貴陽月季灰霉病病原鑒定及生物學特性

程歡歡 任靜 宋莉莎 李忠

摘要：月季灰霉病是貴陽市烏當區(qū)月季種植區(qū)發(fā)生最嚴重的真菌病害之一。本研究采用組織分離法和致病性測定，分離到1株引起該病的病原菌，通過形態(tài)學特征觀察及RPB2、HSP60、G3PDH多基因序列分析，表明引起該病害的病原菌為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。生物學特性研究表明：該病原菌生長較好的培養(yǎng)基為PDA;菌絲生長最適碳、氮源分別為葡萄糖、硝酸銨;最適生長溫度為20 ℃;最適pH為6;光照對病原菌菌絲生長差異顯著，其中12 h光暗交替條件下病原菌生長較好。病原菌菌絲致死溫度為42 ℃ 10? min。

關鍵詞：月季;灰霉病;灰葡萄孢;鑒定;生物學特性

中圖分類號：S68512

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2020）02-0087-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.02.015

Pathogen identification and biological characteristic of grey mold on Rosa chinensis in Guiyang

CHENG Huanhuan1，REN Jing2，SONG Lisha1，LI Zhong1，3*

（1Agricultural College，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China; 2 Agricultural Bureau of Wudang District，Guiyang City，Guizhou Province，Guiyang，Guizhou? 550018，China; 3 Guizhou Key Laboratory of Propagation and Cultivation on Medicinal Plants，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Grey mold of China rose is the most serious fungal disease of Chinese rose in Wudang District，Guiyang City Tissue isolation and pathogenicity determination were used to isolated a pathogenic strain that caused grey mold Morphological characteristics observation and multi-locus phylogenetic analyses o fRPB2 HSP60 and G3PDH polygenic sequence analysis showed that the pathogen was Botrytis cinereaThe results of biological characteristics of B cinerea showed that PDA was the optimal medium for the growth of the pathogen; the optimal sources of carbon and nitrogen for the growth of hyphae were glucose and ammonium nitrate; the optimum growth temperature was 20 ℃; the optimal pH was 6; the growth of mycelia of pathogenic bacteria was significantly different by light The pathogen grew better under the condition of 12 h alternating light and darkThe lethal temperature for the mycelial of Bcinerea was 42 ℃ for 10 min

Keywords：Rosa chinensis Jacq; grey mold; Botrytis cinerea; identification; biological characteristic

月季（Rosa chinensis Jacq），又名“月月紅”，為常綠、半常綠低矮灌木，是我國傳統(tǒng)名花之一[1]，四季均可開花。花色一般為紅色和粉色，偶有白色和黃色，既是觀賞類植物，也作為藥用類植物[2]。因其花色多樣，花期較長，株型多變，有較強的生態(tài)適應性，在綠化、美化環(huán)境、家居裝飾等多個領域都有較好的應用前景和較高的觀賞價值，是享譽國內外的重要花卉，素有“花中皇后”之稱[35]。近年來，貴陽市廣泛種植月季，但在種植過程中因氣候條件和栽培方式存在差異，導致月季白粉病、灰霉病、霜霉病等主要病害的大量發(fā)生而降低花的質量[67]。

灰霉病是月季最常見的病害之一[8]，可導致月季葉片產生褐色斑點，最終葉片褐變枯死，嚴重的會致使一些枝條甚至整個植株枯死，灰霉病菌的感染嚴重降低了月季的觀賞性和經濟價值。本研究在貴陽市烏當區(qū)月季種植區(qū)采集具有典型月季灰霉病病害的標本，并對其發(fā)病花瓣進行病原菌的分離純化、形態(tài)學和分子生物學鑒定及生物學特性測定，為今后研究該病害的流行規(guī)律和防治方法提供依據(jù)。

1材料與方法

11病害調查及癥狀觀察

2018年10月在貴州省烏當區(qū)花園小鎮(zhèn)，采集具有月季灰霉病典型癥狀的植株，觀察并記錄病害特征。

12病原菌的分離與鑒定

121病原菌分離

采用常規(guī)組織分離法[9]，先用清水將病變花瓣洗凈，切取發(fā)病典型的月季病健交界處5 mm×5 mm 的小塊，先用75%的酒精浸潤30 s，然后用無菌水沖洗3～4次，無菌操作后將病組織置于PDA上，轉至25 ℃培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)3 d后進行病原菌的純化后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

122致病性測定

選取健康的月季植株，對花瓣進行消毒處理，打取直徑5 mm菌餅于花瓣上，同時以不接菌餅的健康植株作為對照;每處理3次重復，保濕、觀察并記錄月季花瓣發(fā)病情況[10]。

123形態(tài)學鑒定

將分離的菌株編號為RJ437，并接種于PDA平板上25 ℃恒溫光照培養(yǎng)，觀察記錄其菌落特征、產孢結構及孢子形態(tài)[6];根據(jù)菌株RJ437的形態(tài)特征初步確定其分類地位。

124分子生物學鑒定

選擇真菌DNA提取試劑盒（Biomiga Fungal gDNA Kit）提取供試菌株DNA，對灰霉病病原菌的RPB2、HSP60、G3PDH

基因序列進行擴增（表1）。PCR產物送上海生工公司測序。將測序結果在 NCBI 中進行同源性比對，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，其RPB2、HSP60、G3PDH序列已上傳至GenBank，其對應登陸號分別為MN566559、MN566560、MN566561。采用 MEGA 6系統(tǒng)發(fā)育軟件進行多重序列比對后，采用最大簡約法[11]進行分析運算，參照馬維思等人[12]的研究報道選取21個葡萄孢屬菌株（表2），構建基于RPB2、HSP60、G3PDH序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

13病原菌生物學特性研究

131不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響

參照袁月等人[13]的研究方法，將直徑為5 mm的病原菌菌餅分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（GPA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek）、淀粉瓊脂培養(yǎng)基（SA）、清水瓊脂培養(yǎng)基（WA）平板中央（d=9 cm），每處理3次重復，20 ℃恒溫光照培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

132病原菌對碳、氮源的利用

利用Czapek培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基[13]，取病原菌菌餅分別接種至以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉配制成不同碳源的固體培養(yǎng)基中央及以硝酸銨、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鈉配制成不同氮源的固體培養(yǎng)基中央，分別置于

20 ℃恒溫光照培養(yǎng)。每處理3次重復，5 d后用十字交叉法測量菌落生長直徑。

133不同溫度對病原菌菌絲生長的影響

取病原菌菌餅至滅菌處理后的PDA培養(yǎng)基平板上，分別置于5、10、15、20、25、30和35共7個溫度處理下光照培養(yǎng)。每處理3次重復，5 d后用十字交叉法測量菌落生長直徑。

134不同pH值對病原菌菌絲生長的影響

用1 mol/L 的HCL和1 mol/LNaOH緩沖液將滅菌處理后的PDA培養(yǎng)基調節(jié)pH值分別為40、50、60、70、80、90和100共7個梯度，將5 mm的菌餅置于已調節(jié)好pH值的PDA平板中央。分別置于20℃恒溫光照培養(yǎng)，每個處理3次重復。5 d后用十字交叉法測量菌落生長直徑。

135光照對病原菌菌絲生長的影響

將病原菌菌餅移至PDA平板中央，在人工氣候培養(yǎng)箱內設置24 h連續(xù)黑暗、24 h連續(xù)光照（40 W日光燈）、12 h光暗交替處理共3種光照條件，分別置于20 ℃恒溫培養(yǎng)。每處理3次重復，5 d后用十字交叉法測量菌落生長直徑。

136病原菌菌絲致死溫度測定

將病原菌菌餅接入規(guī)格為15 mm×20 mm滅菌試管中，每管10 mL無菌蒸餾水，每管接入3～5塊菌餅，分別將試管置于

30、35、40、45、50、55、60和65 ℃共8個溫度處理的恒溫水浴鍋中水浴10 min，期間緩慢搖動試管使之受熱均勻，將處理后的病原菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基平板中央，每處理重復3次，20 ℃恒溫光照培養(yǎng)5 d，觀察菌絲生長情況。視菌絲生長結果采用相同方法，將菌餅分別置于更小溫度間隔下進行更精確的測定，每處理3次重復[14]。

2結果與分析

21病害癥狀

圖1所示，該病害主要侵染月季的花、葉片和嫩枝，花萼部最容易受侵染。發(fā)病多從花瓣邊緣開始，初呈水漬狀斑痕，花瓣上出現(xiàn)小斑點，邊緣變褐色，后期花瓣變褐色腐爛萎蔫，在高濕條件下很快發(fā)展成灰褐色、稍凹陷的不規(guī)則病斑，在發(fā)病部位表面密生灰色霉層，使病部發(fā)生褐色腐爛，枝、莖桿疏水功能喪失、易折斷。發(fā)病嚴重時整株死亡。

22致病性測定

圖2所示，對月季花瓣部進行致病性測定，接種病原菌的花瓣20 ℃保濕培養(yǎng)48 h后開始表現(xiàn)病狀（圖2B），5天后花瓣全部變黃褐色枯萎腐爛（圖2C），接種發(fā)病的花瓣上再次分離得到的菌株與原接種菌株相同，證實了該菌株為致病菌。

23病原菌形態(tài)特征

圖3所示，在PDA培養(yǎng)基上20 ℃光照培養(yǎng)5 d，病原菌菌落直徑可達75～80 cm。菌落初為白色，后期漸變?yōu)闇\褐色（圖3-A、B）。氣生菌絲呈放射狀，可產生黑色菌核，圓形到長圓形，常交織形成不規(guī)則形狀，表面覆有菌絲，直徑 20～4 2 mm;分生孢子梗較細長、簇生，略帶灰色至褐色，頂端分枝，末端膨大近球形，上有小梗，著生大量分生孢子，呈葡萄穗狀（圖3-C、D）; 分生孢子單胞，橢圓或卵圓形，無色，末端稍突，大小為 63～107 μm× 6 0～92 μm（圖3-E、）;結合病害癥狀、病原形態(tài)，將其初步鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

24病原菌的分子生物學鑒定

基于供試菌株的RPB

2、HSP60、G

3PDH基因序列構建聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。菌株RJ437與Botrytis cinerea SAS405聚集成一支，且支持率達100%。能與其它種明顯區(qū)分開。結合菌株形態(tài)學特征，將病原菌RJ437鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

25病原菌生物學特性研究

251培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響

表3所示，病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長直徑最大，其菌落直徑為7441 mm;其次為PSA、GPA、SA、Czapek培養(yǎng)基，菌落直徑依次為7023 mm、6860 mm、6417 mm、5755 mm;WA培養(yǎng)基最不利于病原菌生長。且菌落直徑最小為2386 mm。表明PDA培養(yǎng)基為該菌生長的最適培養(yǎng)基。

252病原菌對碳、氮源的利用

如表4所示，病原菌能利用多種碳源和氮源。在供試碳源中，病原菌20 ℃恒溫光照培養(yǎng)5 d均能生長，對葡萄糖利用最好，菌落直徑為7356 mm;其次為果糖，菌落直徑為6847 mm;蔗糖和麥芽糖對菌絲生長的影響無明顯差異（4968 mm、4633 mm）;病原菌對可溶性淀粉的利用最差，菌落直徑為3583 mm。在氮源的利用試驗中，病原菌對硝酸銨的利用最好，菌落直徑為7500 mm;其次為硫酸銨和硝酸鈉，菌落直徑分別為6653 mm和6285 mm;對蛋白胨的利用效果次于硫酸銨，菌落直徑為4363 mm;對尿素的利用效果最差，菌落直徑為1916 mm。

253不同溫度對病原菌菌絲生長的影響

表5所示，在10～30 ℃灰葡萄孢菌絲均可生長，最適溫度為20 ℃，菌落直徑為7340 mm。其次為25 ℃和15 ℃時，菌落直徑分別為6516 mm、5950 mm;不同溫度條件下菌落擴展的速度不同，培養(yǎng)溫度較低（10 ℃以下）時

，生長慢甚至不生長;培養(yǎng)溫度較高（30 ℃）時，生長菌絲長勢弱，生長速度慢，生長直徑為953 mm?；移咸焰呔涑跗跒榘咨跍囟炔贿m宜時，培養(yǎng)基基部會出現(xiàn)黑色小菌核，菌落生長緩慢且菌落很快變?yōu)榛液稚?/p>

254不同pH值對病原菌菌絲生長的影響

如表6所示，菌株在pH 4～10范圍內均可生長，不同pH值下的菌落生長情況明顯不同。5 d時pH值為6的處理菌落生長勢較為明顯，其菌落直徑為7225 mm，其次為pH值5和7，其菌落直徑分別為6613 mm、5933 mm，pH值4、8、9、10次之，其菌落直徑分別為4673 mm、4152 mm、2776 mm、850 mm，說明灰霉病菌對在不同pH值條件下的適應性較強。

255不同光照對病原菌菌絲生長的影響

表7所示，病原菌在24 h持續(xù)光照、24 h持續(xù)黑暗、12 h光暗交替處理條件下，菌落平均直徑分別為7213、6742、

7657 mm。其中光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）處理的菌落直徑最大，這說明光暗交替處理為病原菌最適光照條件。

256病原菌菌絲致死溫度

病原菌在水溫30～40 ℃經10 min處理的菌餅在PDA培養(yǎng)基上均能繼續(xù)生長，但在45～65 ℃ 10 min處理的菌絲不再生長。然后將菌塊分別置于40～45 ℃的恒溫水浴處理10 min （溫度梯度為1 ℃） ，表明該菌菌絲的致死溫度是42 ℃、10 min。

3結論與討論

本研究從月季花瓣中分離獲得菌株RJ437，通過對其進行致病性測定和形態(tài)學特征及RPB2、HSP60、G3PDH聯(lián)合基因序列分析，將引起貴陽市烏當區(qū)月季灰霉病的病原菌鑒定為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）?；移咸焰撸˙ cinerea）是一種較為常見的病原菌，可引起多種觀賞植物的灰霉病病害，如張蕾等[15]報道的灰葡萄孢可引起仙客來的灰霉病;杜艷麗等[16]報道的灰葡萄孢可引起百合的灰霉病，與本研究引起月季灰霉病的病原菌結果一致。目前，國內關于月季的研究報道在栽培技術、觀賞性狀及病害的調查防治等方面較多[1719]，而針對貴陽市引起月季灰霉病病原菌的鑒定及生物學特性的研究未見報道。

生物學特性研究結果表明：月季灰霉病的病原菌灰葡萄孢（Bcinerea）生長最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基;最適碳氮源分別為葡萄糖和硝酸銨;菌絲生長最適溫度為20 ℃，最適pH值為6;不同光照處理對病原菌菌絲生長的影響差異顯著，12 h光暗交替處理為病原菌最適光照條件，菌絲體致死溫度是42 ℃10 min。盧燕回等[20]研究報道的煙草灰霉病致病菌灰葡萄孢的最適碳源為葡萄糖，最適生長溫度為20 ℃，最適pH為6;戴啟東[21]報道的藍莓灰霉病致病菌灰葡萄孢的最適氮源為硝酸銨，最適生長溫度為20 ℃，最適pH為6;與本試驗的結論基本一致。杜艷麗等[16]報道的百合灰霉病病原菌灰葡萄孢的適培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基，最適氮源為牛肉膏;李聰麗等[22]報道的香蔥灰霉病病原菌灰葡萄孢最適碳氮源分別為可溶性淀粉、酵母粉，菌絲致死溫度是52 ℃（10 min） ;與本研究結果不一致，可能與寄主、地區(qū)氣候海拔等因素不同以及選擇的供試碳氮源不同而存在差異。

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