食源性致病菌的核酸可視微陣列檢測技術

李云霞，馬生龍，聶瑩瑩，馬莉萍

（甘肅省科學院傳感技術研究所 甘肅省傳感器與傳感技術重點實驗室，甘肅 蘭州730000）

近年來，食源性微生物中毒成為一個廣泛且日益嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題[1-2]。調查表明，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌是我國主要的食源性致病菌，由其引發(fā)的食物中毒平均發(fā)病率和病死率高，食品安全問題突出[3]。加強對有害病菌的檢測研究，從而及時準確地檢測出食品中的致病菌，是控制食品中病原菌污染和各類傳染病蔓延的根本措施[4]。目前，國內外在食品中病原菌檢測時常用的檢測方法主要有傳統(tǒng)生化培養(yǎng)檢測法、免疫學方法、探針雜交、PCR法等[5-8]，這些方法普遍存在速度慢或者假陽性率高的缺點，在相當大的程度上限制了對其快速檢測和識別能力。因此，有必要建立起食源性致病菌的高通量、快速、準確的檢測體系，以確保在相對較短的時間內正確判定食品的安全性，有效地預防和控制食源性疾病。

可視化視檢測技術[9-10]是一種新型技術。與傳統(tǒng)檢測方法不同，它可以將特定的分子結合轉變成可以直接通過肉眼觀察到的信號，擺脫普通檢測技術對專業(yè)人員和大型設備的依賴，具有快速、準確、方便的特點，在致病菌檢測中具有良好的應用前景[11-13]。本研究中利用納米金結合銀染放大信號的方法，建立了一種可視化的食源性微生物快速檢測微陣列，實現(xiàn)對3種食源性微生物的可視化快速檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

沙門氏菌（21842）、金黃色葡萄球菌（10001）、志賀氏菌（10865）：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；納米金（自制）、醛基化玻片（自制）、吐溫20（Tween 20）、牛血清蛋白（BSA）、0.1 mol/L磷酸緩沖液（PB）（pH 7.2）、0.1 mol/L磷酸緩沖生理鹽水（PBS）、0.1 mol/L NaCl、0.2×洗液（SSC：質量分數(shù)0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS）、0.03 mol/L NaCl、0.3 mmol/L C6H5Na3O7·2H2O）、對苯二酚、檸檬酸、檸檬酸三鈉、硝酸銀、DNA Marker、所需探針序列：由生工生物公司合成；核酸提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）、PCR擴增試劑盒：購自上海生工生物有限公司。

雜交液：45.5μL檢測探針，17.5μL 20×SSC，3 μL質量分數(shù)10% SDS，5 mg硫酸葡聚糖，2μL去離子甲酰胺，32μL去離子水。

JEM-2100HR高分辨透射電鏡：日本電子公司產 品；Bio-Rad T100 PCR儀、Bio-Rad powerpac Unversal電泳儀、Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像分析系統(tǒng)：美國伯樂公司產品；HZQ-FX全溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司產品；EMS-20恒溫水浴鍋：金壇市宏凱儀器廠制造；島津紫外分光光度計：日本島津公司產品；Sartorius ST124分析天平：德國賽多利斯公司產品；H1650型離心機：湖南湘儀公司產品；微量移液器：德國Eppendorf公司產品；DZF-6050真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司產品；壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠制造。

1.2 引物、探針的設計與合成

在GenBank中獲取細菌核酸序列，找到沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因序列、志賀氏菌ipaH基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計與invA基因、nuc基因、ipaH基因序列兩端互補的特異性探針（氨基化修飾的基片探針，巰基化修飾的檢測探針）和PCR引物，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫在線Blast分析篩選。引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。設計的探針和PCR引物見表1—2。

1.3 檢測探針的標記

檢測探針標記到納米金表面：取10 nmol/L粒徑為17 n的納米金溶液1 mL，以9 000 r/min離心40 min棄上清液，加入100μL去離子水重懸；加濃度為100μmol/L的檢測探針5μL，使總探針的終濃度達到5μmol/L，在室溫中放置過夜；之后分3次逐漸加入1 mol/L NaCl，0.1 mol/L PB（pH 7.2）至最終濃度分別為0.1 mol/L和10 mmol/L，充分混勻，室溫放置30 h；用0.01 mol/L PB（0.1 mol/L NaCl）溶液9 000 r/min離心40 min，清洗2次，棄上清液，再加100μL含有1 mol/L NaCl和0.1 mol/L PB（pH 7.2）的重懸液，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 核酸探針序列表Table 1 List of nucleic acid probe sequences

表2 PCR引物序列Table 2 Sequences of PCR primers

1.4 微陣列的制備

將5個不同濃度（1 mmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L、100 pmol/L、1 pmol/L）氨基化探針點樣于醛基化基片的表面，點樣直徑100μm，點間距3 mm，點樣量0.1μL，每個濃度多次重復，水浴37℃固定18 h，經質量濃度為10 mg/mL的BSA封閉未反應的醛基，37℃水浴放置1 h，用0.1 mol/L的PBST（1×PBS+質量分數(shù)0.05%吐溫）清洗2次，每次3 min，干燥后備用。

1.5 細菌基因組DNA的提取和擴增

快速提取細菌基因組DNA，用試劑盒提取：將細菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床培養(yǎng)12 h，取3 mL培養(yǎng)液3 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL進行核酸提取，按DNA快速提取試劑盒說明書操作。

20μL PCR反應體系：10×Taq Buffer含KCl 2μL，引物各0.5μL（100 umol/L），4種dNTP混合物各1μL（0.2 mmol/L），模板DNA 1μL（100μmol/L），1.5 mmol/L MgCl 1.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，加三蒸水至20μL。 擴增條件：94℃預變性5 min；經 變 性（94℃，30 s），退 火（55℃，30 s），延 伸（72℃，30 s），35個循環(huán)；最后于72℃延伸5 min。

1.6 微陣列的雜交

在基片的每個點樣區(qū)滴加1μL雜交液，并將基片放置在保濕盒中，置于42℃水浴鍋中雜交2.5 h。清洗液（0.03 mol/L氯化鈉、0.3 mmol/L SSC、質量分數(shù)0.1% SDS）預熱到42℃，輕輕沖洗芯片3次。ddH2O沖洗2次，氮氣吹干。

1.7 銀染

取350μL檸檬酸緩沖液，加入150μL對苯二酚（0.51 mol/L），再加入50μL AgNO3溶液，常溫避光銀染10 min，終止銀染反應，用清水沖洗3次觀察結果。

2 結果與討論

2.1 檢測探針的標記

從圖1（a）中可見17 nm納米金顆粒均勻，界面清晰而且分散性良好；圖1（b）（c）（d）標記探針的納米金可見周圍有一層物質，納米金在一定范圍有聚集現(xiàn)象，表明探針已經標記到了納米金上。隨著探針的標記，納米金粒徑增大，對應的紫外吸收峰有向長波段紅移的趨勢[14-15]；由圖1（e）可看出：標記前納米金最大吸收峰值在521 nm;標記沙門氏菌探針后最大吸收峰在528 nm;標記金黃色葡萄球菌探針后的最大吸收峰在527 nm;標記志賀氏菌探針后的最大吸收峰在525 nm，標記了探針的納米金最大吸收峰波長移動了7 nm。這也說明核酸探針標記到了納米金顆粒表面，使納米金粒子尺寸和形狀有所改變，改變了納米金的光譜特性[16]。

圖1 納米金及修飾后的3種檢測探針的TEM圖和紫外-可見光譜掃描圖Fig.1 Scanning results of AuNP probes with TEM and UV-Vis spectrum

2.2 細菌基因組DNA的提取結果

將提取的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的基因組DNA，采用分度光度計對提取的DNA溶液純度、濃度進行檢查，在1.5 g/dL瓊脂糖凝膠中，100 V電壓下，電泳時間30 min進行電泳檢測，凝膠成像儀觀察分析，與標記物（Marker）相比在6 500 bp附近有3條明亮條帶（見圖2）。

圖2 3種菌的基因組DNA電泳圖Fig.2 Salmonella、Staphylococcus aureus and Shigella DNA electrophoresis

2.3 細菌基因組DNA的PCR擴增

通過查閱沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、志賀氏菌ipaH基因的相關文獻，并根據(jù)本實驗中探針的位置，從表1中相對應引物對3株致病菌株進行擴增。對沙門氏茵、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌PCR擴增結果做凝膠電泳：1.5 g/dL瓊脂糖凝膠，100 V電壓，電泳時間25 min，凝膠成像儀觀察分析，1、2、3泳道分別得到長度為425、280、312 bp左右目的片段，片段符合預期擴增片段長度。而且泳道亮度很強，說明擴增產物較多（見圖3）。

圖3 沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因序列和志賀氏菌ipaH基因PCR電泳圖Fig.3 Salmonella invA gene、Staphylococcus aureus nuc gene and Shigella ipaH gene PCR

2.4 微整列雜交

將檢測探針分別與基因組DNA（1 nmol/L）、PCR產物及特異靶序列在醛基化玻片上進行雜交，銀染放大信號后呈現(xiàn)出肉眼可見的信號，見圖4。

圖4 特異靶序列、DNA及PCR銀染顯色Fig.4 Results of silver staining with specific target sequences，DNA and PCR

由實驗可以看出檢測探針分別與基因組DNA、PCR產物及特異靶序列雜交，銀染顯色，三者的結果一致都顯示陽性，證明了提取的基因組DNA與檢測探針雜交、PCR產物與檢測探針雜交的方法都是可行的，但從操作的過程來講用提取的基因組DNA與檢測探針雜交銀染顯色，這一方法更簡便快捷。

2.5 微陣列特異性實驗

采用3種檢測探針分別與3種菌的基因組DNA做雜交實驗，通過銀染放大信號，研究其特異性。

如圖5（a）為特異靶序列invA只與沙門氏菌基因組DNA有雜交結合，結果顯示陽性，而與金黃色葡萄球菌基因組DNA、志賀氏菌基因組DNA沒有雜交反應，結果顯示陰性；圖5（b）為特異靶序列nuc只和金黃色葡萄球菌基因組DNA有雜交結合顯示陽性結果，而與沙門氏菌、志賀氏菌DNA沒有雜交反應，結果顯示陰性；圖5（c）為特異靶序列ipaH只和志賀氏菌基因組DNA有雜交結合，顯示陽性，而與沙門氏菌、金黃色葡萄球菌DNA沒有雜交反應，結果顯示陰性。表明該方法的檢測具有較高的特異性。

圖5 微陣列特異性實驗結果Fig.5 Specific experimental results of microarray substrate

2.6 微陣列靈敏度實驗

將特異靶序列、基因組DNA（1 nmol/L）和PCR產物，使用UV-2550島津紫外分光光度計測定其濃度，稀釋原液配成5個不同濃度（1 mmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L、100 pmol/L、1 pmol/L），進行雜交顯色實驗（見圖6）。

由實驗可以看出在5種不同濃度下，檢測探針分別與基因組DNA、PCR產物及特異靶序列的雜交銀染，結果一致都顯示陽性，但隨著濃度的減小，陽性信號相應的減弱。實驗結果顯示該微整列檢出限為1 mmol/L～1 pmol/L。

圖6 微陣列基片敏度實驗結果Fig.6 Sensitivity experimental results of microarray substrate

3結語

銀染信號放大技術已在致病菌的檢測中被廣泛應用，其有效提高了檢測靈敏度。李向麗等[17]采用納米金標記結合銀染信號放大技術實現(xiàn)了對福氏志賀氏菌的檢測，銀染后檢測信號增強了上萬倍，對目標菌DNA檢測限達2 fmol/L。劉小蘭等[18]將PCR擴增的金黃色葡萄球菌nuc基因與生物素探針、納米金探針形成的三明治結構固定在已包被鏈霉親和素的微孔板上，然后在低溫下逐步銀染顯色，從而放大檢測信號，檢測靈敏度為1 pmol/L。

作者通過銀染放大信號技術，建立了一種同時檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的可視化微陣列，為3種食源性微生物的檢測提供了快速、準確、靈敏的方法。首先對invA基因序列、nuc基因序列、ipaH基因序列進行擴增，分別得到425、280、312 bp左右PCR產物。通過比較檢測探針與基因組DNA、PCR產物及特異靶序列的雜交銀染，目標菌都顯示了陽性，非目標菌顯示陰性。在微陣列特異性實驗中，基因組DNA跟設計對應檢測探針雜交結果顯示陽性，跟其他菌檢測探針不雜交，結果顯示陰性，證明了該方法具有特異性。在微陣列靈敏性實驗中，檢測探針分別與基因組DNA、PCR產物及特異靶序列雜交時，在1 mmol/L～1 pmol/L濃度范圍內，銀染結果肉眼清晰可見。通過上述實驗數(shù)據(jù)比較，證明作者建立的可視化核酸微陣列檢測食源性微生物的方法是成功的。

作者建立的可視化核酸微陣列對食源性致病菌的檢測靈敏、準確、簡便，實用性強，擺脫了基因芯片在雜交結果分析階段對熒光掃描儀的依賴，雜交結果明顯直觀。為食源性致病菌的檢驗提供了新的思路和方法，可在基層或偏遠地區(qū)的快速初篩領域推廣應用。