嗜熱鏈球菌S10復(fù)合植物乳桿菌P-8發(fā)酵豆乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的SPME-GC-MS分析

郭 帥 韓之皓 白 梅 孫天松 張和平 王記成

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018）

全球發(fā)酵產(chǎn)品市場中，發(fā)酵豆乳份額遠(yuǎn)低于酸奶市場，豆腥味是制約其發(fā)展的主要原因[1-2]。發(fā)酵劑的改變可引起風(fēng)味差異，對成品中風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量與含量起關(guān)鍵作用。固相微萃?。⊿olid phase microextraction，SPME）技術(shù)具有靈敏度高，檢出限低，分析范圍廣，萃取條件溫和等特點(diǎn)，可直接與氣相色譜-質(zhì)譜（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用。近年來，SPME 技術(shù)在食品風(fēng)味分析，如釀造醋[3]、紅酒[4]、果蔬[5]等應(yīng)用越來越廣。食品體系風(fēng)味特征形成是揮發(fā)性物質(zhì)相互影響共同作用的結(jié)果[6]。微量雜質(zhì)存在也會(huì)導(dǎo)致整體風(fēng)味改變，同一種物質(zhì)的風(fēng)味因濃度、結(jié)構(gòu)不同而有所差異。本研究菌種嗜熱鏈球菌S10（Streptococcus thermophilus S10）是在乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種資源庫的406 株嗜熱鏈球菌中篩選得到的一株具有良好發(fā)酵大豆乳特性和弱化后酸能力較好的嗜熱鏈球菌[7]。植物乳桿菌P-8（Lactobacillus plantarum P-8） 是本實(shí)驗(yàn)室于2005年分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭自然發(fā)酵酸牛乳樣品中的1 株具有優(yōu)良益生特性的植物乳桿菌[8]。本試驗(yàn)中采用SPME-GC-MS 技術(shù)和面積歸一法，結(jié)合主成分和聚類分析探究嗜熱鏈球菌S10 與植物乳桿菌P-8（S10+P-8）復(fù)合發(fā)酵豆乳樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及引起豆腥味的關(guān)鍵物質(zhì)含量變化，為發(fā)酵劑S10+P-8 商業(yè)化提供理論數(shù)據(jù)，為功能性發(fā)酵豆乳開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂大豆粉，蛋白質(zhì)含量≥39%，黑龍江農(nóng)墾龍王食品有限公司。

試驗(yàn)用嗜熱鏈球菌S10 和植物乳桿菌P-8 直投式發(fā)酵劑由乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種資源庫提供；商業(yè)豆乳發(fā)酵劑1和商業(yè)豆乳發(fā)酵劑2（商業(yè)1，商業(yè)2）分別購自科漢森（中國）有限公司、丹尼斯克（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5977B GC-MS 聯(lián)用儀、色譜柱為HP-5 毛細(xì)管柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國Agilent 公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣手柄、50/30 μm 二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭，美國Supelco 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

將全脂豆粉（6.6%）與蔗糖（8%）混合后加入到60 ℃蒸餾水 （85.4%） 攪拌均勻，于65 ℃、30 MPa 條件下均質(zhì)，95 ℃殺菌5 min，冷卻至（42 ±0.5）℃接種發(fā)酵劑[9]。樣品于42 ℃恒溫發(fā)酵至pH值低于4.50 后，轉(zhuǎn)至4 ℃過夜后熟結(jié)束。接種量依據(jù)商業(yè)發(fā)酵劑產(chǎn)品說明0.03 g‰添加，試驗(yàn)組接種量比例按照S10∶P-8 為1 000∶1 添加，其中S10 添加量為2×106CFU/mL。

1.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

GC 條件：HP-5 毛細(xì)管柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用程序升溫方式，起始溫度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 的速率上升至10 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 的速率上升至250 ℃，保持3 min；汽化室溫度為250 ℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。MS 條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 33～450；發(fā)射電流100 μA。萃取條件：萃取頭老化溫度250 ℃，老化時(shí)間15 min，平衡溫度50 ℃，平衡時(shí)間60 min；25 ℃解吸附3 min。

1.5 定性與定量分析

利用隨機(jī)攜帶Masshunter 工作站NIST 11 標(biāo)準(zhǔn)庫自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用面積歸一化法計(jì)算各組分峰面積百分比（相對含量）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 21.0 軟件作為數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行顯著性、主成分分析處理。作圖采用Origin lab 2017、SIMCA-P 14.1 和R 語言。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵豆乳樣品GC-MS 結(jié)果總體描述

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，對原豆乳及3 種發(fā)酵豆乳樣品發(fā)酵完成及后熟結(jié)束的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行富集，利用GC-MS 技術(shù)對發(fā)酵豆乳的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，經(jīng)NIST 11標(biāo)準(zhǔn)庫檢索各組分揮發(fā)性成分，利用面積歸一化法計(jì)算各組分相對峰面積百分比，由表1可知，原豆乳共檢出32 種揮發(fā)性物質(zhì)，與Zhang 等[10]研究結(jié)果相符。3 種發(fā)酵豆乳在發(fā)酵完成和后熟結(jié)束總計(jì)6 組樣品共檢出124 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醛類、酮類、酸類、酯類、醇類、烷烴類和含氮化合物等。接種發(fā)酵劑不同，風(fēng)味物質(zhì)組成和含量也不同?？偡迕娣e代表樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量，除去萃取頭帶有少量硅氧烷類雜質(zhì)峰，結(jié)合表1、圖1a總峰面積可知，經(jīng)發(fā)酵后，3 種樣品風(fēng)味物質(zhì)總量相比原豆乳有顯著提高（P<0.05）；發(fā)酵完成與后熟結(jié)束相比有顯著變化（P<0.05），后熟結(jié)束含量更高；S10+P-8 組與對照組相比含量更高，具有顯著差異（P<0.05）。樣品中總揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量如圖1b所示，3 種樣品發(fā)酵完成時(shí)風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量分別是50 種、32 種和48 種，差異顯著（P<0.05）。后熟結(jié)束時(shí)風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量分別是53 種、50 種和50種，無顯著差異。對照組發(fā)酵完成與后熟結(jié)束揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量有顯著變化（P<0.05）。原豆乳和發(fā)酵豆乳樣品不同種類揮發(fā)性物質(zhì)及相對百分含量如圖1c、圖1d所示，原豆乳與發(fā)酵豆乳樣品主要在酮類、酸類、醇類和烷烴化合物上存在顯著差異（P<0.05），S10+P-8 組與對照組無顯著差異；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類在醛類、酮類、醇類和烷烴類化合物有顯著差異（P<0.05）；與對照組相比，S10+P-8 組醛類化合物和醇類化合物含量少，差異顯著（P<0.05）；酮類化合物含量多，差異顯著（P<0.05）。

2.2 發(fā)酵豆乳樣品致豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)分析

表1 原豆乳及發(fā)酵豆乳樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)SPME-GC-MS 分析結(jié)果Table 1 Major volatile compounds extracted from soybean milk and fermented soybean milk samples by SPME-GC-MS

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

發(fā)酵豆乳風(fēng)味是多種揮發(fā)性微量風(fēng)味物質(zhì)共同作用而達(dá)到相對平衡狀態(tài)的復(fù)雜體系。豆乳中特有的豆腥風(fēng)味是制約豆乳制品被消費(fèi)者接受的主要問題，在西方國家更為明顯，研究者常用“豆腥味”、“生味”、“青草味”、“油脂氧化味”、“油漆味”和“金屬味”等術(shù)語描述豆腥味[11]。已有研究確定了影響豆乳及發(fā)酵豆乳風(fēng)味的12 種最主要揮發(fā)性物質(zhì)成分[10，12]，并認(rèn)為這些物質(zhì)能夠基本代表發(fā)酵豆乳整體風(fēng)味。其中己醛、（E）-2-己烯醛、1-辛烯-3-醇、1-己醇、戊醇、乙酸、苯甲醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛這8 種化合物分別呈割青草的味道、生味、磨茹、酸味、苦杏仁味和辛辣味而不被人喜歡，因此定義為豆腥味物質(zhì)；3-甲基正丁醛、（E）-2-辛烯醛、正壬醛和（E）-2-壬烯醛呈黑巧克力、青瓜、綠菜花和水果味，被人們喜歡，定義為非豆腥味物質(zhì)。此外，有研究認(rèn)為2-戊基呋喃呈豆腥味[13]，正壬醛含量較多時(shí)產(chǎn)生較濃油脂氧化味而引起不愉快味道[14]。乳酸菌發(fā)酵可有效降低或消除發(fā)酵豆乳豆腥味[9，15]，己醛是豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)的最主要成分[11]，1-辛烯-3-醇和（E）-2-己烯醛次之，1-己醇、（E，E）-2，4-癸二烯醛等再次之。己醛含量降低程度可作為衡量發(fā)酵菌種對豆腥味降低效果的重要指標(biāo)[10，12，16]。結(jié)合表1和圖2a可知，原豆乳及發(fā)酵豆乳樣品中上述揮發(fā)性物質(zhì)除戊醇均有檢出，原豆乳己醛含量為33.27%，Achouri 等[17]研究了豆乳氣味的組成成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豆乳中致豆腥味己醛有較高含量。樣品中呈豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)總含量如圖2a所示，經(jīng)發(fā)酵后，3 種發(fā)酵豆乳樣品中致豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)總量均顯著降低（P＜0.05）；S10+P-8 組與對照組相比下降量更大，差異顯著 （P＜0.05），后熟結(jié)束時(shí)S10+P-8 組總量為24.33%，對照組分別是46.79%和44.59%。各致豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)含量變化如圖2b所示，樣品中主要衡量豆腥味濃淡的揮發(fā)性物質(zhì)己醛含量均顯著降低（P＜0.05）；發(fā)酵完成與后熟結(jié)束相比，S10+P-8 組和商業(yè)2 組無顯著變化，商業(yè)1 組變化顯著（P＜0.05）；S10+P-8 組顯著低于對照組（P＜0.05），后熟結(jié)束己醛相對含量為5.62%，對照組分別是20.16%和15.44%；揮發(fā)性物質(zhì)（E，E）-2，4-癸二烯醛、2-戊基呋喃含量明顯下降（P＜0.05），其余物質(zhì)如1-己醇、苯甲醛含量增多，這與早期研究結(jié)果有差異，可能是發(fā)酵菌種或豆粉選擇導(dǎo)致[18-19]。結(jié)合上述結(jié)果可推測，部分豆腥味成分殘留可能是豆乳發(fā)酵體系中仍留存豆腥味的主要原因。此外，風(fēng)味物質(zhì)與大豆蛋白能發(fā)生疏水結(jié)合，其結(jié)合常數(shù)隨碳鏈數(shù)的增加而升高，可能是導(dǎo)致豆腥味在發(fā)酵過程中難以除去的原因[20]，如己醛等物質(zhì)。在發(fā)酵豆乳中有時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有淡淡“臭腳丫味”的風(fēng)味物質(zhì)，含量低于儀器檢測限，無法直接獲知其相關(guān)信息，結(jié)合已有文獻(xiàn)，此物質(zhì)為異戊酸，是大豆發(fā)酵制品中常見的一種特征風(fēng)味成分[21]。

圖1 原豆乳及發(fā)酵豆乳樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總體分析Fig.1 Total analysis of volatile flavor substances in soybean milk and fermented soybean milk samples

圖2 原豆乳及發(fā)酵豆乳樣品中呈豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)總百分含量（a）和各物質(zhì)所占百分含量（b）分析Fig.2 Total analysis Comparison of beany flavor of volatile flavor in soybean milk and fermented soybean milk

2.3 發(fā)酵豆乳樣品不同種類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

主成分分析是通過少數(shù)幾個(gè)主分量解釋多變量間的內(nèi)部關(guān)系，使樣品中物質(zhì)種類及含量有較客觀反映，發(fā)酵豆乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)據(jù)用主成分分析來處理是一種既可行的又科學(xué)的方法[22]。得分圖中樣品點(diǎn)越接近，其香氣組成及含量相似度越高。樣品點(diǎn)與不同種類風(fēng)味物質(zhì)在得分圖與載荷圖上越接近，說明有較高相關(guān)性。將原豆乳及發(fā)酵豆乳所含8 類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率如表2所示，經(jīng)主成分分析發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)酵豆乳樣品揮發(fā)性物質(zhì)種類主要集中在前3 個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到88.590%。由圖3a因子得分圖可知，在第1主成分上，7 種樣品從左至右共3 個(gè)集合出現(xiàn)較為明顯的區(qū)分，說明接種發(fā)酵劑不同對風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生有較大影響，S10+P-8 組與對照組、原豆乳有較明顯區(qū)分和聚類趨勢，2 種對照組空間排布較接近，原豆乳與3 種發(fā)酵豆乳區(qū)分明顯。因此，可定性的認(rèn)為試驗(yàn)組與對照組、原豆乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)存在較大差異；第2 主成分無明顯規(guī)律。結(jié)合圖3a和圖3b可知，商業(yè)1 組和商業(yè)2 組發(fā)酵完成樣品與烷烴類化合物呈正相關(guān)；商業(yè)2 組后熟完成與醇類、脂類和酸類化合物呈正相關(guān)；商業(yè)1 組發(fā)酵完成、S10+P-8 組發(fā)酵完成和后熟結(jié)束與含氮和酮類化合物具有正相關(guān)；原豆乳與醛類和其它種類化合物具有正相關(guān)。

表2 原豆乳及發(fā)酵豆乳樣品與不同種類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 2 Soybean milk and fermented soybean milk samples with different volatile flavors eigenvalues of principal components and their variance contributions

圖3 不同發(fā)酵豆乳樣品（a）和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類（b）主成分載荷圖Fig.3 Principal component analysis loading plots of fermented soybean milk samples （a） and key volatile compounds （b）

2.4 發(fā)酵豆乳樣品主要揮發(fā)性物質(zhì)主成分及聚類分析

在2.2 節(jié)中提到，發(fā)酵豆乳風(fēng)味主要由幾種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同呈現(xiàn)，除前文提到的風(fēng)味物質(zhì)以外，雙乙酰、乙醛、乙酸、己酸及戊醇等物質(zhì)也可對發(fā)酵豆乳風(fēng)味進(jìn)行修飾[23-24]。選樣品中檢測到含量較高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共22 種進(jìn)行分析，其相對含量接近80%或更高，主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率如表3所示，經(jīng)主成分分析發(fā)現(xiàn)，主要揮發(fā)性物質(zhì)主要集中在前4 個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到94.468%。結(jié)合圖4a和圖3a可知，兩種主成分分析聚類相似，即選取主要揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可代表整體發(fā)酵豆乳風(fēng)味。由圖4a和圖4b可知，S10+P-8 組發(fā)酵完成和后熟結(jié)束與乙醛、己酸、乙偶姻、雙乙酰、丙酮酸等物質(zhì)呈正相關(guān)；兩種對照樣品與乙酸、苯甲醛、1-己醇、（Z）-2-庚烯醛等揮發(fā)性物質(zhì)呈正相關(guān)；原豆乳樣品與1-辛烯-3-醇、（E，E）-2，4-癸二烯醛、3-甲基正丁醛和己醛等呈正相關(guān)。結(jié)合表1和圖4b可知，S10+P-8組樣品風(fēng)味與含有較多含量的乙偶姻、雙乙酰、乙酸、己酸和乙醛等揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)。其中，雙乙酰、乙偶姻是發(fā)酵奶制品中重要的特征風(fēng)味物質(zhì)之一，可賦予發(fā)酵豆乳特有的呈“乳脂氣息”、“干酪香氣”和“豆香味”[23，25]；Blagden 等[19]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵豆乳后可產(chǎn)生乳酸、檸檬酸和乙酸等有機(jī)酸，并將檸檬酸代謝過程中生成的α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)變成具有發(fā)酵豆乳特征香氣的雙乙酰；乙酸、戊酸、己酸賦予發(fā)酵豆乳爽口酸味[26]；而乙醛與其它揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相互協(xié)同作用，可改善發(fā)酵豆乳風(fēng)味[27]。3 種發(fā)酵豆乳后熟結(jié)束后，雙乙酰含量分別為8.77%、2.99%和1.06%，乙醛含量分別是2.89%、1.24%和1.50%。乙醛/雙乙酰的含量比例對發(fā)酵豆乳風(fēng)味影響較大，當(dāng)乙醛/雙乙酰比例在0.22～0.33 范圍內(nèi)時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)誘人的芳香味，否則會(huì)有酸腐味或其它令人不愉快的味道[27]。本研究檢出3種發(fā)酵豆乳乙醛與雙乙酰含量比例分別為0.30，0.41 和1.41，試驗(yàn)組乙醛/雙乙酰比值對其持有豆香味和清香味有積極作用。雙乙酰和乙醛是發(fā)酵制品中特有的風(fēng)味物質(zhì)，它們對許多有害微生物有較強(qiáng)抑制作用，其含量差異可能與嗜熱鏈球菌菌株間差異性有關(guān)[28]。

表3 原豆乳及發(fā)酵豆乳樣品與主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 3 Soybean milk and fermented soybean milk samples with major flavor compounds eigenvalues of principal components and their variance contributions

圖4 不同發(fā)酵豆乳樣品（a）和主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（b）主成分載荷圖Fig.4 Principal component analysis loading plots of fermented soybean milk samples （a） and key volatile compounds （b）

不同樣品主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類分析如圖5所示，S10+P-8 組發(fā)酵完成和后熟結(jié)束樣品，商業(yè)1 組后熟結(jié)束和后熟結(jié)束樣品，商業(yè)2 組后熟結(jié)束和后熟結(jié)束樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量相似，分別聚為一枝，原豆乳與其它樣品差異顯著，這一結(jié)果與主成分分析結(jié)果相似。在所有樣品中，乙酰丙酮、（E，E）-2，4-癸二烯醛、1-己醇、雙乙酰、己醛、己酸和乙偶姻含量差異較大，己酸和乙偶姻含量差異最大；原豆乳中（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、2-戊基呋喃、己醛和正壬醛含量遠(yuǎn)高于發(fā)酵豆乳樣品，差異顯著（P＜0.05），這與施小迪[29]研究結(jié)果相符。由此可知，S10+P-8 組樣品具有更低含量致豆腥味揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，與對照組差異顯著（P＜0.05）。

圖5 原豆乳及發(fā)酵豆乳樣品聚類分析Fig.5 Soybean milk and fermented soybean milk samples cluster analysis

3 結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用SPME-GC-MS 技術(shù)，結(jié)合主成分分析和聚類分析研究S10+P-8 發(fā)酵豆乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。與兩種商業(yè)豆乳發(fā)酵劑相比，后熟結(jié)束時(shí)S10+P-8 發(fā)酵豆乳樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總峰面積更大，數(shù)量更多（52 種），致豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)相對總含量更低（24.33%），主要致豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)己醛含量為5.62%，呈豆香味和清香味揮發(fā)性物質(zhì)，如乙偶姻、雙乙酰、乙酸、己酸和乙醛等含量較高，其中乙醛/乙偶姻的比例為0.30%，有誘人豆乳芳香味。S10+P-8 組與對照組、原豆乳在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和主要揮發(fā)性物質(zhì)上有明顯區(qū)分，各組分相對含量及致豆腥味風(fēng)味物質(zhì)含量均優(yōu)于商業(yè)豆乳發(fā)酵劑1 和商業(yè)豆乳發(fā)酵劑2。本研究為S10+P-8 在商業(yè)化生產(chǎn)中提供了理論數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。