冷凍電鏡的“跨界大咖秀”

李明麗

2020年年初肆虐的“新冠肺炎”疫情對人民健康水平和經濟發(fā)展，都帶來極大影響。疫情發(fā)生后，解析病毒結構、研發(fā)疫苗進展，這些原本“學術味”十足的關鍵詞，也成了普通老百姓十分關心的話題。

2020年6月份，Science雜志發(fā)表西湖大學周強團隊最新研究成果：他們利用冷凍電鏡技術，解析了新冠病毒S蛋白與中和抗體4A8復合物的結構，為靶向S蛋白N端結構域的藥物設計和治療策略提供了基礎。該抗體是由陳薇院士團隊從新冠肺炎康復病人的免疫細胞中篩選和鑒定的，具有強病毒中和能力。這一結果早在5月份第一時間向全社會公開。此前，周強團隊已分別解析了新冠病毒受體ACE2全長蛋白、S蛋白受體結合結構域與ACE2全長蛋白復合物的近原子分辨率三維結構，并第一時間向全社會公開，隨后在3月份被Science雜志刊登封面文章報道。值得注意的是，這些結構解析所依托的冷凍電鏡數(shù)據，全部通過一套自動化系統(tǒng)所采集。

看清病毒結構，為藥物設計提供有力幫助，而解密這些結構，則離不開冷凍電鏡平臺。這項對生命科學、醫(yī)學、藥學乃至物理化學的研究都有重大意義的平臺技術，目前在全世界范圍內快速增長。帶著諸多疑問，記者走訪了清華大學生命科學學院研究員、國家蛋白質科學研究（北京）設施清華大學冷凍電鏡平臺總管、中國冷凍電鏡杰出貢獻獎獲得者，也是上述自動化系統(tǒng)的開發(fā)者——雷建林，聽他介紹冷凍電鏡的“跨界大咖秀”。

冷凍電鏡是怎樣為生物學研究推波助瀾的？

“冷凍電鏡技術，顧名思義，就是應用冷凍固定術在低溫下使用透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）觀察樣品的顯微技術，是一種結構生物學技術。為什么要在冷凍條件下觀察呢？這是因為生物樣品中的生物大分子不耐輻照且含水，如果直接將溶液上的蛋白放在電鏡上觀察，會破壞其精細結構。這個時候，可以將生物大分子溶液置于電鏡載網上形成非常薄的水膜，吸掉多余溶液后快速冷凍形成一層玻璃態(tài)的冰，再放到冷凍電鏡上觀察。這樣做，一方面不會破壞電鏡的高真空，另一方面更接近生物大分子的生理狀態(tài)。”雷建林開門見山地介紹。

回溯歷史，冷凍電鏡樣品制備技術的嘗試始于20世紀70年代，至1982年開發(fā)出真正成熟可用的快速冷凍制樣技術。伴隨著的是冷凍電鏡各種結構解析技術的日漸成熟，包括電子晶體學、單顆粒分析、電子斷層術以及近年發(fā)展起來的微晶衍射技術。一直以來，在X射線晶體學、核磁共振和冷凍電鏡三大結構生物學手段中，冷凍電鏡是最弱的一項，但是已到了萬事俱備只欠東風的階段。具有標志性意義的事件是直接電子探測器成功開發(fā)并應用于冷凍電鏡。2013年年底，加州大學舊金山分校程亦凡研究組和David Julius研究組合作首次利用直接電子探測器K2相機和冷凍電鏡單顆粒技術解析了TRPV1膜蛋白3.4埃近原子分辨率結構。冷凍電鏡硬件的突破掀起了結構生物學領域的一場風暴，以往依托傳統(tǒng)X射線晶體學長期無法解決的許多重要大分子復合體及膜蛋白的近原子分辨率結構，被各個擊破。

2020年5月下旬，冷凍電鏡單顆粒技術再次打破分辨率紀錄。有兩個課題組分別利用冷凍電鏡新硬件，如冷場電子槍+能量過濾+新型相機、單色器+新型球差校正裝置，將去鐵蛋白的結構解析分辨率分別推進到1.2埃和1.25埃，達到真正的單個原子水平。“這無疑會繼續(xù)將這一風暴延續(xù)下去?！崩捉纸榻B。

雷建林表示，依托冷凍電鏡技術的發(fā)展，人類對細胞內的生命活動有了更多的了解；而隨著冷凍電鏡技術的不斷發(fā)展，假以時日，科學家亦將實現(xiàn)對復雜生命體的更多解讀。

冷門學科是怎樣實現(xiàn)“從0到1”突破的？

對于雷建林來說，是勤奮和機緣讓他一次又一次地把握住了機會，并一以貫之地在材料電鏡和冷凍電鏡方面不斷鉆研。而他的學習、工作經歷，則是冷凍電鏡技術人才培養(yǎng)和平臺從“從0到1”籌建歷程的典型。

從1989年本科進入武漢大學物理系，到1998年獲得武漢大學博士學位，并進入中國科學院物理研究所從事博士后工作，十年寒窗為雷建林打下了堅實的科研基礎。

自20世紀90年代中期開始，雷建林就以材料電鏡為主要手段開展工作，先后師從王仁卉先生和郭可信先生，開始從事準晶熱漫散射的定量電子顯微學研究?！巴跸壬鷾Y博的學識和嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度，讓我受益至今；而轉向冷凍電鏡領域的研究，則受郭先生影響頗深?！崩捉纸榻B。

1999年11月到2000年1月，在德國慕尼黑大學3個月短期訪問學者的經歷，更是讓雷建林拓展了視野，拓寬了科研思路，也為他后來的冷凍電鏡研究打通了“任督二脈”。

2000年起，雷建林的科研工作轉向冷凍電鏡領域。當時，這個研究方向尚屬冷門，他先后在美國紐約州衛(wèi)生部沃茲沃斯中心及美國哥倫比亞大學跟隨冷凍電鏡的先驅及單顆粒算法的首創(chuàng)和實現(xiàn)者、2017年諾貝爾化學獎得主Joachim Frank教授進行冷凍電鏡的技術研發(fā)工作。

2008年年中，清華大學決定建設新的結構生物學實驗平臺。于是，在雷建林等人的協(xié)助下，清華大學購置了亞洲第一臺Titan Krios冷凍電鏡。同年11月，雷建林回國到正在籌建的清華大學冷凍電鏡平臺上任主管。

而這臺于2009年3月9日到貨服役的設備，也為平臺的建設和依托平臺的科研工作做出了重大貢獻。“它在開展單顆粒分析、電子斷層成像等三維結構的研究方面有著突出的優(yōu)勢，能夠解析蛋白復合物的近原子分辨率結構以及亞細胞器甚至整個細胞的三維結構。”雷建林介紹。

作為全面負責平臺管理與運行的總管，雷建林也和這臺設備一起，經歷了清華大學冷凍電鏡平臺逐步壯大的全過程。硬件過硬，效率夠高，短短數(shù)年，平臺已發(fā)展成全世界最頂尖的冷凍電鏡平臺之一。如今，平臺已有10臺冷凍透射電鏡包括4臺最高端的Titan Krios電鏡，還有2臺雙束顯微鏡、關聯(lián)顯微鏡及和全套相關的輔助設備等。

可以說，平臺的飛速發(fā)展，與清華大學“既支持又不干涉”的方式分不開；而不斷提高的效率，則與平臺團隊的精細管理息息相關。作為科研工作的重要設施，申請使用的課題項目很多，僅校內需求便已呈供不應求之勢。為此，清華大學成立了專門的委員會以評審申請課題，經過審議決定后，再為課題組分配電鏡的使用時間。“我們有一套日常的規(guī)章制度，每一臺設備都有非常嚴格的使用須知，這樣就保證了設備盡可能在一個比較好的狀態(tài)下運行。同時，因為我們的設備是7×24小時對外服務的，全年無休，針對此，還有一套激勵機制，鼓勵平臺人員及時為用戶解決問題，多做研究，多出成果?！?img src="https://cimg.fx361.com/images/2021/03/05/qkimageskezxkezx202008kezx20200815-2-l.jpg"/>

近年來，雷建林還全面負責西湖大學冷凍電鏡平臺的建設，并為國內眾多冷凍電鏡平臺的建設提供了幫助和建議，助推了我國冷凍電鏡的推廣和發(fā)展。

2014年之前，國內最高端的冷凍電鏡還只有3臺。從2014年開始，國內外均涌起冷凍電鏡的購買熱潮。國內很多單位以清華模式為標準陸續(xù)建設自己的冷凍電鏡平臺。據初步統(tǒng)計，到2020年年底，國內安裝好的和已經下訂單采購的冷凍電鏡平臺中，最高端的冷凍電鏡預計將達40臺。

“這7年時間，伴隨著冷凍電鏡技術的突飛猛進，冷凍電鏡平臺的建設也遍地開花，這有其合理性，但也有不少非理性的因素?！崩捉指袊@。

“每天節(jié)省上萬元折舊費”的系統(tǒng)能做什么？

冷凍電鏡的目標是將結構的解析提高到原子分辨率水平，通常需要通宵達旦收集數(shù)天乃至數(shù)十天以獲得幾千數(shù)萬乃至數(shù)十萬張電鏡照片，如此大規(guī)模的數(shù)據靠傳統(tǒng)的手動采集非常不現(xiàn)實，一方面耗時費力，另一方面效率低下，這實際上已經成為阻礙當前高分辨率的冷凍電鏡結構解析的主要瓶頸之一。生物樣品普遍具有一定的結構柔性，只有數(shù)據量足夠大，才能保證結構的有效性。解決這一問題的有效途徑就是開發(fā)高通量、全自動化的冷凍電鏡數(shù)據采集系統(tǒng)。

近年來，雷建林先后作為課題負責人和項目骨干，獲得國家重點基礎研究發(fā)展計劃和國家重點研發(fā)計劃的資助。他開發(fā)的自動化電鏡數(shù)據采集技術和各種電鏡優(yōu)化技術廣泛應用于冷凍電鏡平臺，極大地提高了設備的使用效率。

雷建林獨立發(fā)展的高通量自動化冷凍電鏡單顆粒數(shù)據收集系統(tǒng)AutoEMation最初只適用于Tecnai系列電鏡，隨著清華大學引進Titan Krios，2010年擴展至Titan系列電鏡。隨著直接電子探測器的引入，2016年擴展至直接電子探測器。系統(tǒng)還可根據用戶的特殊需要提供深度定制開發(fā)，獲得了大量的使用。“早在10多年前還在CCD相機時代，我們用移動電子束的方法取代移動樣品臺的方法，實現(xiàn)了在同一個孔內拍多張照片，從而極大地提高了數(shù)據采集效率。到了直接電子探測器K2時期，由于最大的瓶頸是相機數(shù)據的吐出速度，移動電子束的方法對效率的提升不夠顯著。到了K3時期，隨著相機數(shù)據吐出速度的加快，移動電子束的方法能大幅提升數(shù)據采集速度。”雷建林介紹。

這套系統(tǒng)不僅數(shù)據獲取效率高，還具有走位準確等技術創(chuàng)新點——既適合于所有類型的電鏡載網，也適用于在孔洞中位置非常不確定的樣品如病毒、微絲、微管等。

此外，這套系統(tǒng)使用靈活，設置簡單?！安还庵С秩詣硬杉?，也支持半自動收集，后者極大方便了用戶快速檢查樣品；簡化并自動精確設置低劑量（low dose）成像條件；可選擇用物鏡（objective lens）或樣品臺（stage）設置離焦量（defocus），后者特別適用于球差電鏡，同時還巧妙地解決了既要盡量保持樣品臺Z軸不動以減少Z方向motion，又要利用樣品臺Z軸來設置defocus范圍之間的矛盾；數(shù)據采集過程中能自動校正能量過濾系統(tǒng)的零峰?！碧崞鹣到y(tǒng)功能，雷建林滔滔不絕。

值得關注的是，這套系統(tǒng)支持傾轉樣品的自動化數(shù)據采集。核孔復合物（Nuclear Pore Complex，NPC）被認為是結構生物學的圣杯之一。施一公團隊最新用單顆粒技術發(fā)表的高分辨率的NPC結構，就是用這套系統(tǒng)的傾轉功能采集的數(shù)據。此外，它還支持相位板數(shù)據的自動化采集。王宏偉團隊發(fā)表了分子量52千道爾頓的鏈霉親和素蛋白的3.2埃分辨率冷凍電鏡單顆粒三維重構，創(chuàng)造了利用冷凍電鏡單顆粒方法解析至近原子分辨率生物大分子分子量最小的紀錄，就是用這套系統(tǒng)的該功能采集的。

在自動化采集技術銜接空白期的那段時間里，只能使用人工采集數(shù)據，需要三班倒“蹲守”在操作臺邊，而且操作繁瑣、效率低下，操作人員也異常疲倦。而通過這套系統(tǒng)的應用，不僅大幅提高了電鏡的有效機時和單位機時的效率，同時還簡化了數(shù)據收集門檻，“用戶經過相關的培訓后，不需要掌握更多的技術也可以自己獨立完成相應的應用。用戶不再需要三班倒，晚上可以睡覺，白天可以繼續(xù)做其他的工作”。

單臺冷凍電鏡設備的價格都是數(shù)千萬元級別的。如此昂貴的設備，效率的提升等同于發(fā)揮了社會和經濟效益。雷建林介紹：“如果工作效率提高一倍，等于每臺高端電鏡每天光折舊費就可節(jié)省上萬元，這還不包括效率提升在科研方面創(chuàng)造的社會效益?！?/p>

“接下來最重要的還是繼續(xù)完善各種自動化技術?！崩捉謱ξ磥碛兄篮玫脑妇?，他預期隨著冷凍電鏡技術的再發(fā)展和突破，冷凍電鏡的發(fā)展方向應該是直接做原位研究。雖然實現(xiàn)起來困難重重，但是技術一旦突破，將為科研工作帶來更多利好。

高光頻現(xiàn)的平臺上都誕生了什么？

2017年10月4日，瑞典皇家科學院宣布將2017年諾貝爾化學獎頒給對冷凍電鏡技術發(fā)展做出原創(chuàng)性貢獻的3位學者，其中包括雷建林的合作導師Joachim Frank。此舉被業(yè)界戲稱為“一個發(fā)給了物理學家的諾貝爾化學獎，以獎勵他們幫助了生物學家”，傳為佳話。從這項“跨界”大獎上，亦足見冷凍電鏡技術在多學科應用中的重要地位。

其實，在冷凍電鏡研究領域，清華大學根基深厚。這與多位院士的推動分不開。在國家蛋白質科學研究基礎設施立項過程中，施一公院士聯(lián)合王志新、隋森芳兩位院士在清華大學基地計劃的約10個平臺中選定已經起步的冷凍電鏡平臺作為重點建設方向。2011年，王宏偉教授入職清華大學領銜清華大學基地建設。

伴隨著冷凍電鏡技術的異軍突起，清華大學冷凍電鏡平臺高光頻現(xiàn)，連續(xù)多年誕生突破性重大科研進展：

在2019年度中國生命科學十大進展中，有兩大進展離不開這個平臺。

其一是“植物抗病小體的結構與功能研究”，由清華大學柴繼杰組、中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所周儉民組和清華大學王宏偉組合作完成，解析了抗病蛋白ZAR1多個狀態(tài)復合物三維結構。

其二是“破解硅藻光合膜蛋白超分子結構和功能之謎”。同時還入選了該年度的中國科學十大進展。中國科學院植物研究所沈建仁、匡廷云組在國際上首次用X射線晶體學解析了硅藻捕光天線膜蛋白（FCP） 1.8埃的高分辨率結構，并進一步與清華大學隋森芳組合作用冷凍電鏡解析了硅藻光系統(tǒng)II和FCP超級復合物3.0埃的結構。

此前，施一公組在“揭示RNA剪接的關鍵分子機制”等方面的工作，入選2016年度中國科學十大進展，他本人獲得2017年未來科學大獎生命科學獎，以表彰他在解析真核信使RNA剪接體結構和揭示其機理的重大貢獻；顏寧組完成的“肌肉興奮-收縮偶聯(lián)的分子機理探索”，入選2016年度中國高等學校十大科技進展；楊茂君組在“線粒體呼吸鏈超級復合物的結構與功能”的工作，入選2016年度中國生命科學十大進展……

令人驚嘆的是，上述這些成果的冷凍電鏡結構解析數(shù)據全部采集于清華大學冷凍電鏡平臺，絕大部分由雷建林獨立開發(fā)的自動化系統(tǒng)收集完成?？梢哉f，清華大學冷凍電鏡平臺的高光頻現(xiàn)，也得益于雷建林的管理和開發(fā)的技術。

截至2020年5月，依托清華大學冷凍電鏡平臺，已有超過50篇以冷凍電鏡為主要手段的研究論文發(fā)表于Nature、Science、Cell三大國際頂級期刊上。平臺成為業(yè)內標桿的同時，因其平臺建設管理和技術研發(fā)的貢獻，雷建林個人也榮獲了第一屆“中國冷凍電鏡杰出貢獻獎”。

在這片孕育科學奇跡的神奇土壤里，雷建林還在不停播種并守望著更加絢爛的未來。

專家簡介

雷建林，清華大學生命科學學院研究員，國家蛋白質科學研究（北京）設施清華大學冷凍電鏡平臺總管。

從20世紀90年代中期開始以材料電鏡為主要手段開展工作，先后師從王仁卉先生和郭可信先生從事準晶熱漫散射的定量電子顯微學研究。1999年年末和2000年年初在德國慕尼黑大學做短期訪問學者。2000年轉向冷凍電鏡領域，跟隨冷凍電鏡的先驅、2017年諾貝爾化學獎得主Joachim Frank教授進行冷凍電鏡的技術研發(fā)工作。2008年11月回國任籌建的清華大學冷凍電鏡平臺主管，歷經了清華大學冷凍電鏡平臺逐步壯大的全過程。目前平臺有10臺透射電鏡包括4臺最高端的Titan Krios電鏡，還有2臺雙束顯微鏡、關聯(lián)顯微鏡及和全套相關的輔助設備等。2017年榮獲第一屆中國冷凍電鏡杰出貢獻獎。迄今已有60多篇高質量SCI論文的全部冷凍電鏡數(shù)據都是由他獨立開發(fā)的自動化系統(tǒng)收集完成，其中CNS論文超過30篇。

助推清華大學冷凍電鏡平臺發(fā)展成全世界最頂尖的冷凍電鏡平臺之一。近年還全面負責西湖大學冷凍電鏡平臺的建設。新冠肺炎疫情發(fā)生后，西湖大學解析的新冠病毒結構的冷凍電鏡數(shù)據全部是用雷建林所開發(fā)的自動化系統(tǒng)采集的。