靈龜八法對腎陽虛家兔免疫功能的影響

趙彩嬌 譚敏 葉藝 王曙松 范郁山

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

腎為先天之本，水火之宅，是維持人體生命活動的重要臟腑，具有藏精、主水、納氣三大生理功能，為臟腑陰陽之根本。腎陽又稱為命門之火，具有溫煦、蒸騰、氣化、推動等作用。腎陽不足，出現(xiàn)溫煦、蒸騰、氣化等功能減退，并出現(xiàn)腎陽虛衰等一系列證候。

腎陽虛證是中醫(yī)臟腑辨證的一個重要證型，見于多種疾病的過程中，一直為中醫(yī)界研究的重點。中醫(yī)理論認為，腎虛是衰老的主因，陽氣是生命的根本，腎陽虛與衰老有著密不可分的關(guān)系。故本實驗擬用腎陽虛模型家兔為研究對象，以血清白細胞介素(IL)-2，免疫球蛋白(Ig)A、IgG、IgM為客觀指標(biāo)，觀察靈龜八法按時開穴艾炷灸對其含量水平變化的影響。

1 材料與方法

1.1動物分組 選用廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供的健康新西蘭家兔40只，8月齡，體重2.0～2.2 kg，雌雄各半(實驗動物許可證號為SYXK桂2012-0001)。實驗前，所有動物在實驗室條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)2 w，實驗室要求每天光照與黑暗各12 h(光照時間為7∶00～19∶00)、室溫23℃，相對濕度為65%。在此期間自由進食和飲水。飼料由動物實驗中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后再次稱重，按隨機區(qū)組設(shè)計，隨機分為空白對照組、模型對照組、靈龜八法治療組、神闕治療對照組各10只。

1.2試劑與儀器 (1)藥品和試劑：造模用羥基脲片，由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，批號為11204LC，規(guī)格為0.5 g/片。IL-2試劑盒、IgA、M、G試劑盒由蘇州卡爾文生物科技有限公司提供，規(guī)格96T，批號20121001A。(2)主要實驗儀器：德國Thermo Electron公司的Thermo離心機，型號ST16R；美國BioTek公司的全波長酶標(biāo)儀，型號EPOCH BIOTEK；日本三洋電機株式會社的醫(yī)用低溫箱(-80℃)，型號MDF-U7386S；日本三洋電機株式會社恒溫箱(CO2培養(yǎng)箱)，型號MCO-18AIC。(3)艾絨：南陽綠瑩艾草制品有限公司的三年陳艾，純度10∶1。

1.3造模方法 羥基脲片用研缽搗碎，用清水配置成500 mg/3 ml的混懸液，充分混勻〔1〕。除空白對照組外，其余組家兔均用羥基脲混懸液空腹灌胃，劑量為700 mg/(kg·d)。連續(xù)造模5 d，家兔即出現(xiàn)體重下降、進食量減少、豎毛拱背、掉毛、毛色無光澤、畏寒肢冷、活動減少、神態(tài)萎靡、踡臥、尿多、下利清谷等腎陽虛征象。在整個造模過程中實驗家兔未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

1.4干預(yù)治療方法 空白對照組：每天上午只稱體重，不灌胃。稱完體重后，將家兔取仰臥位，四肢固定于實驗臺上5 min。模型對照組：每天上午用羥基脲混懸液，劑量700 mg/(kg·d)空腹灌胃后，再將家兔取仰臥位，四肢固定于實驗臺上5 min。連續(xù)造模5 d。靈龜八法治療組：同模型對照組連續(xù)造模5 d，造模結(jié)束次日巳時應(yīng)用靈龜八法按時開穴艾炷灸干預(yù)治療，連續(xù)治療10 d。這10 d的開穴依次是照海、照海、內(nèi)關(guān)、外關(guān)、公孫、外關(guān)、申脈、公孫、外關(guān)、公孫。腧穴定位方法主要參照鄧春雷等〔2〕主編《實驗針灸學(xué)》的“常用實驗動物的針灸穴位之定位方法”進行。艾炷制作：將細軟艾絨捻緊成為直徑約5 mm、高1 cm的圓錐狀艾炷，每炷約50 mg。施灸方法：將家兔取仰臥位，四肢固定于實驗臺上，在靈龜八法當(dāng)時辰所開穴位上進行艾炷灸，單側(cè)直接無瘢痕灸。根據(jù)先陽后陰的原理，先灸左側(cè)穴位，次日再灸右側(cè)穴位，交替進行。施灸時先將施灸部位的體毛剪去，再涂以少量蘆薈汁以固定艾炷，并防止?fàn)C傷，無瘢痕直接灸，每次連續(xù)灸3壯，每壯以家兔全身掙扎為度。每日1次，共治療10 d。神闕治療對照組：同模型對照組連續(xù)造模5 d，造模結(jié)束次日巳時開始進行治療。將家兔取仰臥位，四肢固定于實驗臺上，在神闕穴上進行艾炷灸。腧穴定位方法及施灸方法同靈龜八法治療組，每日1次，共治療10 d。

1.5標(biāo)本采集與檢測 各組家兔于造模前、造模后、治療后分別取耳緣靜脈血3 ml，2 000 r/min離心10 min，吸取血清置于-80℃冰箱保存待測。采用酶聯(lián)免疫法測定細胞因子IL-2及IgG、IgA、IgM的含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.6生命質(zhì)量評分 參照《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》〔3〕中的腎陽虛診斷標(biāo)準(zhǔn)，采用等級評定積分法自制評分量表，選擇進食量、體重、豎毛拱背、掉毛、毛色無光澤、畏寒肢冷、活動減少、神態(tài)萎靡、踡臥、尿多、下利清谷等為積分癥狀。根據(jù)癥狀輕度、中度、重度分別計2、4、8分；有其他癥狀者計2分，無計0分。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組家兔生命質(zhì)量評分比較 造模后，空白組未出現(xiàn)腎陽虛的癥狀；與空白對照組比較，模型對照組、靈龜八法治療組、神闕治療對照組生命質(zhì)量評分明顯升高(P<0.01)。造模后靈龜八法治療組與神闕治療對照組生命質(zhì)量評分與模型對照組比較，無明顯差異(均P>0.05)。與造模后比較，靈龜八法治療組和神闕治療對照組治療后癥狀明顯改善(P<0.01)，且靈龜八法治療組優(yōu)于神闕治療對照組(P<0.05)。見表1。

表1 造模后及治療后家兔生命質(zhì)量評分的變化分)

2.2各組家兔血清細胞因子IL-2、IgG、IgA、IgM比較 造模前4組血清IL-2、IgG、IgA、IgM水平無顯著差異(P>0.05)。造模后，模型對照組、神闕治療對照組、靈龜八法治療組血清IL-2水平較造模前顯著降低，血清IgG、IgA、IgM水平較造模前顯著升高與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。治療后，靈龜八法治療組IL-2水平明顯升高(P<0.05)，而神闕治療對照組的IL-2含量雖略有升高，但無顯著差異(P>0.05)，兩治療組組間比較差異顯著(P<0.05)，治療后，靈龜八法治療組及神闕治療對照組血清IgG、IgM、IgA含量均下降，且與模型對照組比較有顯著差異(P<0.01，P<0.05)，治療組間比較差異無顯著(P>0.05)。見表2。

表2 4組血清IL-2、IgG、IgA、IgM檢測結(jié)果

3 討 論

中醫(yī)中藥里是沒有“免疫”這一專用術(shù)語，但可以從現(xiàn)代免疫學(xué)精確的定量檢測手段應(yīng)用中，觀察到中醫(yī)藥在免疫領(lǐng)域里的作用〔4〕。中醫(yī)理論認為“正氣存內(nèi)，邪不可干”，“腎為先天之本”，是人生生不息之根，正氣的產(chǎn)生離不開腎陽的溫煦，故腎與免疫具有十分密切的關(guān)系。腎陽虛證涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、物質(zhì)代謝、生殖、免疫、受體等多個方面，主要表現(xiàn)在全身功能減退及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)功能的紊亂〔5〕。操紅纓等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，腎陽虛多尿模型大鼠CD3+、CD4+百分比，較正常對照組明顯減少，CD3+、CD8+百分比，較正常對照組明顯增加，說明腎陽虛大鼠的免疫功能紊亂。譚從娥等〔7〕則利用基因表達譜芯片技術(shù)探討腎陽虛證的發(fā)生與免疫功能類基因的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示免疫系統(tǒng)反應(yīng)特別是MHC-Ⅱ類分子介導(dǎo)的抗原加工及提呈過程的異?？赡苁悄I陽虛證發(fā)生的主要免疫機制?，F(xiàn)代多項研究〔8～10〕顯示，通過提高免疫功能可以改善腎陽虛癥狀，可見，腎陽虛與免疫功能關(guān)系密切。

中醫(yī)作為世界上影響力較大的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，自古以來就對防病延衰極為重視。中醫(yī)傳統(tǒng)的衰老學(xué)說主要有〔11〕：①陰陽失調(diào)說；②臟腑虛衰說(包括腎虧虛為主說、脾胃虛衰為主說)；③精氣神虧耗說等。在臟腑虛衰說中，認為腎氣虛衰是衰老的主要原因，《素問》曰：“五臟之真，惟腎為根”，認為腎陽通過蒸化腎陰產(chǎn)生腎氣，而腎氣則直接關(guān)系到人體的生長、發(fā)育、生殖和衰老?？梢哉f，變老與否、變化的速度、壽命的長短，很大程度取決于腎氣的強弱，所以腎氣虛衰是衰老的重要原因。

腎虛中又以腎陽虛與衰老的關(guān)系最為密切。中醫(yī)學(xué)認為，陽氣是人體生命活動中的動力源，與壽命關(guān)系極大。如《內(nèi)經(jīng)》云：“陽氣者，若天與日，失其所則折壽而不彰”，“人年五十以上，陽氣日衰，損與日至，心力漸退，忘前失后，興居怠惰”。可見老年人功能退行性改變是陽氣衰微的結(jié)果。腎陽為人體一身陽氣之根本，若腎陽一衰，則一身之陽皆衰，從而加速衰老的進程?？梢娔I是全身各臟腑的調(diào)節(jié)中心，腎氣虛中的腎陽虛是人體衰老的主要原因。

本研究結(jié)果提示靈龜八法對腎陽虛家兔血清IL-2水平具有明顯的提高作用，這可能與其刺激細胞毒性T淋巴細胞細胞的增殖和分化有關(guān)，從而調(diào)節(jié)細胞免疫功能。

家兔受羥基脲片免疫抑制后，機體自身調(diào)節(jié)起免疫應(yīng)答反應(yīng)所致產(chǎn)生IgA、IgG、IgM抗體，故數(shù)值升高。本研究結(jié)果說明靈龜八法艾炷灸可使家兔受羥基脲片免疫抑制減輕，故治療后IgA、IgG、IgM數(shù)值降低，這可能是靈龜八法艾炷灸提高腎陽虛家兔的免疫功能的作用機制之一，這對預(yù)防和減緩腎陽虛的進展具有積極的意義。

免疫功能學(xué)說是1969年由美國學(xué)者R·Walford首先提出的。他認為與自身抗體有關(guān)的自身免疫在導(dǎo)致衰老的過程中起著決定性作用。自身免疫的發(fā)生，主要是免疫系統(tǒng)自我識別功能的降低或障礙，不能識別“自我”和“非我”，將自身正常的組織細胞，當(dāng)作外來的“異物”進行攻擊，導(dǎo)致機體的損害、衰老和死亡?？梢娒庖呦到y(tǒng)對維護人體健康、防止衰老及老年病的防治是很重要的。