豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及阻斷ELISA抗體檢測方法的建立

趙少若,郝麗影,王同燕,賀筍,鄭丁丁,李俊輝,白晨雨,王遵寶,宋歡歡,鄧均華*,田克恭,*

(1.洛陽普泰生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽 471000；2.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000；3.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000；4.天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032)

豬瘟(classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起豬的高度接觸性、致死性傳染病。該病以發(fā)病急、持續(xù)高熱、全身出血和白細胞減少為特征，對我國養(yǎng)豬業(yè)的危害極其嚴重，造成了巨大的經(jīng)濟損失。CSFV 屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)[1]，該屬成員還包括牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)和邊界病毒(border disease virus，BDV)。CSFV與BVDV的氨基酸序列同源性在85%以上，存在抗原交叉性和血清學交叉反應，豬感染BVDV可出現(xiàn)類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。豬瘟疫苗在生產(chǎn)過程中易受BVDV污染，導致病毒含量和疫苗效力嚴重下降，使免疫后的豬群產(chǎn)生大量針對BVDV的抗體,對豬瘟疫苗免疫后抗體水平監(jiān)測造成影響，且BVDV污染的豬瘟疫苗免疫后可使豬群感染BVDV，給豬瘟的防控帶來極大的安全隱患和不確定因素[2-3]。CSFV是單股正鏈RNA病毒，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1、E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[4]。其中，E2蛋白是主要的免疫原性蛋白，也是建立CSFV血清學檢測方法的首選抗原，參與病毒感染過程以及誘導機體產(chǎn)生中和抗體[5]。它由ORF編碼的690(Arg)至1060(Leu)之間的370個氨基酸組成，靠近E2蛋白N端上游有一段信號肽序列，在其C端有一段跨膜區(qū)[6]。以CSFV E2蛋白作為免疫原制備的單克隆抗體具有病毒中和能力，及高度的特異性和敏感性，能夠識別病原結(jié)構(gòu)的微小差異，且已有研究證明E2蛋白上存在可以區(qū)分BVDV和CSFV的抗原表位，因此CSFV E2在血清學診斷方法中具有重要的應用價值。

疫苗免疫是豬瘟防控的重要手段，特別是我國研制的豬瘟兔化弱毒疫苗對我國及全世界的豬瘟防控發(fā)揮了重要作用[7]。豬瘟抗體檢測是評價疫苗免疫效果和制定疫苗免疫程序的依據(jù)，OIE推薦的方法有過氧化物酶聯(lián)中和試驗(NPLA)、熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。NPLA和FAVN需要培養(yǎng)病毒、耗時耗力且不能實現(xiàn)大量樣品的快速檢測，并且存在生物安全風險，而ELISA方法以其快速、簡便且能實現(xiàn)高通量檢測被廣泛應用。豬瘟病毒難純化，使用重組CSFV E2蛋白作為ELISA試劑盒的包被抗原，不僅能大量生產(chǎn)，而且生物安全風險又小[8]。目前，用原核系統(tǒng)表達的CSFV E2蛋白多以包涵體形式存在，且缺少糖基化修飾[9-10]。而用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的重組E2蛋白，不僅可分泌表達，而且表達的蛋白也可進行糖基化修飾[11-12]。本研究通過桿狀病毒表達系統(tǒng)表達CSFV不含跨膜區(qū)的E2蛋白，經(jīng)純化后免疫BALB/c小鼠制備單克隆抗體，研究證明1株單克隆抗體可用作診斷試劑。因此，將重組E2蛋白作為包被抗原，以HRP標記的單克隆抗體作為酶標試劑，建立了豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法，為豬瘟疫苗免疫效果評價和CSFV和BVDV的鑒別診斷提供了重要的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

CSFV C株、CSFV陽性血清、CSFV抗原板由洛陽普泰生物技術(shù)有限公司提供；4～6周齡和6～8周齡的SPF BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；Bac-to-Bac?HBM TOPO?Secreted Expression System試劑盒、sf9昆蟲細胞購自上海Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；His親和層析柱購自美國GE公司；HRP標記鼠抗His單克隆抗體購自MBL公司；HRP標記的羊抗豬IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG購于Sigma公司；DAB顯色試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2 重組E2蛋白的表達、鑒定及純化

參考豬瘟病毒C株(GenBank登錄號AF531433)基因組序列，選擇E2蛋白去除上游信號肽及下游跨膜區(qū)的序列，在蛋白末端添加His標簽。將本公司已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒Bacmid-E2轉(zhuǎn)染sf9細胞，待80%細胞病變后收集上清作為P1代重組桿狀病毒rBac-E2。將P1代rBac-E2感染sf9細胞，用CSFV陽性血清進行間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定。然后將rBac-E2感染sf9細胞擴大培養(yǎng)，分別收獲感染上清和細胞沉淀，通過SDS-PAGE和Western blot鑒定E2蛋白分泌情況。將獲得的重組E2蛋白按His親和層析柱試劑盒說明書進行純化，用BCA試劑盒測定其濃度后，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物免疫及間接ELISA方法的建立

將純化的CSFV E2蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化混勻，背部皮下多點免疫BALB/c小鼠，100 μg/只。免疫間隔為2周，二免和三免使用弗氏不完全佐劑。三免后7 d采血，采用間接ELISA方法檢測血清抗體效價，將純化的CSFV E2蛋白稀釋至0.5 μg/mL包被酶標板，100 μL/孔，4 ℃孵育16～24 h，洗板后加入封閉液，150 μL/孔，4 ℃封閉16～24 h。洗板后加入稀釋后的待檢血清，同時設置陰、陽性對照，37 ℃孵育1 h。洗板后加入1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min。洗板后分別加入顯色劑A、B液，37 ℃顯色15 min，用2 mol/L H2SO4終止反應，50 μL/孔。陰性對照OD450<0.2時，試驗成立，S/N (待檢樣品OD450/陰性對照OD450)≥2.1時，判為陽性；S/N<2.1時，判為陰性，待檢樣品的效價為陽性孔對應的樣品最高稀釋度。

1.4 細胞融合及篩選

選取三免后血清效價最高的小鼠進行沖擊免，3 d后按照常規(guī)方法進行細胞融合。采用1.3建立的間接ELISA方法對雜交瘤細胞進行篩選，經(jīng)過3次篩選及亞克隆后，獲得穩(wěn)定分泌特異性McAb的陽性雜交瘤細胞株。

1.5 CSFV陽性血清阻斷試驗

用純化的CSFV E2蛋白包被酶標板，封閉過夜，加入陽性雜交瘤細胞上清，同時設置陰、陽性對照及空白對照，37 ℃孵育1 h，洗板后加入CSFV陽性血清，37 ℃孵育1 h，洗板后加入HRP標記的羊抗豬IgG，37 ℃孵育30 min，最后進行顯色和終止反應，酶標儀讀數(shù)并計算阻斷率。

1.6 McAb識別抗原表位的鑒定

根據(jù)已報道的CSFV E2蛋白抗原表位[13]，選擇了1個能區(qū)別CSFV和BVDV的線性表位序列TAVSPTTLR，構(gòu)建重組GST表位多肽。以pGEX-6P-1空質(zhì)粒為模板，設計引物引入表位序列及酶切位點NcoⅠ/XhoⅠ，PCR擴增出重組表位多肽序列。將其克隆于表達載體pET-28a構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至BL21，經(jīng)IPTG誘導表達后，超聲裂解破碎。將重組表位多肽的菌體裂解液進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4 ℃封閉過夜，加入陽性雜交瘤細胞上清，室溫孵育1 h，以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，用DAB顯色液進行顯色。

1.7 McAb的制備、純化與標記

取6～8周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟，0.5 mL/只，1周后腹腔注射陽性雜交瘤細胞，15萬個/只。7～10 d后采集腹水，10 000 r/min離心5 min，上清即為單克隆抗體。將單克隆抗體用辛酸-飽和硫酸銨沉淀法和DE-52離子交換層析法[14]純化后，再用改良過碘酸鈉法[15]進行HRP標記。

1.8 阻斷ELISA方法的建立及最佳工作濃度的確定

1.8.1 阻斷ELISA方法的建立

將重組CSFV E2蛋白用PBS稀釋至一定濃度包被酶標板，100 μL/孔，4 ℃包被16～24 h。洗滌液洗滌3次，用含20%小牛血清的PBS在37 ℃下封閉2 h，200 μL/孔。洗滌液洗滌3次，每孔加入樣品稀釋液50μL，空白孔除外。將樣品、陽性對照、陰性對照加入酶標板，50 μL/孔，37 ℃反應30 min。洗滌液洗滌5次，HRP標記的單克隆抗體按一定比例稀釋后加入，100 μL/孔，空白孔除外，37 ℃反應30 min。洗滌液洗滌5次，加入顯色液避光顯色15 min。最后加入2 mol/L硫酸終止反應，酶標儀450 nm波長測定吸光值。

1.8.2 最佳工作濃度的確定

將純化的重組CSFV E2蛋白在橫排倍比稀釋：1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，酶標單抗在縱排做倍比稀釋：1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，用棋盤法確定最佳工作濃度。

1.9 阻斷ELISA方法臨界值的確定

用1.8建立的阻斷ELISA方法檢測250份CSFV抗體陽性血清和250份CSFV抗體陰性血清，根據(jù)統(tǒng)計學原理，確認該方法的cut-off值。

1.10 阻斷 ELISA方法的評價

1.10.1 特異性試驗

用建立的阻斷ELISA方法對11份特異性樣品進行檢測，包括BVDV抗體陽性血清、偽狂犬病病毒(PRV)抗體陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗體陽性血清、豬細小病毒(PPV)抗體陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)抗體陽性血清及6份CSFV抗體陰性血清。

1.10.2 敏感性試驗

將免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)效價為1∶12 800的CSFV抗體陽性血清進行一系列稀釋，用建立的阻斷ELISA方法測定其各稀釋度的血清效價。

1.10.3 重復性試驗

按建立的阻斷ELISA方法，分別進行批內(nèi)和批間重復性試驗：在同一批次的酶標板中，隨機取出1塊，檢測5份CSFV陽性血清和1份CSFV陰性血清，每份樣品設置5個復孔；另外，取5塊不同批次的酶標板，檢測5份CSFV陽性血清和1份CSFV陰性血清，每份樣品設置3個復孔。取A值計算每份樣品的算術(shù)平均值(X)和標準偏差(SD)，求得變異系數(shù)SD/X。

1.10.4 應用

用建立的阻斷ELISA方法，對已知背景的豬瘟活疫苗免疫豬的系列血清進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 CSFV E2蛋白的表達

重組質(zhì)粒Bacmid-E2轉(zhuǎn)染sf9細胞，27 ℃培養(yǎng)72 h后，可見細胞出現(xiàn)明顯病變，體積增大、細胞內(nèi)顆粒增多甚至破裂、未形成致密的細胞單層，而正常細胞為大小均一、折光性良好、輪廓清晰、并形成致密的單層細胞。收獲感染的sf9細胞上清，即重組桿狀病毒，命名為CSFV-E2株。將接種重組桿狀病毒的sf9細胞和接種野生型桿狀病毒的sf9細胞用冷丙酮固定后，加入CSFV陽性血清進行IFA特異性鑒定，結(jié)果接種重組桿狀病毒的細胞孔可見明顯的綠色熒光(圖1A)，野毒感染的細胞對照孔無綠色熒光(圖1B)，表明重組CSFV E2蛋白表達成功。

A.感染重組桿狀病毒的sf9細胞；B.野毒感染的sf9細胞圖1 重組桿狀病毒CSFV-E2株接種Sf9細胞IFA鑒定結(jié)果

2.2 CSFV E2蛋白的鑒定及純化

將CSFV E2重組桿狀病毒感染后的sf9細胞上清和細胞沉淀分別進行SDS-PAGE及Western blot鑒定。經(jīng)HRP標記的鼠抗His單克隆抗體孵育，顯色后在sf9細胞上清和細胞裂解后的沉淀中約48 kDa處出現(xiàn)目的條帶(圖2)。富集細胞上清中的目的蛋白，經(jīng)不同濃度的咪唑Tris-NaCl(pH值8.0)緩沖液洗脫后電泳(圖3)，結(jié)果顯示當咪唑的濃度為300 mmol/L時，純化效果最好。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1.重組桿狀病毒CSFV-E2株感染后的sf9細胞上清;2.重組桿狀病毒CSFV-E2株感染后的sf9細胞裂解液上清;3.重組桿狀病毒CSFV-E2株感染后的sf9細胞裂解液沉淀;4.sf9正常細胞圖2 抗His單抗Western blot鑒定重組E2蛋白

1～5.洗脫蛋白的咪唑(pH8.8)濃度為20 mmol/L,30 mmol/L,300 mmol/L,600 mmol/L和1 mol/L;M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準圖3 重組E2蛋白經(jīng)不同濃度咪唑洗脫后的SDS-PAGE

2.3 雜交瘤細胞的制備

細胞融合后經(jīng)過3次亞克隆篩選出了45株能夠穩(wěn)定分泌抗CSFV E2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞。取細胞上清進行CSFV陽性血清阻斷試驗，結(jié)果顯示4株McAbs具有較高的阻斷活性，均不低于85%。

2.4 McAb識別的抗原表位鑒定

將重組表位多肽經(jīng)原核表達后進行SDS-PAGE，目的條帶在28 kDa左右。分別與4株具有較高阻斷活性的McAbs 進行Western blot鑒定，結(jié)果只有15A9能特異性識別表位多肽，且與對照不反應(圖4)，表明15A9識別的表位為能夠區(qū)分CSFV和BVDV的表位TAVSPTTLR。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1.對照蛋白;2.重組表位多肽圖4 McAb 15A9識別抗原表位的Western blot鑒定結(jié)果

2.5 McAb的制備、純化與標記

選擇陽性雜交瘤細胞15A9，利用BALB/c小鼠制備了腹水，經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨沉淀法和DE-52離子交換層析法進行純化，并通過改良過碘酸鈉法進行HRP標記，獲得了HRP標記的單克隆抗體。

2.6 阻斷ELISA方法的建立

根據(jù)棋盤滴定法的結(jié)果，確定重組CSFV E2蛋白的包被濃度為2.5 μg/mL，HRP標記的抗體稀釋度為1∶8 000。

2.7 阻斷ELISA方法臨界值的確定

用建立的豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法檢測250份CSFV陽性血清和250份CSFV陰性血清，CSFV陽性血清和陰性血清的阻斷率均呈正態(tài)分布。以單側(cè)94%的可信度計算本方法的cut-off值，其中陰性血清阻斷率平均值為18%，標準差為0.062，其阻斷率臨界值為30.4%；陽性血清阻斷率平均值為63%，標準差為0.117，其阻斷率臨界值為39.6%。據(jù)此，將阻斷ELISA方法的cut-off定為：樣品阻斷率≥40%者為CSFV抗體陽性，樣品阻斷率≤30%者為CSFV抗體陰性，樣品阻斷率在30%～40%之間，判為可疑。

2.8 阻斷ELISA方法的評價

2.8.1 特異性試驗

用建立的阻斷ELISA方法檢測11份特異性樣品，結(jié)果均為陰性(表1)，說明建立的檢測方法特異性良好。

表1 特異性試驗檢測結(jié)果

2.8.2 敏感性試驗

將IPMA效價為1∶12 800的CSFV陽性血清進行梯度稀釋，稀釋后對應的IPMA效價依次為：1∶6 400，1∶3 200，1∶1 600，1∶800，1∶400，1∶200。當豬瘟抗體IPMA效價為1∶800時，檢測結(jié)果仍為陽性；當IPMA效價為1∶400和1∶200時，檢測結(jié)果為陰性(表2)。

表2 敏感性試驗檢測結(jié)果

2.8.3 重復性試驗

阻斷ELISA方法重復性試驗結(jié)果顯示，批內(nèi)重復性試驗變異系數(shù)為2.13%～7.56%，批間重復性試驗的變異系數(shù)為2.87%～8.49%，均低于10%(表3)，說明該方法的可重復性良好。

表3 批內(nèi)重復性試驗和批間重復性試驗結(jié)果(OD450)

2.8.4 應用

用自建的阻斷ELISA方法檢測豬瘟疫苗免疫后0～70 d血清中豬瘟抗體水平，結(jié)果顯示，最早檢出時間為免疫后14 d(圖5)。

圖5 豬瘟疫苗免疫后ELISA抗體檢測結(jié)果

3 討論

豬瘟病毒E2蛋白為位于病毒粒子表面的囊膜糖蛋白，含有4個相對獨立的抗原區(qū)域(A、B、C、D)，其中位于N端的A、B、C是產(chǎn)生中和抗體的主要區(qū)域，含有5個潛在的糖基化位點，而缺少糖基化修飾的E2蛋白不能誘導機體產(chǎn)生中和抗體[17-18]。雖然非糖基化和糖基化的重組CSFV E2蛋白均能和豬瘟病毒抗體反應，但后者結(jié)合豬瘟抗體的能力優(yōu)于前者[18-20]。本研究表達的CSFV E2蛋白的目的分子量為43 kDa，經(jīng)糖基化修飾后，其分子量大小為48 kDa左右。CSFV E2蛋白的C端有疏水的跨膜區(qū)(TMR)，表達含跨膜區(qū)的CSFV E2蛋白，雖然可獲得與CSFV E2蛋白相同大小的片段，但均為胞內(nèi)不溶性表達，而表達不含跨膜區(qū)的豬瘟病毒E2蛋白，可獲得分泌表達的重組蛋白[10,21-22]。本研究選擇用含蜂素肽信號肽的桿狀病毒載體表達不含跨膜區(qū)的豬瘟病毒E2蛋白，雖然有部分CSFV E2蛋白分泌到細胞外，但大部分仍在細胞內(nèi)，未能有效分泌到細胞外。雖然還不清楚重組豬瘟E2蛋白不能有效分泌到細胞外的原因，但我們分析可能和重組CSFV E2蛋白在細胞內(nèi)空間折疊有關(guān)。將表達重組CSFV E2蛋白的桿狀病毒接種sf9細胞的培養(yǎng)物電泳，在細胞裂解液沉淀中除48 kDa目的條帶外，還出現(xiàn)35～48 kDa條帶，相同情況在其它研究中也有報道，推測可能為重組蛋白在C端發(fā)生斷裂[10,18]。同時，為檢測重組桿狀病毒CSFV-E2株接種sf9細胞培養(yǎng)上清存在形式，將經(jīng)親和層析純化的重組CSFV E2蛋白進行分子篩進一步純化，收集不同峰后進行變性和非變性電泳，結(jié)果顯示純化蛋白除單體外，二聚體和多聚體亦存在。

目前對于豬瘟的防治主要依賴于疫苗免疫，ELISA方法以其簡便、檢測樣本量大等優(yōu)點，多用于疫苗免疫效果的評價。國內(nèi)研制的間接ELSIA豬瘟抗體檢測的方法雖然靈敏性較好，但不易有效鑒別黃病毒科瘟病毒屬的其他病毒產(chǎn)生的抗體，且包被的抗原一般為原核表達的E2蛋白，缺少糖基化修飾，與天然構(gòu)像區(qū)別較大，可能會影響反應原性。而國外進口試劑盒價格昂貴，所以開發(fā)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品意義重大。本研究利用E2蛋白制備的McAb 15A9具有阻斷活性，識別的表位是能區(qū)分CSFV和BVDV的線性表位TAVSPTTLR，且在CSFV不同毒株中高度保守。將重組CSFV E2蛋白作為包被抗原，HRP標記的15A9作為酶標試劑，建立了可以區(qū)分CSFV和BVDV的阻斷ELISA抗體檢測方法，該方法可進行大批量樣品檢測，且快速、簡便，可以用于豬瘟疫苗免疫后豬群抗體的檢測，并且可以實現(xiàn)疫苗BVDV污染的鑒別檢測。另外，用本方法檢測免疫后不同時間豬血清中抗體，最早檢出時間為免疫后14 d，免疫后21 d全部轉(zhuǎn)為陽性。本方法檢測豬瘟疫苗免疫后抗體轉(zhuǎn)陽時間同Colijn等[23]報道相似，最早檢出時間同中和試驗相當。有報道稱豬瘟疫苗C株免疫后14 d，中和試驗檢測為陽性[24]，因此可用于疫苗免疫后抗體的檢測。

綜上，本研究利用桿狀病毒表達的重組CSFV E2蛋白，制備了作為于診斷試劑的單克隆抗體，建立了能特異性鑒別CSFV和BVDV的阻斷ELISA抗體檢測方法，為豬瘟疫苗免疫后抗體的檢測及豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別檢測提供了重要的技術(shù)保障。