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      不同葉綠素測(cè)定方法的比較研究

      2020-11-12 09:24:38趙京東宋彥濤徐鑫磊烏云娜李琳琳
      關(guān)鍵詞:紫丁香紫藤銀杏

      趙京東,宋彥濤,何 暢,徐鑫磊,烏云娜,李琳琳

      (大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院,遼寧 大連 116605)

      高等植物體中葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b,均是參與光合作用的重要色素[1],其含量的多少是衡量植物光合作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[2]。目前,研究者們測(cè)量植物體內(nèi)葉綠素含量主要有兩種方法。其一是實(shí)驗(yàn)室化學(xué)分析,即使用丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑浸泡植物葉片后,根據(jù)葉綠素在溶劑中對(duì)特定波長(zhǎng)的光有最大吸收,采用分光光度計(jì)測(cè)定在該波長(zhǎng)下葉綠素溶液的吸光度,再根據(jù)相關(guān)公式推導(dǎo)即可計(jì)算葉綠素含量[3],但由于該方法所需儀器較多,耗時(shí)較長(zhǎng),不適于樣品量較多的野外實(shí)驗(yàn)。其二是使用便攜式SPAD 葉綠素儀,其特點(diǎn)是測(cè)量過(guò)程中不需試劑,在保證植物與葉綠素儀接觸的情況下可直接得出葉綠素的相對(duì)含量,即SPAD值,具有無(wú)損、實(shí)時(shí)檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn),彌補(bǔ)了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室分析的不足,深受廣大學(xué)者們的青睞[4]。先前的研究表明,葉綠素儀已在羊草葉片、黑麥草葉片、煙葉、草莓葉片、西葫蘆葉片以及小麥葉片等葉綠素含量預(yù)測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用[5-10],但不同物種利用SPAD值預(yù)測(cè)葉綠素含量的模型準(zhǔn)確度還存在一些差異[5],針對(duì)同一環(huán)境下不同的功能群和物種,便攜式SPAD葉綠素儀和傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室分析兩種方法是否均適用,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

      本研究對(duì)大連民族大學(xué)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)校區(qū)校園內(nèi)的四類功能群共八種植物的SPAD值和葉綠素含量進(jìn)行了測(cè)定,探討不同功能群和物種間的SPAD值和葉綠素含量差異以及SPAD 值與葉綠素含量之間是否存在相關(guān)性,為利用SPAD值預(yù)測(cè)不同物種間的葉綠素含量提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)地概況

      實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于大連民族大學(xué)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)校區(qū)(遼寧省大連市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)遼河西路18號(hào))校園內(nèi)。該校區(qū)位于大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)中心地帶,屬暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候,年均降水量550-950毫米,年均氣溫10.5℃左右,最高氣溫35.3℃左右,最低氣溫在-18.8℃左右。

      1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與取樣方法

      于2017年9月晴朗天氣,在大連民族大學(xué)校園內(nèi)選取八種常見(jiàn)物種,共四類功能群,每類功能群兩種植物。分別為:?jiǎn)棠荆杭訔?、銀杏;灌木:紫丁香、冬青;藤本:紫藤、蘿藦;草本:苦賣菜、車前草。采用便攜式SPAD(502)葉綠素儀測(cè)定和丙酮浸取法測(cè)定兩種方法進(jìn)行植物葉綠素的測(cè)定。

      便攜式SPAD葉綠素儀測(cè)定法:在植物葉片上隨機(jī)選取五個(gè)位置進(jìn)行SPAD值的測(cè)定,最后取平均值,記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)后采摘裝袋,標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行丙酮法測(cè)定。每種植物隨機(jī)測(cè)定30片樣品。

      丙酮浸取法測(cè)定:將帶回的鮮葉用打孔器取樣并稱重(與SPAD測(cè)量的葉片相同),然后放置于標(biāo)號(hào)的試管中,在每個(gè)試管中用移液管加入10 ml的80%的丙酮溶液,用封口膜封口置于陰暗處放置48 h。48 h后分別在吸光度663 nm和646 nm下以80%的丙酮為空白測(cè)定吸光度,記錄數(shù)據(jù)。采用Lichtenthaler[11]公式計(jì)算葉綠素a(Ca)、葉綠素b(Cb)以及總?cè)~綠素(Ca+b)含量。

      1.3 數(shù)據(jù)分析

      將功能群、物種作為固定因子進(jìn)行一般線性模型分析,不同功能群和物種間進(jìn)行多重比較(Tukey檢驗(yàn)),采用一般線回歸分析度量SPAD和葉綠素之間的線性相關(guān),顯著性水平α=0.05。統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 26中完成,Sigmaplot 12.5和Excel2018作圖表。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 不同植物之間葉綠素的方差分析

      SPAD和丙酮法都能體現(xiàn)不同功能群或物種之間的差異,一般線性模型結(jié)果顯示:不同功能群和不同物種之間SPAD與葉綠素含量差異極顯著(P≤0.001),見(jiàn)表1。

      2.2 不同功能群葉片SPAD和葉綠素含量的差異

      從SPAD值來(lái)看,四類功能群SPAD值變化范圍分別為:?jiǎn)棠荆?4.04~61.44,灌木:48.10~82.14,藤本:29.38~62.00,草本:28.62~66.36。灌木SPAD值最高,顯著高于喬木、藤本及草本(P<0.001),喬木SPAD值顯著高于藤本和草本,藤本和草本之間無(wú)差異(圖1A)。從葉綠素含量來(lái)看,四類功能群葉綠素a含量變化范圍分別為:?jiǎn)棠荆?.65~2.97 mg·g-1,灌木:0.52~2.75 mg·g-1,藤本:0.03~1.09 mg·g-1,草本:0.39~1.80 mg·g-1。喬木和灌木葉綠素a含量最高,其次為藤本,草本葉綠素a含量最低(P<0.001)(圖1B);葉綠素b含量變化范圍分別為:?jiǎn)棠荆?.01~1.34 mg·g-1,灌木:0.09~1.16 mg·g-1,藤本:0.02~1.99 mg·g-1,草本:0.07~0.59 mg·g-1。藤本葉綠素b含量最高,顯著高于喬木、灌木及草本(P<0.001),而喬木、灌木以及草本間無(wú)差異(圖1C);總?cè)~綠素含量變化范圍分別為:?jiǎn)棠荆?.79~3.74 mg·g-1,灌木:0.62~2.96 mg·g-1,藤本:0.41~2.08 mg·g-1,草本:0.49~2.20 mg·g-1。喬木和灌木總?cè)~綠素含量最高,藤本和草本最低(P<0.001),如圖1。

      2.3 不同物種葉片SPAD和葉綠素含量的差異

      從SPAD值來(lái)看,八種植物SPAD值變化范圍分別為:加楊:34.04~58.36,銀杏:46.66~61.44,紫丁香:48.10~62.66,冬青:63.54~82.14,紫藤:34.20~62.00,蘿藦:29.38~49.28,苣荬菜:35.34~66.36,車前:28.62~52.28,SPAD值由高到低表現(xiàn)為冬青>紫丁香>銀杏>苣荬菜>紫藤>加楊>蘿藦>車前(圖2A)。從葉綠素含量來(lái)看,八種植物葉綠素a含量變化范圍分別為:加楊:0.97~2.97 mg·g-1,銀杏:0.65~1.51 mg·g-1,紫丁香:1.15~2.75 mg·g-1,冬青:0.52~1.71 mg·g-1,紫藤:0.03~0.15 mg·g-1,蘿藦:0.36~1.09 mg·g-1,苣荬菜:0.54~1.80 mg·g-1,車前:0.39~1.03 mg·g-1。葉綠素a含量由高到低表現(xiàn)為紫丁香>加楊>苣荬菜>銀杏>冬青>蘿藦>車前>紫藤(P<0.001)(圖2B);葉綠素b變化含量分別為:加楊:0.06~1.34 mg·g-1,銀杏:0.01~0.32 mg·g-1,紫丁香:0.20~1.16 mg·g-1,冬青:0.09~0.48 mg·g-1,紫藤:0.42~1.99 mg·g-1,蘿藦:0.02~0.59 mg·g-1,苣荬菜:0.07~0.59 mg·g-1,車前:0.08~0.24 mg·g-1。葉綠素b含量由高到低表現(xiàn)為紫藤>加楊>紫丁香>苣荬菜>冬青>蘿藦>車前>銀杏(P<0.001)(圖2C);總?cè)~綠素含量變化范圍分別為:加楊:1.09~3.74 mg·g-1,銀杏:0.79~1.67 mg·g-1,紫丁香:1.89~2.96 mg·g-1,冬青:0.62~2.19 mg·g-1,紫藤:0.46~2.08 mg·g-1,蘿藦:0.41~1.38 mg·g-1,苣荬菜:0.62~2.20 mg·g-1,車前:0.49~1.22 mg·g-1???cè)~綠素含量由高到低表現(xiàn)為加楊>紫丁香>苣荬菜>紫藤>冬青>銀杏>蘿藦>車前(P<0.001),如圖2。

      2.4 不同方法間的回歸關(guān)系

      對(duì)四類功能群共八種植物葉片SPAD值與葉綠素含量進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果見(jiàn)表2。喬木功能群的加楊和銀杏SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量之間均存在顯著線性關(guān)系;灌木功能群的紫丁香SPAD值與葉綠素a和總?cè)~綠素含量之間存在顯著線性關(guān)系,與葉綠素b含量之間無(wú)顯著線性關(guān)系,而冬青SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量之間均存在顯著線性關(guān)系;藤本功能群的紫藤SPAD值與葉綠素a之間存在顯著線性關(guān)系,與葉綠素b和總?cè)~綠素含量之間無(wú)顯著線性關(guān)系,蘿藦SPAD值與葉綠素a之間存在顯著線性關(guān)系,與葉綠素b和總?cè)~綠素含量之間無(wú)顯著線性關(guān)系;草本功能群的苣荬菜SPAD值與葉綠素b和總?cè)~綠素含量之間存在顯著線性關(guān)系,與葉綠素a之間無(wú)顯著線性關(guān)系,車前SPAD值與葉綠素a和總?cè)~綠素含量之間存在顯著的線性關(guān)系,與葉綠素b之間無(wú)顯著線性關(guān)系。

      表2 不同物種葉綠素含量與SPAD值的關(guān)系

      續(xù)表2 不同物種葉綠素含量與SPAD值的關(guān)系

      2.5 不同物種間葉綠素a和葉綠素b比值的差異

      不同物種間葉綠素a/b值均存在極顯著差異(P<0.001)。銀杏葉綠素a/b值最高,紫藤葉綠素a/b值最低,其余六種植物間無(wú)顯著差異,如圖3。

      3 討 論

      葉綠素含量是植物生理的重要指標(biāo)之一,反映了植物光合能力、發(fā)育階段、生長(zhǎng)狀況、生理代謝水平及營(yíng)養(yǎng)條件[4]。本研究發(fā)現(xiàn),不同功能群和物種間SPAD值和葉綠素含量表現(xiàn)出極顯著差異(圖1~2),這說(shuō)明便攜式SPAD葉綠素儀和80%丙酮浸取法(鮮葉)兩種方法均適用,但變化趨勢(shì)不同。SPAD葉綠素儀通過(guò)二極管發(fā)射660 nm和940 nm 的紅光和近紅光進(jìn)行葉綠素 SPAD 值的測(cè)定,SPAD值是一個(gè)無(wú)量綱的比值,在測(cè)定植物葉片相對(duì)葉綠素含量的同時(shí)具有對(duì)葉片無(wú)損傷的優(yōu)勢(shì)[2],但不同物種利用 SPAD 值預(yù)測(cè)葉綠素含量的模型準(zhǔn)確度還存在一定差別,需根據(jù)測(cè)定目標(biāo)的不同進(jìn)行具體分析[5]。而傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法雖可避免物種間模型差異,但耗時(shí)較長(zhǎng),野外實(shí)驗(yàn)中樣品存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致葉綠素流失,王凱等[12]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)以單位鮮重計(jì)算葉綠素含量時(shí),含水量高的葉片往往會(huì)低于含水量低的葉片,結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定誤差,因此,兩種方法間存在差異。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了八種植物共24組葉綠素?cái)?shù)據(jù)(表2),其中與SPAD值達(dá)到顯著線性關(guān)系的有17組,未達(dá)到顯著線性關(guān)系的有7組,其中包括葉綠素a一組,葉綠素b四組,總?cè)~綠素兩組,且除加楊和苣荬菜外,其余六種植物SPAD值與葉綠素a回歸系數(shù)(R2)均高于葉綠素b,說(shuō)明SPAD值與葉綠素b的相關(guān)性不及葉綠素a。這可能與SPAD葉綠素儀的吸收波長(zhǎng)有關(guān)(660 nm和940 nm),葉綠素a和葉綠素b的吸收峰在663 nm和645nm附近[12-13],相對(duì)于葉綠素b,葉綠素a的吸收峰更接近于儀器測(cè)定波長(zhǎng),因此線性回歸系數(shù)更高。

      在SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量呈顯著線性關(guān)系的三種植物中,SPAD值:冬青>銀杏>加楊,總?cè)~綠素含量:加楊>冬青>銀杏,在八種植物當(dāng)中,加楊的SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量回歸系數(shù)均最高,說(shuō)明SPAD值可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)加楊葉片中葉綠素含量,且加楊和紫丁香葉片中葉綠素總量最高。這可能是由于加楊、銀杏以及紫丁香屬高大喬木,具有較寬的生態(tài)位,優(yōu)先對(duì)光能進(jìn)行利用和截留,但銀杏的總?cè)~綠素含量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及加楊和紫丁香。梁俊林等[14]對(duì)9-11月份銀杏葉變色期的研究發(fā)現(xiàn),銀杏葉從微黃變?nèi)S總?cè)~綠素含量從3.999 mg·g-1降到0.077 mg·g-1,本實(shí)驗(yàn)中銀杏的總?cè)~綠素含量為1.89~2.96 mg·g-1,已屬于微黃期,但單從外觀不易分辨,銀杏葉片中葉綠素的不斷降解是其逐漸變黃的成因[14-15],導(dǎo)致結(jié)果偏低。

      在本研究中,除紫藤外,其余七種植物葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量的變化趨勢(shì)一致,葉綠素a含量均顯著高于葉綠素b含量,而紫藤的葉綠素a卻顯著低于葉綠素b含量,導(dǎo)致葉綠素a與葉綠素b比值最低,為0.06,遠(yuǎn)低于其他物種(圖3),這是一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)。Hoflacher等[16]研究發(fā)現(xiàn),在葉綠素a與葉綠素b比值中,陰生植物葉綠素a/b值往往小于3,說(shuō)明紫藤能夠忍受一定程度的遮蔭環(huán)境,而除紫藤外,其余七種植物均適合生活在光線充足的向陽(yáng)處。在研究區(qū)內(nèi),紫藤位于遮蔭位置,且葉片多呈藍(lán)紫色,張春牛[17]研究發(fā)現(xiàn)葉綠素b在藍(lán)紫光部分的吸收帶較寬,而陰生植物能在散射光下更好的利用藍(lán)紫光,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。

      4 結(jié) 論

      通過(guò)對(duì)四類功能群即八種植物的SPAD值和葉綠素含量進(jìn)行了測(cè)定比較和相關(guān)分析,不同功能群和不同物種之間SPAD與葉綠素含量差異極顯著(P≤0.001),但趨勢(shì)不同。其中加楊、銀杏以及冬青葉片SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量間均存在顯著線性正相關(guān)性,而紫丁香、紫藤、蘿藦、苣荬菜以及車前則存在無(wú)顯著關(guān)系。因此,在測(cè)定不同物種間葉綠素時(shí),如兩種方法間存在顯著相關(guān)性,優(yōu)先選擇方便、快捷且無(wú)損的便攜式SPAD葉綠素儀;如出現(xiàn)無(wú)顯著關(guān)系的結(jié)果,在選擇實(shí)驗(yàn)方法時(shí),可根據(jù)具體研究目的和內(nèi)容而定。

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