奶牛乳房炎致病菌多重Taq-Man熒光PCR檢測(cè)方法的建立

張莉莉，丁慧妍，魏瑞成，龐茂達(dá)，何濤，包紅朵，王冉

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 210014)

奶牛乳房炎通常是指奶牛乳腺組織受到微生物感染、機(jī)械損傷、熱損傷和化學(xué)物品刺激而引起的一種炎性病變，是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最常見的感染性疾病之一，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。研究表明引起奶牛乳房炎的病原微生物多達(dá)150多種，但臨床上常見的病原菌則以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌為主，三者占總致病菌的80%～90%[2-4]。病原菌的感染不但會(huì)引起產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)量下降，而且會(huì)造成食品安全隱患，甚至危害人體健康[5]。我國(guó)臨床型乳房炎發(fā)病率在9.7%～55.6%，而隱性乳房炎發(fā)病率卻高達(dá) 61.03% ～79.62%[6]。隱性乳房炎由于已感染卻沒有明顯的臨床癥狀，加大了預(yù)防和控制的難度。因此，如何對(duì)奶牛乳房炎的進(jìn)行早期診斷，并采取有效的措施，就成了畜牧和食品安全行業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)，對(duì)病原體的快速、特異性檢測(cè)提出了迫切的要求。

Taq-Man實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，克服了傳統(tǒng)PCR耗時(shí)長(zhǎng)、易污染和擴(kuò)增后還需電泳等缺點(diǎn)，具有快速、敏感和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，已成為各種病原微生物(如非洲豬瘟病毒、埃博拉病毒、中東呼吸道綜合征冠狀病毒)核酸定量檢測(cè)的重要方法[7-9]。本研究建立了奶牛乳房炎3種主要致病菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性，可完成大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌的同時(shí)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了一管多檢，提高了奶牛乳房炎的診斷效率和治愈率，從而及時(shí)有效控制病原菌傳播，對(duì)奶牛乳房炎的臨床監(jiān)測(cè)、防控及診治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

大腸桿菌、金黃色葡萄球、無(wú)乳鏈球菌、腸炎沙門菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌菌株均由本實(shí)驗(yàn)室從奶牛乳房炎樣品中分離、測(cè)序鑒定和保存。

1.2 主要試劑及儀器

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司；2×Premix Ex Taq (Probe qPCR)、RNase-free water和pMDTM18-T 載體克隆試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒和DH5ɑ 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3 引物與探針設(shè)計(jì)

參考大腸桿菌(GenBank:CP017061.1)、金黃色葡萄球菌(GenBank:CP047021.1)和無(wú)乳鏈球菌(GenBank:CP053027.1)，使用MEGA5.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，在16S rRNA與23S rRNA之間的高度保守區(qū)域，采用Beacon Designer 7.0進(jìn)行引物和Taq-Man探針的設(shè)計(jì)，由擎科引物公司合成，引物和探針序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增引物和探針

1.4 陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

分別根據(jù)GenBank中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌的標(biāo)準(zhǔn)參考序列，人工合成相應(yīng)基因的模板序列，與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并提取重組質(zhì)粒，分別構(gòu)建3種含有目的基因的重組質(zhì)粒，并經(jīng)PCR和序列分析驗(yàn)證。

1.5 細(xì)菌DNA的提取

將保存的細(xì)菌接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h。根據(jù)Omega Bio-Tek公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA。DNA提取完成后于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Taq-Man熒光定量PCR擴(kuò)增

以3種致病菌所提取的基因組DNA為模板，并與其相對(duì)應(yīng)的引物分別進(jìn)行單重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增，RNase-free ddH2O作為陰性對(duì)照。反應(yīng)體系：2×Premix ExTaq(probe qPCR)10 μL，上下游引物及探針終濃度均為0.1 μmol/L，模板DNA 2 μL，RNase-free ddH2O 7.5 μL，總體系為20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s(收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)；50 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。結(jié)果判定采用軟件中的閾值時(shí)間(Threhold time)方法。

1.7 多重Taq-Man熒光定量PCR體系的優(yōu)化

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌3種菌所提取的基因組DNA模板作為多重PCR反應(yīng)模板，比較單重PCR結(jié)果，再對(duì)多重?zé)晒舛縋CR的引物濃度以及探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終篩選出最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.8 多重Taq-Man熒光定量PCR特異性試驗(yàn)

利用已優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、腸炎沙門菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌的基因組DNA作為模板，檢驗(yàn)反應(yīng)體系的特異性。

1.9 多重Taq-Man熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌3種菌的重組質(zhì)粒分別用RNase-free ddH2O稀釋至109～102拷貝數(shù)/μL，將各個(gè)稀釋度的DNA按照1.7優(yōu)化的反應(yīng)條件完成多重Taq-Man熒光定量PCR。以重組質(zhì)?？截悢?shù)濃度的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，并以PCR反應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)而繪制相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.10 多重Taq-Man熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

按照1.7優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，以濃度為109～102拷貝數(shù)/μL的重組質(zhì)粒為模板，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣，計(jì)算3個(gè)平行樣之間Ct值的變異系數(shù)(CV%)，以此評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.11 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)江蘇省某養(yǎng)牛場(chǎng)提供的24份臨床奶樣，按照已建立的多重Taq-Man實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 多重Taq-Man熒光定量PCR體系建立及優(yōu)化

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌的單重?zé)晒釶CR擴(kuò)增效果良好，均擴(kuò)增出明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的S型曲線，肺炎克雷伯菌作為陰性對(duì)照、RNase-ddH2O water和提取空白產(chǎn)物作為空白對(duì)照菌，均大于判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷為陰性。

通過固定大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌3種菌的基因組DNA模板濃度，對(duì)多重PCR反應(yīng)體系的引物濃度、探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。最終確定最優(yōu)PCR反應(yīng)體系為：2×Premix ExTaq(Probe qPCR) 10 μL，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌引物終濃度分別為0.2、0.15和0.25 μmol/L，探針終濃度分別為0.3、0.35和0.3 μmol/L，DNA模板2 μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)足20 μL。采用以下擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s(收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)；50 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。

若待檢測(cè)樣品無(wú)熒光擴(kuò)增曲線或Ct值大于30，則判定樣品未檢出奶牛乳房炎。若待檢測(cè)樣品有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值應(yīng)小于等于30時(shí)，則判斷樣品中檢出奶牛乳房炎。

2.2 多重Taq-Man熒光定量PCR特異性試驗(yàn)

多重Taq-Man熒光定量PCR方法的特異性的結(jié)果如表2所示。靶細(xì)菌顯示良好的PCR擴(kuò)增信號(hào)，表現(xiàn)為陽(yáng)性結(jié)果；非靶細(xì)菌Ct值大于30，表現(xiàn)為陰性結(jié)果。該試驗(yàn)表明，本試驗(yàn)所采用的引物及探針對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌具有良好的特異性，對(duì)其他非靶細(xì)菌有很好的排他性。

表2 多重Taq-Man實(shí)時(shí)熒光PCR中的引物及探針的菌株特異性分析

2.3 多重Taq-Man熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將制備的重組陽(yáng)性質(zhì)粒DNA稀釋至109～102拷貝數(shù)/μL，將各個(gè)稀釋度的DNA按照2.1中已優(yōu)化的反應(yīng)體系及條件完成熒光PCR。多重Taq-Man熒光定量PCR反應(yīng)體系對(duì)大腸桿菌的檢出濃度為103拷貝數(shù)/μL，金黃色葡萄球菌為102拷貝數(shù)/μL，無(wú)乳鏈球菌為104拷貝數(shù)/μL。以重組質(zhì)粒模板DNA拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)作圖，繪制相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。大腸桿菌熒光PCR反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999，金黃色葡萄球菌熒光PCR反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.991，無(wú)乳鏈球菌熒光PCR反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999，證明DNA拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)值與Ct值之間具有良好的線性關(guān)系。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌的擴(kuò)增效率分別為106.27%、107.77%和99.25%。

A.大腸桿菌；B.金黃色葡萄球菌；C.無(wú)乳鏈球菌;1～8.109 拷貝數(shù)/μL～102 拷貝數(shù)/μL模板濃度圖1 3種菌熒光定量PCR擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 多重Taq-Man熒光定量PCR重復(fù)性檢驗(yàn)

所建立的多重Taq-Man熒光定量PCR反應(yīng)體系檢測(cè)重組陽(yáng)性質(zhì)粒各個(gè)拷貝數(shù)濃度的變異系數(shù)均低于5% (表3)，表明體系的重復(fù)性較好。

表3 3種菌熒光定量PCR重復(fù)性結(jié)果

2.5 臨床樣品的檢測(cè)

多重Taq-Man實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌的陽(yáng)性率分別為58.3%(14/24)、33.3%(8/24)和33.3%(8/24)。其中，金黃色葡萄球菌與無(wú)乳鏈球菌混合感染檢出率為12.5%(3/24)，金黃色葡萄球菌與大腸桿菌混合感染檢出率為25%(6/24)，大腸桿菌與無(wú)乳鏈球菌的混合感染檢出率為16.7%(4/24)，3種細(xì)菌混合感染檢出率為4.1%(1/24)。

3 討論

近年，我國(guó)奶牛乳房炎的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但其臨床診斷方法主要基于加州乳房炎檢測(cè)法(CMT)和4%氫氧化鈉凝乳試驗(yàn)法，并不能追蹤病原。病原菌的分離鑒定不但操作繁雜，還耗時(shí)較長(zhǎng)，進(jìn)而錯(cuò)過最佳治療時(shí)間，造成更大經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速、有效的診斷方法，對(duì)于加強(qiáng)奶牛乳房炎的早期診斷和提高治愈率具有重要意義。奶牛乳房炎致病菌較多，湖南省、河北省及陜西省等地的奶牛乳房炎奶樣病原菌分離結(jié)果表明，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及無(wú)乳鏈球菌檢出率最高[10-12]。其中湖南省大腸桿菌陽(yáng)性檢出率為18.18%，金黃色葡萄球菌陽(yáng)性檢出率為47.72%，無(wú)乳鏈球菌陽(yáng)性檢出率為13.64%[10]；河北省大腸桿菌陽(yáng)性檢出率為23%，金黃色葡萄球菌陽(yáng)性檢出率為46%，無(wú)乳鏈球菌陽(yáng)性檢出率為25.97%，且多數(shù)感染均為兩種或兩種以上細(xì)菌的混合感染[11]。以上數(shù)據(jù)表明大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌是奶牛乳房炎的主要致病原，適合建立多重Taq-Man實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系。與普通PCR相比，Taq-Man實(shí)時(shí)熒光PCR具有更為顯著的優(yōu)點(diǎn)，如特異性強(qiáng)、敏感性高和重復(fù)性好，且快速簡(jiǎn)便，在病原微生物的檢測(cè)方面已經(jīng)廣泛應(yīng)用[13-15]。本試驗(yàn)對(duì)于送檢的24份奶樣進(jìn)行多重Taq-Man實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果表明大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌的陽(yáng)性率分別為58.3%、33.3%和33.3%，同時(shí)，均存在多種病原的混合感染。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法(體細(xì)胞計(jì)數(shù)法)僅能判斷是否為奶牛乳房炎，而不能檢測(cè)出何種病原感染，且不適合初乳期和泌乳后期，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有較強(qiáng)的主觀性。本研究建立的大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌多重Taq-Man熒光定量PCR鑒別檢測(cè)方法，特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好，為3種奶牛乳房炎主要致病原的快速檢測(cè)和流行病學(xué)提供了有效的技術(shù)手段，具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。