稻縱卷葉螟Calreticulin基因的鑒定與功能分析*

謝敏欣，宋月楠，何娜娜，夏濤，江嘉琳，余海中,?

(1.贛南師范大學 生命科學學院；2.國家臍橙工程技術研究中心，江西 贛州 341000)

稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)屬于鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，是一種主要的水稻害蟲.迄今為止，在印度，韓國，日本，中國，馬來西亞，斯里蘭卡和越南等亞洲國家均有報道[1].它的幼蟲主要取食生長期的水稻幼苗，而成蟲可以在夜間持續(xù)長時間的飛行[2-3].稻縱卷葉螟的防治主要包括化學防治，物理防治和生物防治，其中以化學殺蟲劑防治為主，但是化學殺蟲劑的不合理使用引發(fā)了一系列的問題，如環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和害蟲抗藥性[4-5].

CRT是一種Ca+結(jié)合蛋白，也是一種重要的分子伴侶，主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上糖蛋白的合成[6].CRT含有三個典型的結(jié)構(gòu)域：N端的信號肽，P結(jié)構(gòu)域的二硫鍵以及C端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜識別序列(-HDEL)，它們對CRT結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及活性有一定的影響[7].近年來，CRT在不同的生物類群中均有報道，如在哺乳動物中，CRT主要參與一些胞內(nèi)與胞外的過程，如調(diào)控凝集素的合成，Ca+的儲存，基因的表達及先天性免疫反應[8].Wang等人從菜粉蝶(Pierisrapae)的基因組數(shù)據(jù)庫中克隆了CRT基因并研究其功能，其結(jié)果顯示PrCRT在血細胞表達量較高[9].Cha等人從菜蛾盤絨繭蜂(Cotesiavestails)的毒腺cDNA文庫中鑒定出Cp-CRT基因，并且在大腸桿菌中高效表達出Cp-CRT蛋白，發(fā)現(xiàn)它對結(jié)節(jié)具有一定的抑制作用[10].迄今為止，稻縱卷葉螟CRT(CmCRT)基因的研究還未見報道.

在本研究中，基于稻縱卷葉螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，我們鑒定了2個稻縱卷葉螟CRT基因，通過相應軟件預測了其分子特征及功能.通過RT-qPCR 分析CmCRTs在稻縱卷葉螟的不同組織及不同發(fā)育時期的相對表達量以及.CmCRT1基因在大腸桿菌(E.coli)誘導下的表達模式.這些研究成果將為進一步研究CmCRT的功能奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 稻縱卷葉螟的飼養(yǎng)，細菌準備與樣品的準備

稻縱卷葉螟(C.medinalis)幼蟲采集自安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所，采用新鮮的水稻葉片進行人工飼養(yǎng)，分別收集稻縱卷葉螟1齡、2齡、3齡、4齡幼蟲、蛹以及成蟲；對4齡幼蟲進行組織解剖，獲取幼蟲的頭部，中腸，血淋巴，表皮和脂肪體等組織，加適量液氮充分研磨，按照100 mg/mL的比例加入Trizol充分混勻，然后保存于-80 ℃.

過夜培養(yǎng)的大腸桿菌7 500 g，離心15 min收集菌體，然后使用0.85% NaCl清洗3次，最后加入適量的0.85% NaCl重新懸浮，并進行高溫滅活處理.取4齡第1天的稻縱卷葉螟幼蟲，使用微量注射器，每頭幼蟲注射5 μL滅活后的大腸桿菌(1×107)，為防止液體流出，注射后的傷口使用凡士林處理，分別收集注射后4 h，8 h，12 h和24 h稻縱卷葉螟幼蟲，0 h作為對照，每個處理進行3個生物學重復，收集后的樣品加適量液氮充分研磨，按照100 mg/mL的比例加入Trizol充分混勻，然后保存于-80 ℃.

1.2 稻縱卷葉螟各組織總RNA提取及cDNA的合成

根據(jù)Trizol試劑使用說明書，分別從稻縱卷葉螟的表皮，頭，中腸，脂肪體及血淋巴中提取總RNA，并且測定其濃度與純度.將總RNA使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒處理，完成cDNA的合成.-20 ℃保存.

1.3 CmCRTs的鑒定與生物信息學分析

基于稻縱卷葉螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過BLASTX軟件搜索稻縱卷葉螟(C.medinalis)非贅余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(cut-off為1×10-5)，獲得候選的CRT基因序列.通過在線軟件(https://web.expasy.org/compute_pi/)分析CmCRTs的分子量及等電點；通過ORF finder在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析CmCRTs基因的開放閱讀框；通過SignalP 4.1 Sever 在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析CmCRTs的信號肽序列.基于NCBI保守域數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)獲得CmCRTs的保守域序列.通過SWISS-MODEL在線軟件(http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html))構(gòu)建CmCRTs蛋白質(zhì)模型與并對其進行分析.通過 DNAMAN 7.0 software軟件獲得CmCRTs的氨基酸同源序列.通過MEGA 5.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建CmCRTs系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 稻縱卷葉螟CmCRTs基因的時空表達分析

基于已經(jīng)獲得CmCRTs序列，通過RT-qPCR進一步分析CmCRTs在稻縱卷葉螟不同組織以及不同發(fā)育時期的相對表達水平.具體的引物見表1，RT-qPCR反應體系如下：SYBR Ⅱ12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，forward primer 1.0 μL，reverse primer 1.0 μL，cDNA模板1 μL.反應條件為：50 ℃預熱2 min；95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán).每個反應執(zhí)行三個生物學重復.反應均在Multicolor RT-PCR Detection System(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)實時定量PCR儀上完成.反應中內(nèi)參基因為CmActin基因.利用2-ΔΔCt相對定量法分析基因的相對表達量.利用SPSS軟件進行差異顯著性分析.

表1 本研究所用的引物

1.5 稻縱卷葉螟總蛋白的提取及Western blot分析

采用Western Blot確定被大腸桿菌(E.coil)處理后的稻縱卷葉螟(C.medinalis)4齡幼蟲的鈣網(wǎng)蛋白的豐度.取100 mg樣品粉末；加1 mL protein lysis buffer，配比體系為7 M 尿素，2 M硫脲，4% CHAPS，10 mg DDT；采用12% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)；將已分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉1 h，PBST配比體系：137 mM NaCl,，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KHPO4，pH7.5,0.1%(v/v)Tween-20；PBST清洗3次；加入CmCRT1抗體(稀釋倍數(shù)1∶1000)，室溫孵育2 h；PBST清洗3次；加入適量封閉緩沖液與二抗即辣根過氧化物酶標記羊抗兔(稀釋倍數(shù)：1∶5000)，孵育1 h；除去緩沖液，PBST清洗3次，加入顯影劑；通過Bio-Rad GS-800掃描儀觀察顯色結(jié)果.

2 結(jié)果分析

2.1 CmCRTs的cDNA序列與結(jié)構(gòu)分析

基于cDNA數(shù)據(jù)庫，獲得CmCRT1及CmCRT2的全長cDNA序列.2種CmCRTs的序列長度，相對分子質(zhì)量，等電點及其他基本信息如表2所示.通過Signal P 4.1軟件分析CmCRTs結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)顯示CmCRT1的信號肽由19個氨基酸構(gòu)成(MKSLVLAVVSLLAIYSVNC)，而CmCRT2的信號肽由16個氨基酸構(gòu)成(MFHFCVVILLLYTARA).基于推斷出的CmCRTs的氨基酸序列，確認了CRT家族的重復模體(motif A and motif B)及重復序列(IxDxExxKPE(/D)DW.CmCRTs的C端含有假定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜靶向4肽HDEL，如圖1及圖2所示.

圖1 CmCRT1的全長cDNA序列及對應的氨基酸序列 圖2 CmCRT2的全長cDNA序列及對應的氨基酸序列

表2 CmABC序列的特征

通過SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在線軟件預測CmCRTs的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示CmCRTs包含凝集素結(jié)構(gòu)域及ARM域，此外，CmCRTs的C端主要由β-折疊組成，如圖3所示.

圖3 稻縱卷葉螟CmCRTs的結(jié)構(gòu)特征

2.2 CRT的氨基酸序列比對

如圖4所示，氨基酸序列比對分析揭示稻縱卷葉螟CRT與其他昆蟲物種CRT序列保持較高的同源性，進一步暗示它們在功能上較為保守.

圖4 CmABC與其他13種昆蟲的氨基酸序列比對 圖5 稻縱卷葉螟CmCRTs的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 昆蟲CmCRTs的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

選擇鱗翅目(Lepidoptera)蠟螟(Galleriamellonella)，桑蠶(B.mori)，菜粉蝶(Pierisrapae)，小菜蛾(Plutellaxylostella)，玉帶鳳蝶(Papiliopolytes)，柑橘鳳蝶(Papilioxuthus)，松白條尺蠖(Operophterabrumata)，黑脈金斑蝶(Danausplexippus)，雙翅目黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)，岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)，斯氏按蚊(Anophelesstephensi)，膜翅目(Hymenoptera)無刺峰(Meliponaquadrifasciata)，蝶蛹金小蜂(Pteromaluspuparum)，麗蠅蛹集金小蜂(Nasoniavitripennis)與稻縱卷葉螟(C.medinalis)進行氨基酸同源性分析，并構(gòu)建鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹，從而更好地了解CmCRTs基因與其他昆蟲的進化關系.結(jié)果顯示CmCRT1的氨基酸序列與蠟螟(G.mellonella)的GmCRT序列親緣關系較近，而CmCRT2序列則分別與PpCRT序列及NvCRT序列都有99% 的同源性，如圖5所示.

2.4 CmCRT基因的時空表達分析

為了確定CmCRTs基因在稻縱卷葉螟(C.medinalis)幼蟲不同組織及其不同發(fā)育階段的表達模式，利用熒光定量PCR對幼蟲的中腸，表皮，血淋巴，脂肪體及頭，以及對處于1齡，2齡，3齡，4齡階段及蛹，成蟲期的相對表達量進行檢測.結(jié)果顯示，CmCRT1在稻縱卷葉螟幼蟲組織中的表達模式為：在血淋巴中的表達量為在表皮中的表達量的7.58倍，在脂肪體中的表達量為在表皮中的表達量的3.3倍，而在頭及表皮中的表達量類似；CmCRT1在稻縱卷葉螟不同發(fā)育階段的表達模式為：相對于蛹期及成蟲期，在蟲體早期(1齡，2齡，3齡，4齡)低表達；CmCRT2則在血淋巴中高表達，為在頭中的12.57倍，在脂肪體中的表達量為在頭的9.77倍；CmCRT2在稻縱卷葉螟的1齡至3齡第1天低表達，但在3齡第1天之后的表達量迅速增多，直至蛹期，如圖6所示.

圖6 CmCRTs基因的時空表達分析

2.5 CmCRT在經(jīng)免疫刺激后稻縱卷葉螟幼蟲中的表達模式

CRT基因在許多微生物中已成功被誘導表達.為了確定CmCRTs在經(jīng)免疫刺激后的稻縱卷葉螟(C.medinalis)幼蟲中的表達模式，利用RT-qPCR及Western blot檢測其在幼蟲整體中的表達量.結(jié)果顯示，經(jīng)大腸桿菌(E.coli)處理4 h時，CmCRT1基因的mRNA表達量顯著上調(diào)，而在4 h至8 h時間段內(nèi)則下降；在經(jīng)大腸桿菌(E.coli)處理24 h時，CmCRT1基因的mRNA表達量對比其在12 h時的表達量保持在一個較高的水平；而CmCRT1蛋白質(zhì)的表達量在幼蟲經(jīng)大腸桿菌(E.coli)免疫刺激后的不同時間中的表達量與其mRNA在相對應的時間段的表達模式類似，如圖7所示.

圖7 稻縱卷葉螟幼蟲在經(jīng)不同時間大腸桿菌免疫刺激后CmCRT1基因的表達量

3 討論

鈣網(wǎng)蛋白主要參與細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的調(diào)控并且影響鈣庫操控性鈣內(nèi)流及在胚胎發(fā)育過程中依賴鈣離子的轉(zhuǎn)錄途徑.之前的研究表明CRT在昆蟲免疫過程中起著重要作用[11].Zhang等人的研究表明微紅盤絨繭蜂(Cotesiarubecula)的CRT可以與宿主紅細胞內(nèi)的CRT競爭結(jié)合位點，從而影響包囊作用的發(fā)生.利用酵母細胞進行的比較吞噬試驗表明不同昆蟲血細胞的吞噬潛能及相對的CRT參與性有顯著差異[12].在本研究中，基于cDNA數(shù)據(jù)庫，我們確認了2種CRT基因，即CmCRT1及CmCRT2.基于保守域分析，我們預測CmCRT1及CmCRT2均包含3種結(jié)構(gòu)域：-N域上的二硫橋，-P域上的2種重復模體(模體A與模體B)，-C域上的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)識別域，均具有多種功能.-P域與-C域分別含有大量對受體親和力強的結(jié)合位點.此外，CmCRT1及CmCRT2的N端均含一段信號肽序列.我們推測這2種CRT均為分泌蛋白.RNA干擾及蛋白敲除實驗表明昆蟲CRT的-N域參與了包囊作用.哺乳動物CRT的-N域中的鈣離子結(jié)合位點對CRT結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著一定的作用.-P域中的脯氨酸富集區(qū)及重復序列可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的第57號蛋白及肽基脯氨酸順發(fā)異構(gòu)酶相互作用.酸性的-C域參與細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，并且還包含指定作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的-HDEL序列.通過SWISS-MODEL分析顯示CmCRTs包含2個域，即ARM域及凝集素結(jié)構(gòu)域.其余結(jié)構(gòu)形成了一個小的結(jié)構(gòu)化區(qū)域，即我們所謂的連接區(qū)，連接了ARM域與凝集素結(jié)構(gòu)域.據(jù)推測，該結(jié)構(gòu)可能為CRT可發(fā)揮伴侶蛋白功能的原因.CmCRTs的分子結(jié)構(gòu)特征分析顯示其可能在稻縱卷葉螟(C.medinalis)中發(fā)揮已在其他生物中報道的多種功能.

CRT是一種在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上含量豐富的結(jié)構(gòu)保守的可溶解的蛋白質(zhì).它廣泛存在于動植物體內(nèi)，甚至出現(xiàn)在動植物王國出現(xiàn)之前[13].因此，CRT家族成員在進化過程中仍保持較高的保守性.基于其推測的氨基酸序列所進行的同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示相對于其他目而言，CmCRT1與鱗翅目(Lepidoptera)有較高的同源性，尤其是蠟螟(Galleriamellonella)；而CmCRT2則與膜翅目(Hymenoptera)有較近的親緣關系，如蝶蛹金小蜂(Pteromaluspuparum)及麗蠅蛹集金小蜂(N.vitripennis)，結(jié)果顯示CmCRT1與CmCRT2的功能有所差異[14].

CRTs在不同物種的不同組織及不同發(fā)育階段中的表達量均有所差異.在長紅錐蝽(Rhodniusprolixus)中，相對于卵母細胞形成期及產(chǎn)卵期，卵子形成的后期中的CRT基因的表達量較低，該結(jié)果顯示CRT除在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，還在新分子及鈣信號的合成過程中發(fā)揮作用[15].Cheng等人利用far-western blotting 及質(zhì)譜法在蠶的中腸中確定了一種CRT，并且對RT-qPCR的數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示BmCRT基因的表達量在感染了BmNPV的蠶中及對照組中均下調(diào)[16].在本研究中，結(jié)果顯示CmCRT1及CmCRT2在血淋巴中高表達，其次便是脂肪體及中腸.昆蟲的中腸及脂肪體被視為主要的新陳代謝組織.因此，CmCRT1及CmCRT2在血淋巴及中腸中高表達顯示CmCRTs由脂肪體合成，分泌至血淋巴參與免疫反應.CmCRT1及CmCRT2在不同發(fā)育階段的相對表達量分析顯示其在蛹期及成蟲期高表達，而在幼蟲的早期(1齡，2齡，3齡，4齡)低表達.但是，鈣網(wǎng)蛋白在蛹期及成蟲期高表達的原因至今不明，因此還需進行更多的關于稻縱卷葉螟(C.medinalis)鈣網(wǎng)蛋白生理功能的深入研究.利用RT-qPCR及Western blot分析確定CmCRT1在經(jīng)免疫刺激后稻縱卷葉螟(C.medinalis)幼蟲中的表達模式，結(jié)果顯示CmCRT1基因的mRNA表達量在被大腸桿菌(E.coli)處理4 h后顯著上調(diào)，在被處理8 h時銳減，在24 h時恢復至原始水平，這種情況與經(jīng)大腸桿菌(E.coli)處理后BmCRT的表達模式一致.Takahashi等人曾檢驗家蠶(B.mori)中的BmCRT是否可以在脂肪體中參與體液免疫，結(jié)果顯示BmCRT在被大腸桿菌(E.coli)處理6 h時被顯著誘導表達[17].在之前的研究中，Asgari等人發(fā)現(xiàn)昆蟲的鈣網(wǎng)蛋白可以結(jié)合于血細胞的表面并且參與細胞的包囊作用.因此，我們推測CmCRTs可能也在免疫方面發(fā)揮重大作用[18].

總而言之，首先，我們鑒定了2種稻縱卷葉螟(C.medinalis)的鈣網(wǎng)蛋白基因序列，之后基于生物信息學分析，RT-aPCR及Western blot分析它們的結(jié)構(gòu)及表達模式，為進一步研究稻縱卷葉螟(C.medinalis)鈣網(wǎng)蛋白功能奠定基礎.