基于雜環(huán)類(lèi)雙功能螯合劑DOTA的重金屬鉛人工抗原的制備與鑒定

翟 璐 郭建軍 金仁耀* 桑麗雅 王振國(guó) 陳笑笑 王偉萍 廖 杰

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 浙江工商大學(xué) 杭州310012 4 杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司 杭州310051 5 浙江華才檢測(cè)技術(shù)有限公司 浙江諸暨311800）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，大量的重金屬產(chǎn)物流入環(huán)境中，不斷累積，對(duì)環(huán)境造成越來(lái)越嚴(yán)重的影響。重金屬具有易富集，不易降解等特點(diǎn)，可在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，同時(shí)還可通過(guò)大氣、水和食物鏈等途徑進(jìn)入人體并產(chǎn)生富集現(xiàn)象，最終導(dǎo)致對(duì)人類(lèi)健康的危害風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大[1-2]。當(dāng)人體中累積的重金屬量超過(guò)人體能夠耐受的極限后，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的生殖和遺傳毒性反應(yīng)，長(zhǎng)期作用下會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)烈的致癌、致畸及致突變反應(yīng)[3-5]。

為減少重金屬對(duì)環(huán)境和人體的危害性，除了有效減少重金屬的排放外，還需加強(qiáng)對(duì)重金屬的檢測(cè)，提高檢測(cè)技術(shù)水平和檢測(cè)能力，以保障重金屬安全。目前，檢測(cè)、分析重金屬最廣泛的手段有原子吸收光譜分析（AAS）[6-9]、電感耦合等離子發(fā)射光譜（ICP-AES）[10-13]、陽(yáng)極溶出伏安法（ASV）[14-15]、色譜法[16-17]和其它多種聯(lián)用檢測(cè)方法，然而這些分析技術(shù)所使用的儀器價(jià)格昂貴，樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，檢測(cè)分析時(shí)間長(zhǎng)，需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作，難以實(shí)現(xiàn)在環(huán)境及市場(chǎng)等現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，在實(shí)際應(yīng)用中存在局限性。免疫分析技術(shù)是以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)建立的分析方法，該技術(shù)簡(jiǎn)便、易操作，人員技術(shù)要求不高，所用儀器設(shè)備價(jià)格低廉，分析靈敏度好，能在基層現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)大容量樣本的快速、高效檢測(cè)，很好的彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分析技術(shù)的不足，而且國(guó)外早在20世紀(jì)80年代就開(kāi)展了采用免疫學(xué)方法針對(duì)重金屬離子的檢測(cè)研究，隨后國(guó)內(nèi)也開(kāi)展了相關(guān)研究工作，截止目前已研制出抗汞、銅、鎘和鉛等重金屬離子的特異性抗體，建立并優(yōu)化了相關(guān)的免疫檢測(cè)方法[18-25]。

免疫分析方法的建立關(guān)鍵在于優(yōu)質(zhì)抗體的研制，而要制備特異性好，靈敏度佳的優(yōu)質(zhì)抗體，就需要制備理想的抗原，優(yōu)質(zhì)的抗原是獲得優(yōu)質(zhì)抗體的前提和基礎(chǔ)。通常重金屬離子的結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，導(dǎo)致其不能直接作為抗原，而且不能采用傳統(tǒng)與蛋白偶聯(lián)的方法制備人工抗原，需要在重金屬離子和載體蛋白之間增加一個(gè)中間載體，既能很好地固定重金屬離子，又能與載體蛋白有效結(jié)合，因此需用特殊的雙功能螯合劑，將重金屬離子固定后連接到BSA 或者OVA 等常用載體蛋白上制備重金屬人工抗原。

現(xiàn)有研究使用的雙功能螯合劑主要有EDTA、DTPA 和ITCBE 等，這些螯合物在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為直鏈開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)衍生物[26-29]，雙功能螯合劑一端先與重金屬離子螯合成穩(wěn)定的復(fù)合物后，另一端與載體蛋白通過(guò)戊二醛法制備并純化獲得免疫抗原和反應(yīng)抗原。免疫抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫后制備多克隆抗體，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)和分析方法建立，以驗(yàn)證抗原和抗體制備效果。本研究選取閉環(huán)結(jié)構(gòu)的2-S-（4-氨基苯）-1，4，7，10四氮雜環(huán)壬烷-1，4，7，10-四乙酸（DOTA）為雙功能螯合劑，通過(guò)與鉛離子反應(yīng)制備螯合物，然后與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)動(dòng)物免疫等手段制備多克隆抗體血清，通過(guò)抗體純化并測(cè)定抗體特性，評(píng)價(jià)DOTA 作為雙功能螯合劑在重金屬人工抗原制備中的效果，為今后開(kāi)展重金屬鉛免疫分析技術(shù)及檢測(cè)產(chǎn)品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銅離子、鋅離子、鎘離子、鉛離子和鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液、硝酸鉛、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、吐溫-20，上海晶純?cè)噭┕?；牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、HRP 標(biāo)記羊抗兔酶標(biāo)二抗，美國(guó)Sigma 公司；超濾離心管（Amicon Ultra-15，30 ku），美國(guó)密理博公司；2-S-（4-氨基苯）-1，4，7，10 四氮雜環(huán)壬烷-1，4，7，10-四乙酸 （DOTA），美國(guó)AREVA MED 公司；96 孔高吸附酶標(biāo)板，廣州潔特公司；BCA 試劑盒，江蘇碧云天公司；其它常規(guī)化學(xué)試劑為市售分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光度計(jì) （Nicolet Evolut 60s），美國(guó)Thermo 公司；萬(wàn)分之一分析天平（BSA124S-CW型），德國(guó)賽多利斯公司；自動(dòng)洗板機(jī)（Aquamax 2000），美國(guó)MD 公司；離心機(jī)（Fresco 21），美國(guó)Thermo 公司；酶標(biāo)儀（IMARK-680 型）、電泳儀（Mini-Protean 4 型），美國(guó)Bio-rad 公司；純水儀（Q-POD，Element），美國(guó)密理博公司；移液器，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，包括動(dòng)物飼養(yǎng)、免疫原的免疫，以及抗血清的采集等，后續(xù)抗血清純化及免疫學(xué)檢測(cè)分析均在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 人工抗原的合成 免疫原Pb-DOTA-BSA的合成采用戊二醛法，合成路線原理見(jiàn)圖1，合成路線參考郭建軍等[30]的方法，具體方案如下：

A 液（DOTA 螯合劑溶液）：準(zhǔn)確稱取8.5 mg DOTA 倒入5 mL 的離心管中，再加入2 mL 0.01 mol/L，pH 7.4 的N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）溶液，漩渦振蕩溶解；

B 液（7.5×10-2mol/L 硝酸鉛溶液）：準(zhǔn)確稱取124.2 mg 硝酸鉛放入15 mL 離心管中，加入5 mL超純水，漩渦振蕩溶解；

C 液：吸取上述配制好的B 液180 μL 逐滴加入到A 液中，在磁力攪拌下室溫避光緩慢攪拌，反應(yīng)3 h；

D 液：吸取20 mmol/L 的戊二醛670 μL，邊攪拌邊緩慢逐滴加入C 液中，之后繼續(xù)室溫避光緩慢攪拌，反應(yīng)12～14 h；

稱取20 mg BSA 于稱量瓶中，在磁力攪拌下加入3 mL 0.01 mol/L，pH 7.4 的HEPES，室溫下磁力攪拌充分溶解后，將上述制備的D 液逐滴緩慢加入，在室溫條件下避光攪拌，反應(yīng)24 h。反應(yīng)完全后，用預(yù)處理過(guò)的8 ku 的透析袋透析3～5次，每次間隔2 h，再將透析后的溶液用預(yù)處理的30 ku 超濾管離心，8 000 r/min 離心10 min，沉淀用HEPES 溶液 （0.01 mol/L，pH 7.4）4 mL 復(fù)溶洗滌后再離心，重復(fù)3～5 次，最后1 次用5 mL 0.01 mol/L，pH 7.4 的HEPES 復(fù)溶后分裝于1.5 mL 滅菌過(guò)的離心管中，并保存于-20 ℃冰箱中備用。將BSA 替換為OVA 后，按照上述合成方法和步驟即可制備獲得包被抗原Pb-DOTA-OVA。

圖1 重金屬鉛離子人工抗原合成路線Fig.1 Synthetic route of artificial antigen of heavy metal lead ion

1.4.2 人工抗原的鑒定 半抗原螯合物和人工抗原合成效果的鑒定采用SDS-PAGE 電泳法結(jié)合紫外掃描法。SDS-PAGE 試驗(yàn)參數(shù)：濃縮膠和分離膠體積分?jǐn)?shù)分別為5%和10%，樣品上樣量為每孔10 μL，濃縮膠和分離膠電壓分別為60 V 和90 V，G250 染色1 h，搖床振蕩脫色4 次，每次1 h，結(jié)果用凝膠成像儀拍照分析。紫外掃描試驗(yàn)步驟：配制適當(dāng)濃度的Pb-DOTA，BSA，OVA，Pb-DOTABSA 和Pb-DOTA-OVA 等溶液，紫外掃描儀測(cè)定200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，建立濃度和吸光度之間的相關(guān)性曲線，通過(guò)分析最大吸收波長(zhǎng)變化情況，判斷半抗原螯合物和人工抗原的合成效果。

1.4.3 人工抗原結(jié)合比的測(cè)定 通過(guò)測(cè)定人工抗原中鉛離子的物質(zhì)的量濃度和載體蛋白的物質(zhì)的量濃度，比較計(jì)算后得出每分子載體蛋白中含有鉛離子的數(shù)量，來(lái)計(jì)算人工抗原的結(jié)合比數(shù)據(jù)。其中，載體蛋白濃度采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定后進(jìn)行物質(zhì)的量濃度轉(zhuǎn)化，鉛離子濃度采用ICP-MS 方法測(cè)定后進(jìn)行物質(zhì)的量濃度轉(zhuǎn)化。

1.4.4 動(dòng)物免疫 免疫方案按照郭建軍等[30]的方法。免疫動(dòng)物為新西蘭大白兔，體重2.5 kg 左右，數(shù)量3 只，免疫抗原為Pb-DOTA-BSA，免疫計(jì)量以載體蛋白的量為單位。具體免疫方案見(jiàn)表1。

從第2 次加強(qiáng)免疫后，定期采血檢測(cè)，采用ELISA 法測(cè)定抗血清效價(jià)，從兔耳靜脈采血1～2 mL，采集的血清在37 ℃培養(yǎng)30 min，用針頭劃撥血塊后5 000 r/min 離心15 min，吸取離心上清10 μL 加入到2 mL 的封閉液中混勻，采用封閉液進(jìn)行系列倍比稀釋?zhuān)♂?0 個(gè)梯度，稀釋后的血清緩沖液采用間接ELISA 法測(cè)定。同時(shí)在動(dòng)物免疫之前采集兔血清分離后作為陰性對(duì)照血清，測(cè)定梯度稀釋的陽(yáng)性血清與陰性血清OD450的比值大于或等于2.1 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的稀釋度定為抗血清效價(jià)。當(dāng)2 次加強(qiáng)免疫之間測(cè)定的抗血清效價(jià)結(jié)果變化不明顯時(shí)，說(shuō)明免疫效果基本穩(wěn)定，可以終止繼續(xù)加強(qiáng)免疫。i-ELISA 檢測(cè)試驗(yàn)步驟如下：

表1 Pb-DOTA-BSA 免疫方案Table 1 The immune protocol of Pb-DOTA-BSA

1）抗原包被 根據(jù)包被抗原濃度，用0.05 mol/L，pH 9.6 的CBS 均勻稀釋至10 μg/mL，用8道移液器準(zhǔn)確吸取100 μL 加入96 孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)板用封板膜封好后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h 后，用PBST 洗液洗板4 次，在吸水紙上拍干；

2）牛奶封閉 洗好的酶標(biāo)板每孔加入2%脫脂牛奶溶液300 μL，封閉處理，置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min 后，用PBST 洗液洗板4次，在吸水紙上拍干；

3）加抗血清 每孔加入100 μL 陰性血清對(duì)照和11 個(gè)梯度的抗血清樣品，每梯度樣品重復(fù)加4 個(gè)孔，封板膜封好后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h 后，用PBST 洗液洗板4 次，在吸水紙上拍干；

4）加酶標(biāo)二抗 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)二抗用2%脫脂牛奶溶液稀釋104倍，酶標(biāo)板每孔加100 μL 后用封板膜封好后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h，用PBST 洗液洗板4次，在吸水紙上拍干；

5）加底物顯色 每孔加入100 μL TMB 顯色液，封板膜封好后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)20 min；

6）加硫酸終止反應(yīng)檢測(cè) 每孔加入2 mol/L硫酸50 μL 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD450值，分析計(jì)算。

1.4.5 多克隆抗體的制備與純化 最后1 次免疫后第3 天，將新西蘭大白兔固定在采血架上，用采血針從兔子頸動(dòng)脈部位采集兔血清，采集的血清在4 ℃冰箱中放置2～4 h，將血塊劃碎后8 000 r/min 離心20 min，取上清采用辛酸-硫酸銨法[31]純化，具體步驟如下：

1）用60 mmol/L，pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液稀釋抗血清，抗血清與緩沖液稀釋體積比為1∶4，混合均勻后用0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至4.5 后轉(zhuǎn)入燒杯，置于磁力攪拌器上備用；

2）加入正辛酸去除脂類(lèi)等雜質(zhì)，加入量為每mL 血清加75 μL 正辛酸，在磁力攪拌下逐滴緩慢滴加，后繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min，轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱靜置2 h，反應(yīng)液10 000 r/min 離心30 min 后，吸取上清，用定性濾紙過(guò)濾，去除雜質(zhì)；

3）上清液與0.01 mol/L，pH 7.4 的PBS 按照體積比為1∶10 稀釋配制，調(diào)節(jié)pH 值至7.4 后在4℃冰箱中預(yù)冷30 min；

4）按照每mL 混合液稱取0.277 g 硫酸銨的比例準(zhǔn)確稱取硫酸銨，將預(yù)冷的緩沖液置于冰中，放置在磁力攪拌器上，邊攪拌邊少量多次加入硫酸銨，硫酸銨加完后繼續(xù)攪拌30 min 后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中靜置3 h，用12 000 r/min 低溫離心30 min 后吸去上清；

5）離心后沉淀用4 mL 0.01 mol/L，pH 7.4 的PBS 溶解后轉(zhuǎn)入8 000 ku 透析袋中放入4 ℃冰箱中透析4～6 次，每次透析2～3 h，所用透析液為pH 7.4，0.01 mol/L 的PBS 緩沖液，透析完成后透析袋中的抗體進(jìn)行冷凍干燥，制備成多抗凍干粉。

1.4.6 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定 為鑒定制備的多克隆抗體的特性，需要進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，測(cè)定方法和步驟參考1.4.4 節(jié)進(jìn)行，將其中的抗血清替換為純化的多克隆抗體即可。

1.4.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用包被抗原和多抗以正交試驗(yàn)法確定最佳工作濃度，在此工作濃度下進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)，具體試驗(yàn)步驟如下：

1）抗原包被 以Pb-DOTA-OVA 為包被抗原，以pH 9.6，0.05 mol/L CBS 為包被緩沖液，根據(jù)工作濃度配制包被抗原后，酶標(biāo)板中每孔加入100 μL 后，置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h后，用PBST 洗液洗板4 次，在吸水紙上拍干；

2）牛奶封閉 洗好的酶標(biāo)板每孔加入2%脫脂牛奶溶液300 μL 封閉處理，置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min 后，用PBST 洗液洗板4次，在吸水紙上拍干；

3）樣品預(yù)處理 分別配制5 mmol/L 的DOTA 和不同濃度鉛離子標(biāo)樣，在新的96 孔板中各加入100 μL 上述溶液，微量振蕩混勻后用封板膜封板，置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h；

4）加樣檢測(cè) 在封閉好的包被有抗原的酶標(biāo)板中每孔加入預(yù)反應(yīng)的樣品50 μL 和2 倍工作濃度的多抗溶液50 μL，微量振蕩混勻后用封板膜封板，置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h，后用PBST 洗液洗板4 次，在吸水紙上拍干；

5）加酶標(biāo)二抗 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)二抗用2%脫脂牛奶溶液稀釋104倍，酶標(biāo)板每孔加100 μL 后用封板膜封好，置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h，用PBST 洗液洗板4次，在吸水紙上拍干；

6）加底物顯色 每孔加入100 μL TMB 顯色液，封板膜封好后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)20 min；

7）加硫酸終止反應(yīng)檢測(cè) 每孔加入2 mol/L硫酸50 μL 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD450nm值，分析計(jì)算。

1.4.8 抗體特異性測(cè)定 用ic-ELISA 法分別對(duì)鋅、鐵、鎘和銅等離子抑制中濃度IC50值檢測(cè)，比較后計(jì)算得到交叉反應(yīng)率。具體測(cè)定步驟參照1.4.7 節(jié)的方法，區(qū)別在于分別用待檢測(cè)金屬離子代替鉛離子，根據(jù)ic-ELISA 法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IC50值，然后再與鉛離子的IC50值比較計(jì)算交叉反應(yīng)率。具體計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定

人工抗原在200～400 nm 波長(zhǎng)下做紫外掃描后建立掃描曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，包被抗原Pb-DOTA-OVA 和免疫抗原Pb-DOTA-BSA 的最大吸收波長(zhǎng)均在260 nm 附近，而OVA 和BSA的最大吸收波長(zhǎng)在278 nm 附近，結(jié)果表明，偶聯(lián)物與載體蛋白的最大吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)值發(fā)生明顯變化，初步說(shuō)明載體蛋白上已有復(fù)合物偶聯(lián)。

人工抗原和載體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，免疫抗原Pb-DOTA-BSA 與BSA 蛋白相比，免疫抗原的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯位移；同時(shí)包被抗原Pb-DOTAOVA 與OVA 蛋白相比，包被抗原的電泳條帶也出現(xiàn)明顯的滯后現(xiàn)象，說(shuō)明人工抗原載體蛋白上連接了一定數(shù)量的重金屬螯合物，分子質(zhì)量變大，導(dǎo)致了電泳條帶滯后和拖尾現(xiàn)象，再次證明偶聯(lián)成功。

圖2 鉛離子人工抗原紫外掃描圖Fig.2 Ultraviolet scanning of artificial antigen of lead ion

圖3 鉛離子人工抗原的SDS-PAGE 電泳圖Fig.3 The SDS-PAGE electrophoretogram of Pb ion artificial antigen

2.2 人工抗原結(jié)合比的測(cè)定

對(duì)制備的人工抗原分別進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度和金屬離子濃度的測(cè)定，通過(guò)比較計(jì)算結(jié)合比。BCA 蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，ICP-MS 法測(cè)定鉛離子濃度，蛋白質(zhì)濃度和鉛離子濃度測(cè)定結(jié)果分別轉(zhuǎn)化為物質(zhì)的量濃度后，比較計(jì)算結(jié)合比分別為13∶1 和9∶1，說(shuō)明1 個(gè)載體蛋白上分別連接了13 個(gè)和9 個(gè)鉛離子，進(jìn)一步驗(yàn)證已成功合成人工抗原。

2.3 抗體效價(jià)的測(cè)定

經(jīng)i-ELISA 方法測(cè)定，3 只兔子免疫后制備的多抗效價(jià)分別為30 000∶1，42 000∶1 和45 000∶1，效價(jià)較高，說(shuō)明制備的人工抗原能較好的引發(fā)兔子的免疫反應(yīng)，制備的多抗效果佳，采用效價(jià)為45 000∶1 的多抗做后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

抗原抗體工作質(zhì)量濃度為2.4 μg/mL 和3.2 μg/mL，按照ic-ELISA 試驗(yàn)步驟繪制競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立線性回歸方程，具體曲線見(jiàn)圖4。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立相應(yīng)的回歸方程y=12.014ln（x）-13.249（R2=0.9951），其中IC50和IC20值分別為193.4 ng/mL 和15.9 ng/mL。

圖4 ic-ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of indirect competitive ELISA

2.5 CR 值測(cè)定

為驗(yàn)證所制備多克隆抗體的特異性，對(duì)其它類(lèi)似重金屬離子采用ic-ELISA 測(cè)定IC50值（檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2），從表2結(jié)果可知，鎘離子的IC50值較低，除根據(jù)其結(jié)果計(jì)算的CR 值達(dá)到20.4%以外，多克隆抗體與其它金屬離子的CR 值均小于6.4%，制備的多克隆抗體特異性較理想，有較好的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

以鉛離子和雙功能螯合劑2-S-（4-氨基苯）-1，4，7，10 四氮雜環(huán)壬烷-1，4，7，10-四乙酸（DOTA）為研究對(duì)象，制備了鉛離子與DOTA 的螯合復(fù)合物，在此基礎(chǔ)上采用戊二醛法制備、純化和鑒定了包被抗原Pb-DOTA-OVA 和免疫抗原Pb-DOTA-BSA，通過(guò)動(dòng)物免疫、抗血清制備、檢測(cè)、純化等一系列步驟獲得抗鉛離子的兔多抗。通過(guò)篩選工作濃度，優(yōu)化建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 分析方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立的回歸方程為y=12.014ln （x）-13.249 （R2=0.9951），其中IC50和IC20分別為193.4 ng/mL 和15.9 ng/mL，抗體特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，除與鎘離子的交叉反應(yīng)率值較高外，多抗與其它金屬離子交叉反應(yīng)率值均小于6.4%，說(shuō)明采用閉環(huán)結(jié)構(gòu)雙功能螯合劑DOTA 所制備的抗重金屬鉛多抗特異性好，靈敏度佳，以DOTA 為代表的閉環(huán)結(jié)構(gòu)雙功能螯合劑能用于金屬離子人工抗原的制備，為下一步研制其它重金屬離子優(yōu)質(zhì)高效的抗體，開(kāi)展相關(guān)免疫分析方法研究提供技術(shù)依據(jù)。

表2 交叉反應(yīng)率結(jié)果Table 2 The results of cross reaction rate