類有中油雜2號(hào)1份材料、III類西藏35單個(gè)材料、IV類由大白菜DW08和L45兩材料構(gòu)成，四大類共有6份材料，占總材料數(shù)的11.11%，分別由加拿大、我國(guó)的貴州、湖北、西藏和陜西的甘藍(lán)型油菜資源背景以及白菜型油菜源選育而來(lái)，體現(xiàn)了地域和亞種間資源背景的特異性，其遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。第V類有38份材料，是最大的類群，可分成A、B、C、D 4個(gè)亞類，加拿大的23560單獨(dú)在A亞類；春陜2B、440-1-87和9801三材料在B亞類；平陸芥菜/A74、Altex/864B、加曼42等18份聚在C亞類，其中黃粒14份，雙低品質(zhì)11份，含油量較高；L03-29、西藏69、青9917等16份材料被聚在D亞類，不同種皮色的材料數(shù)接近(黑∶中∶黃=5∶6∶5)，含油量低于55%的材料居多，有13份。第VI類有10份材料，包括中油821選、7794-54(無(wú)花瓣)、Slovx、韓2、陜3B等，黑色種皮材料5份，黃色材料4份，中間色材料1份，絕大多數(shù)材料油低于55%。該類可分成兩個(gè)亞類，21H混-5、start/1666B-1和加0023622三個(gè)雙低材料為一亞類，其他7份為另一亞類。

3 討論

含油量是油料作物-油菜最重要的性狀之一，提高含油量始終是油菜品種選育的重點(diǎn)目標(biāo)，其中的關(guān)鍵無(wú)疑是高油種質(zhì)創(chuàng)新。近年來(lái)，通過(guò)各種常規(guī)和現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合，外加核磁共振儀、近紅外儀等無(wú)損傷快速品質(zhì)測(cè)定技術(shù)的應(yīng)用，使大量高油種質(zhì)創(chuàng)新及篩選成為可能，有力地促進(jìn)了高油種質(zhì)創(chuàng)新效率。筆者研究所選高油材料的含油量多年表現(xiàn)穩(wěn)定且最高接近60%的材料，材料來(lái)自不同國(guó)別和我國(guó)主要油菜主產(chǎn)區(qū)的不同品種(系)，有自然演化的品種(系)，有人工合成和亞基因組間雜交的品種(系)，生態(tài)類型有春性、冬性和半冬性，品質(zhì)性狀有雙低、單低和雙高的，育性背景有與GMS、CMS雜優(yōu)利用緊密相關(guān)的對(duì)應(yīng)保持系、恢復(fù)系種質(zhì)，也有育種目標(biāo)特殊性狀的資源，如緊湊株型、大粒、角果上挺、黃籽等，其中很多資源是我國(guó)的重要推廣品種或重要品種的親本以及國(guó)際上的一些重要資源，性狀表現(xiàn)具有較突出的特異性、穩(wěn)定性和一致性，材料選擇具有典型性和代表性。

種質(zhì)資源的豐富度、親本組合遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近以及親緣系數(shù)的大小等遺傳背景是改善作物性狀最重要的因素，因此了解種質(zhì)資源的遺傳多樣性十分有必要。前人已經(jīng)利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性研究。臧珊等[16]在研究甘藍(lán)型油菜骨干親本的遺傳多樣性時(shí)，也發(fā)現(xiàn)SRAP標(biāo)記較少SSR更有優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶更多，多態(tài)率更高。王燕惠等[12]通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外43份甘藍(lán)型油菜材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，多態(tài)性比率為52.5%，平均每對(duì)引物為3.8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。張書芬等[17]采用SRAP標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)型油菜品種的多態(tài)性進(jìn)行分析，平均多態(tài)性條帶5.8條，每對(duì)引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性帶的比例為18.75%～38.89%，平均為28.23%。筆者研究也使用該方法對(duì)高油種質(zhì)間的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，SRAP結(jié)果顯示平均多態(tài)性條帶10.38，平均多態(tài)率為73.46%，平均每對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)為14.13個(gè)，平均多態(tài)率和多態(tài)位點(diǎn)遠(yuǎn)高于張書芬[17]、王燕惠[12]等，說(shuō)明供試材料多態(tài)性較為豐富。

基于SPAP的聚類分析將54份材料分為6大類群，各類群材料沒有與地域來(lái)源、含油量、粒色、品質(zhì)等性狀呈現(xiàn)出單一的指向性關(guān)系，但仍有較為明顯的特征和趨勢(shì)性規(guī)律，如當(dāng)遺傳系數(shù)為0.78時(shí)，75%的黃籽材料都被聚類到第Ⅴ類群，說(shuō)明黃籽材料背景具有較近的遺傳關(guān)系，這與薛漢軍[18]等研究結(jié)果一致。筆者研究中，黃籽極高油(55%以上)、黃籽普通高油(50%～55%)、黑籽極高油、黑籽普通高油也分別分布在對(duì)應(yīng)亞群中，尤其黃粒極高油除start/1666B-1外均分在Ⅴ類群中。眾多研究表明，種質(zhì)資源聚類與地理來(lái)源密切相關(guān)[19]，但筆者研究通過(guò)對(duì)聚類分布的地域因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該因素對(duì)類群分布的貢獻(xiàn)率較小，具體表現(xiàn)為同一地域來(lái)源的材料有的聚為一類，有的分屬不同的大類或亞類，而部分不同地域的材料卻被分在一起，與葉威等[20]等研究結(jié)果有差異，這是因?yàn)橛N材料或品種本身就是一個(gè)各種優(yōu)良性狀的復(fù)雜聚合，同一地域來(lái)源的材料，其遺傳背景并不一定簡(jiǎn)單一致。此外，遠(yuǎn)源背景種質(zhì)表現(xiàn)也各有不同，白菜源的大白菜DW08/K407和大多數(shù)材料距離較遠(yuǎn)，而芥菜源的平陸芥菜/A74和亞基因組置換材料孟晚C-64并沒有表現(xiàn)出與其他高油材料較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系，這可能與后續(xù)改良過(guò)程中選擇的傾向性有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中所選的高油材料品質(zhì)性狀有雙高低、單低和雙高，類群劃分與芥酸、硫苷含量的高低無(wú)明顯規(guī)律，因而高油和芥酸、硫苷的關(guān)聯(lián)性相對(duì)較低，可能主要受育種選育目標(biāo)影響。最終聚類結(jié)果是DNA水平的差異表現(xiàn)，是各種性狀基因背景的綜合反映，對(duì)應(yīng)在類群與性狀的關(guān)系上是一種多性狀交互關(guān)聯(lián)在一起形成的復(fù)雜綜合體現(xiàn)。因此，高油育種應(yīng)挖掘和利用遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的、多樣性較高的優(yōu)良品系，拓寬遺傳基礎(chǔ)，為油菜高油品種的選育提供指導(dǎo)方向。